专利名称：一种癌症治疗用人源化单克隆抗体及其制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，特别是涉及了一种人源化抗体及其制备方法及其在癌症治疗上的应用，本发明的抗体与B2M结合并显示出在体内外高效杀伤肿瘤细胞的作用。
背景技术：
β 2微球蛋白(β 2-microglobulin, B2M)是主要组织相容性复合物(MHC) I类分子的组成成份。B2M是一种由100个氨基酸组成的11. 6KDa非糖基化的多肽。其主要功能是与MHC I类分子α链三聚体相互作用并稳定该分子。因为Β2Μ与α链非共价结合并且与细胞膜没有直接接触，所以，在细胞表面的Β2Μ可以与游离的Β2Μ自由交换。在生理条件下，由细胞内释放的游离的Β2Μ可以存在于体液中。许多血液性恶性肿瘤(包括淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤)中可以观察到血清Β2Μ水平显著升高，并且均预后不良。这些现象揭示在这些恶性肿瘤中Β2Μ可能具有重要的作用。我们及其他实验室均发现抗Β2Μ单克隆抗体对披风细胞淋巴瘤细胞和其它血液性肿瘤细胞具有非常显著的细胞凋亡效应，并在体外和动物模型中证实Β2Μ特异性单克隆抗体具有高效杀伤肿瘤的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种癌症治疗用人源化单克隆抗体及其制备及应用。本发明公开内容提供了包含新的抗原结合片段的抗-Β2Μ抗体。本发明抗-Β2Μ抗体能够(a)特异性结合于细胞表面的B2M ； (b)特异性结合于游离的B2M。此外，依赖于使用方法和期望效果，所述抗体可用于在体内外抑制并杀伤肿瘤细胞。所述抗体的非限制性举例说明性实施方案有B2M-1D8和B2M-2F6。其它实施方案包括B2M-1D8和B2M-2F6中Fv片段的Vh和/或\结构域。更多的实施方案包括这些Vh和 Vl结构域中任一个的一个或多个互补决定区(CDR)。另外，抗-B2M抗体可在诊断上用于检测生物学样品中的B2M或其片断。所检测的 B2M的量可能与B2M的表达水平有关，其次又与受试者中肿瘤或其它疾病的发生或不良事件有关。本发明公开内容提供了分离的核酸，其包含编码来自B2M-1D8和B2M-2F6的Fv片段的Vh和/或\结构域的序列。同样提供的有这样的分离核酸，包含编码来自本发明公开的Fv片段的Vh或\结构域中任一个的一个或多个⑶R。本发明公开内容也包含此类核酸的载体和宿主细胞。本发明公开内容还提供了生产新的V1^P \结构域和/或功能性抗体的方法，所述功能性抗体包括衍生自B2M-1D8和B2M-2F6的Vh或\结构域的此类结构域的全部或一部分。本发明公开内容的另外方面将在下面的说明中部分阐述，并且部分地将会由于所述说明而显而易见，或者可通过实施本发明而了解。本发明示于所附的权利要求书中并在其中特别指出，且本发明公开内容不应当解释为以任何方式限制权利要求的范围。以下详述包括本发明多种实施方案的例示性代表， 它们并非用于限制所请求保护的发明。附图
构成本说明的一部分，并且，连同所述说明，仅用于举例说明多种实施方案而非限制本发明。引述参考文献并非认可这些参考文献是本发明的现有技术。下面对发明进行详细说明(一)定义如本发明公开内容所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段或衍生物，并且涵盖包含抗原结合位点的任何多肽，而不论其是在体外或是在体内生产的。该术语包括但不限于多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂交的、突变的以及移植的抗体。除非如“完整抗体”中那样由术语“完整”另行修饰，为了本发明公开内容的目的，术语“抗体”也包括抗体片段如Fab、F(ab' )2、 Fv、SCFv、Fd、dAb，以及保留抗原结合功能即特异性结合B2M能力的其它抗体片段。一般地， 此类片段将包含抗原结合结构域。术语“抗原结合结构域”、“抗原结合片段”以及“结合片段”是指抗体分子的一部分，其包含负责抗体和抗原之间特异性结合的氨基酸。在抗原大的情况下，抗原结合结构域可能仅与抗原的一部分结合。抗原分子中负责与抗原结合结构域特异性相互作用的部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。抗原结合结构域一般地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)，不过， 它并非必需两者都包含。例如，所谓的Fd抗体片段仅由VH结构域组成，但仍保留了完整抗体的一些抗原结合功能。术语“所有组成成分(r印ertoire) ”是指遗传上多样性的核苷酸集合，其全部或部分地衍生自编码所表达的免疫球蛋白的序列。所述序列是通过例如H链的V、D和J区段以及例如L链的V和J区段的体内重排产生的。备选地，部分或所有序列可通过核苷酸合成、 随机诱变以及其它方法，如美国专利No5565332中所公开的那样，通过将未重排的V区段与 D区段组合而获得。术语“特异性相互作用，，和“特异性结合”是指两分子形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合以高亲和力以及低浓度到中浓度的结合量为特征，这有别于通常具有低亲和力与中度到高度的结合量的非特异性结合。一般地，当亲和常数KA高于106M-1或更优选高于108M-1时，认为结合是特异性的。如必要，可通过改变结合条件降低非特异性结合而基本上不影响特异性结合。熟练技术人员可利用常规技术优化合适的结合条件，如抗体的浓度、溶液的离子强度、温度、允许结合的时间、封闭剂(如血清清蛋白、乳酪蛋白) 的浓度等。举例说明的条件示于实施例1、2、4、6和7中。短语“基本上如.......中所示”意味着本发明相关的⑶R、VH或VL结构域在指
定区域(如CDR)上与所示序列完全相同或者仅具有重要的区别。不重要的区别包括次要的氨基酸变化，例如在指定区域的序列中取代任意5个氨基酸中的1个或2个。术语“治疗”和“治疗方法”既指治疗性治疗又指预防性措施。需要治疗的那些个体可包括早已患有特殊医学紊乱的个体，以及可能最终患有所述紊乱的那些个体(即需要预防性措施的那些个体)。术语“分离的”是指基本上脱离其天然环境的分子。例如，分离的蛋白基本上不含
4来自得到它的细胞或组织源的细胞材料或其它蛋白。术语“分离的”也指其中分离得到的蛋白足够纯以至于能够作为药物组合物施用的制剂，或者至少70-80% (W/W)纯，更优选至少80-90% (W/W)纯，甚至更优选90-95%纯，并且最优选至少95%、96%、97%、98%、99% 或 100% (W/W)纯。(二)抗-B2M-抗体本发明公开内容提供了包含新型抗原结合片段的抗-B2M-抗体。一般而言，例如，可利用传统的杂交瘤技术(Kohler和Milstein (1975)Nature， 256 :495-499)、重组DNA方法(美国专利No. 4816567)或由抗体文库实施的噬菌体展示 (Clackson 等(1991) Nature, 352 :624-628 ；Marks 等(1991) J. Mol. Biol.，222 :581-597)制备抗体。关于其它抗体生产技术,也参见Antibodies =A Laboratory Manual ,Harlow等编， ColdSpring Harbor Laboratory，1988。本发明不局限于任何特定的来源、起源物种、生产方法。完整抗体，也称为免疫球蛋白，一般是四聚体糖基化蛋白，由两条大约各25KDa的轻(L)链以及两条大约各50KDa的重(H)链组成。抗体中发现了两类轻链，命名为λ链和 κ链。依赖于重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可分配为5大类A、D、E、G和Μ， 并且其中有数种可进一步划分为亚类(同种型)，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。不同类型免疫球蛋白的亚基结构和三维构象是本领域众所周知的。关于抗体结构的综述，见Harlow等(同前)。简言之，每条轻链由N-末端可变结构域和恒定结构域 (Cl)组成。每条重链由N-末端可变结构域(Vh)、三到四个恒定结构域(Ch)、以及铰链区组成。最接近于VhWCh结构域被命名。V1^n (^结构域由四个相对保守序列的区域组成，称为构架区(FR1、FR2、FR3和FR4)，它们构成三个高变序列区的支架，所述高变序列区域称为互补决定区(CDR)。CDR含有大多数负责与抗原特异性相互作用的残基。三个CDR 被称为⑶R1、⑶R2和⑶R3。重链上的CDR组分被分为H1、H2和H3，而轻链上的CDR组分被相应地称为Li、L2和L3。CDR3，并且特别是H3，是抗原结合结构域内分子多样性的最大来源。例如，H3可短至2个氨基酸残基或者多于沈个。Fab片段(抗原结合片段)由通过恒定区之间的二硫键共价连接的Vh-ChI和Vl-Q 结构域组成。为克服在宿主细胞中共表达时Fv中非共价连接的Vh和\结构域解离的倾向，可构建所谓的单链(sc)Fv片段(scFv)。在scFv中，柔性且足够长的多肽或者将Vh的 C-末端连接于\的N-末端，或者将\的C-末端连接于Vh的N-末端。最常见地，利用15 个残基的(Gly4Ser)3肽作为接头，但其它接头也是本领域公知的。抗体多样性是编码可变区的多个种系基因组合装配以及多种体细胞事件的结果。 体细胞事件包括V基因区段域D和J基因区段重组以制备完整Vh区，以及V和J基因区段重组以制备完整\区。重组过程本身是不精确的，导致V (D) J接合处氨基酸的丢失或添加。 这些多样化机制出现在抗原暴露之前的发育B细胞中。抗原刺激后，B细胞中表达的抗体基因经历体细胞突变。根据种系基因区段的估计数、这些区段的随机重组以及随机配对，可产生最多 1. 6xl07 个不同的抗体(Fundamental Immunology,第 3 版，Paul 编，Raven Press, New York，NY，1993)。若考虑有助于抗体多样性的其它过程(如体细胞突变)，则认为可潜在地产生 IxIOiq 以上的不同抗体(Immunoglobulin Genes，第 2版，Jonio 等编，Academic Press,San Diego, CA，19卯)。由于这许多过程参与抗体的多样性，独立产生的抗体在⑶R区将具有完全相同或者甚至基本上相似的氨基酸序列是非常不可能的。本发明公开内容提供了新的来源于人免疫球蛋白基因文库的CDR。携带CDR 的结构通常将是抗体重链或轻链或其部分，其中CDR位于对应于天然存在及八的 ⑶R的位置上。例如，免疫球蛋白可变结构域的结构和定位可如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, No. 91-3242, National Institutes of Health Publications, Bethesda, MD, 1991 中所述确定。抗-B2M-抗体、其scFv片段、VH和VL结构域及CDR的DNA和氨基酸序列示于序列表中，并如表1中说列的那样列举。抗体特别的非限制性举例说明性的实施方案被称为 B2M-1D8和B2M2F6。举例说明性实施方案的Vh和\结构域内每一个⑶R的位置列于表2。
表1 VH和VL结构域以及⑶R的DNA和氨基酸(AA)序列
权利要求
1.一种抗体，其特征在于，包含如 SEQ ID NO =USEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、或SEQ ID NO :7中所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，其包含如SEQID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、 或SEQ ID NO 8中所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中抗体与B2M的特异性结合。
4.根据权利要求1所述的抗体，其中抗体是人的。
5.根据权利要求1所述的抗体，其中抗体为IgG115
6.根据权利要求1所述的抗体，其中抗体为IgG1A或IgGlK。
7.—种药物组合方法，如试剂诊断盒其包含权利要求1的抗体。
8.一种分离的核酸，其编码权利要求1的抗体。
9.根据权利要求8所述的核酸，其中核酸编码SEQID N0:2、SEQ IDNO :4、SEQ ID NO: 6、或SEQ ID NO :8中所示的氨基酸序列。
10.一种宿主细胞，其包含权利要求1的核苷酸。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其中宿主细胞选自大肠杆菌、中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞，HEK-293和NSO细胞。
12.—种制备与B2M特异性结合的抗体的方法，该方法包括(a)提供编码可变区结构域的起始核酸所组成成分，其中可变结构域包括将要被取代的⑶R3或者缺失⑶R3编码区；(b)将所述所有组成成分与编码基本上如SEQID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、 或SEQ ID NO :8中所示的氨基酸序列的供体插入到所述所有组成成分的CDR3区，以提供编码可变结构域的核酸的产物所有组成成分；(c)表达产物所有组成成分的核酸；(d)选择特异于B2M的抗原结合片段；和(e)回收该特异性抗原结合片段或者编码该结合片段的核酸。
13.一种通过权利要求12的方法生产的抗体。
14.一种杀伤肿瘤细胞的方法，包括使肿瘤细胞与抗-B2M抗体接触。
全文摘要
本发明公开了一种人源化抗体及其制备方法及其在癌症治疗上的应用，本发明的抗体包含如SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、或SEQ ID NO7中所示的核苷酸序列。本发明的抗体与B2M结合并显示出在体内外高效杀伤肿瘤细胞的作用，所公开的组合物及方法可用于例如治疗癌症、炎症疾病、以及其它机体系统的紊乱。
文档编号G01N33/574GK102311499SQ201010221619
公开日2012年1月11日 申请日期2010年7月9日 优先权日2010年7月9日
发明者杨文荣, 杨林, 杨楠, 钱建飞 申请人:博生吉医药科技(苏州)有限公司