膀胱癌特异性配体肽的制作方法

专利名称：膀胱癌特异性配体肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含氨基酸序列X1DGRX5GF(SEQ ID NO: I)的膀胱癌特异性配体肽及其使用方法，例如，用于膀胱诊断的成像检测、用来指导膀胱癌经尿道切除术的肿瘤定位、能代替或补充昂贵的膀胱镜检查的初始治疗后随访的膀胱癌成像检测、转移性膀胱癌成像检 测以及浅表性膀胱癌和转移性膀胱癌的靶向治疗。
背景技术：
膀胱癌是男性中第4大常见癌并且是女性中第9大常见癌(Jemal, etal.，Cancer J Clin, (2008)58:71-96)。在诊断时，约75%的患者处于非侵入期(Fleming, et al. , AJCC (American Joint Committee on Cancer,美国癌症联合委员会)Cancer Staging Manuel (癌症分期手册)，第 5 版· Philadelphia: Lippincott-Raven，1997)。进行的治疗通常是膀胱肿瘤的经尿道切除术(TURBT)、然后是膀胱内滴注卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)或丝裂霉素C来减少复发。尽管存在这种疗法，但是20-80%的患者会复发，并且25%的患者的疾病会发展(Herr，et al.，J Clin Oncol, (1995) 13:1404-1408;Herr, et al. , J Urol, (1989) 141:22-29;以及 Cookson, etal. , JUrol, (1997) 158:62-67)。需要用尿细胞学和膀胱镜检查对所有这些患者进行长期随访。尿细胞学检查的灵敏度为29-74%，总体灵敏度为约35%(Eissa，et al.，Curr OpinObstet Gynecol, (2003) 15:395-403;van Rhijn, et al. , Eur Urol, (2005)47:736-748;以 Lotan, et al. , Urology, (2003)61:109-118)。膀胱镜检查是侵入性的、不舒适的且费用昂贵。由于生存期长且需要终生监测，每个膀胱癌病例的费用在所有癌症类型中是最高的，每个病例为 $96，000-$187，000(2001 年时的值)(Riley，et al. ,Med Care, (1995)33:828-841;Botteman, et al. , Pharmacoeconomics, (2003)21:1315-1330)。本发明在一定程度上基于使用组合化学技术来研发在膀胱癌的诊断、治疗和随访过程中能用于成像和靶向治疗的膀胱癌特异性配体。利用一珠一化合物(One-beadone-compound)组合妝文库技术(0B0C) (Lam, et al. , Nature, (1991) 354:82-84, 1991;和Lam, et al. , Chem Rev, (1997)97:411-448)来鉴定膀胱癌特异性配体。当实施“分开-混合(“split-mix”)”合成来构建组合文库时，产生数百万个珠(直径90 μ m)的随机文库。每个珠携带高达IO13拷贝的具有相同氨基酸序列的配体。在每一轮筛选中，可以针对特定靶标(受体、抗体、酶、病毒以及全细胞等)平行筛选数百万个文库珠(配体)。利用与Western印迹相似的酶联比色测定或通过细胞附着于珠表面的证据，可以鉴定出携带对所述靶标具有特异性的肽的阳性珠(Songyang, et al. , J Biol Chem, (1995) 270:14863-14866;和Liu, etal. , J AmChem Soc, (2002) 124:7678-7680)。可以将非天然氨基酸(即D-型氨基酸)或甚至非肽部分并入文库中来使分子能抵抗蛋白水解以及增强结合亲和力。可以进一步优化通过OBOC文库筛选而鉴定出的配体珠，从而产生具有高亲和力和特异性的癌症特异性配体(Peng, et al. , Nat Chem Biol, (2006)2:381-389)。发明概述 本发明提供了能选择性结合膀胱癌组织且最低限度地结合或不结合正常膀胱组织或非膀胱组织的肽。因此，一方面，本发明提供了包含氨基酸序列X1DGRX5GF(SEQ IDNO: I)的肽，其中X1和X5是任何氨基酸，其中肽的长度不超过10个氨基酸并能结合膀胱癌细胞。在一些实施方案中，肽的长度不超过9个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度不超过8个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度不超过7个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽不结合包括正常膀胱细胞在内的正常细胞。在相关实施方案中，本发明提供了包含氨基酸序列X1DgRX5GFGEQ ID NO: I)和第二多肽(其对于所述肽是异源的)的融合蛋白，其中X1和X5是任何氨基酸。在一些实施方案中，第二多肽是免疫球蛋白(例如IgG)的Fe部分。在一些实施方案中，第二多肽是人IgGU IgG2、IgG3和IgG4同种型的Fe区域。在一些实施方案中，第二多肽是细胞毒素。在相关实施方案中，本发明提供了包含氨基酸序列X1DgRX5GFGEQ ID NO: I)的多肽，其中X1和X5是任何氨基酸，其中多肽的长度不超过300个氨基酸，例如长度不超过250、200、150、100、75、50或25个氨基酸，且能结合膀胱癌细胞。在相关实施方案中，本发明提供了包含氨基酸序列X1DgRX5GFGEQ ID NO: I)的多肽或肽，其中i) 一个或多个氨基酸残基是D-型氨基酸；ii)所述多肽或肽在N末端、或C末端、或N末端和C末端包含保护基；iii)所述多肽或肽是全部逆反的(retro-inverso)或部分逆反的；iv)所述多肽或肽包含氨基酸序列X1DGRX5GF (SEQ ID NO: I)的2个或更多个重复，例如3、4、5、6或更多个重复；ν)所述多肽或肽是环化的；vi) 一个或多个氨基酸残基连接于类肽主链；vii) 一个或多个氨基酸残基是β氨基酸残基；或viii)所述多肽或肽是用烃钉(hydrocarbon staple)进行稳定化的。在一些实施方案中，X1是Gin、Gly或Ala (SEQ ID N0:2)。在一些实施方案中，X5是Met、Lys、Gly、Ala或Gly-Gly(SEQ ID NO: 3) 在一些实施方案中，X1 是 GlruGly 或 Ala且X5是Met、Lys、Gly、Ala或Gly-Gly(SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，所述肽具有氨基酸序列QDGRMGF(SEQ ID NO:5)。在一些实施方案中，所述肽具有氨基酸序列QDGRKGF (SEQ ID NO: 6)。在一些实施方案中，所述肽具有氨基酸序列QDGRKeGF(SEQ ID N0:7)，其中Ke指侧链连接了甘氨酸残基的赖氨酸残基。这些肽在N末端和/或C末端的侧翼任选地具有D-型半胱氨酸残基，并且任选地可以是环化的。在一些实施方案中，所述肽不结合正常的膀胱组织。在一些实施方案中，所述肽结合整联蛋白α 5 β 3。在一些实施方案中，所述肽结合整联蛋白α5β5。在一些实施方案中，所述肽在氨基末端和/羧基末端还包含1-5个侧翼氨基酸残基，例如在氨基末端和/或羧基末端还包含1、2、3、4或5个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述肽在氨基末端和/或羧基末端还包含1-5个侧翼氨基酸残基(SEQ ID N0:8)。在一些实施方案中，所述肽在氨基末端和/或羧基末端还包含2个侧翼氨基酸残基(SEQ IDNO: 9)。在一些实施方案中，所述肽具有氨基酸序列CX1DGRX5GFc (SEQ ID N0:10)，其中XjPX5是任何氨基酸，且C是D-型半胱氨酸。在一些实施方案中，所述肽是环化的。
在一些实施方案中，膀胱癌特异性肽(或其重复)可以嵌于或位于较长的多肽序列中，所述较长的多肽序列例如融合序列或另一非天然存在的多肽序列。在一些实施方案中，所述肽例如在氨基末端和/或羧基末端(例如通过化学连接或融合)与一个或多个其它多肽连接。在一些实施方案中，所述肽(例如通过化学连接或融合)与一个或多个治疗部分或可检测的标记连接。在一些实施方案中，所述肽与治疗部分连接，例如与细胞毒素、抗癌剂、放射性同位素或免疫球蛋白(“Ig”)(例如IgG)的Fe部分连接。在一些实施方案中，所述肽与人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4同种型的Fe区连接。在一些实施方案中，将抗癌剂封装于脂质体中。在一些实施方案中，所述肽与可检测的标记连接，例如与成像标记、珠、染料、突光团、化学发光部分、磁性颗粒(例如氧化铁颗粒)、金属颗粒(例如金颗粒)、放射性同位素(例如3H、32P、125I、123I、nC、13N、150、18F、82Rb、锝-99m(Tc_99m)、铊-201)连接。在相关方面，本发明提供了包含本文所述的膀胱癌特异性多肽或肽配体和药学可接受载体的组合物。在一些实施方案中，将膀胱癌特异性肽配制成纳米颗粒。在另一方面，本发明提供了检测膀胱癌是否存在的方法，包括使膀胱细胞或膀胱组织(或疑似包含膀胱癌转移的组织)与本发明的膀胱癌特异性肽接触，并测定所述肽与所述细胞或组织的结合，其中检测到所述肽与所述细胞或组织的结合指示膀胱癌或存在膀胱癌转移。膀胱癌特异性肽的实施方案如本文所述。在相关方面，本发明提供了检测膀胱癌是否存在的方法，包括使尿样中的膀胱细胞与连接于可检测的标记的本文所述膀胱癌特异性多肽或肽配体接触，并测定所述肽与所述膀胱细胞的结合，其中检测到所述肽与所述膀胱细胞的结合指示膀胱癌或存在膀胱癌转移。在一些实施方案中，所述方法还包括集中尿样中的膀胱细胞。在一些实施方案中，将膀胱癌特异性肽与标记的珠缀合。例如，可以用荧光标记、化学发光标记或量子点标记对珠进行标记。膀胱癌特异性肽的其它实施方案如本文所述。在一些实施方案中，膀胱癌特异性肽的结合的信号是可检测到的，这指示存在膀胱癌。在一些实施方案中，膀胱癌特异性肽的结合的信号是不可检测到的，这指示不存在膀胱癌。在一些实施方案中，膀胱癌特异性肽的结合的信号高于阈值，这指示存在膀胱癌。在一些实施方案中，膀胱癌特异性肽的结合的信号低于阈值，这指示不存在膀胱癌。在一些实施方案中，膀胱癌特异性肽的结合的信号大于膀胱癌特异性肽与正常对照组织(例如膀胱细胞或膀胱组织)的结合的信号，这指示存在膀胱癌。在一些实施方案中，膀胱癌特异性肽的结合的信号约等于或小于膀胱癌特异性肽与正常对照组织(例如膀胱细胞或膀胱组织)的结合的信号，这指示不存在膀胱癌。在另一方面，本发明提供了抑制、减少或阻止有需要的个体中膀胱癌细胞生长的方法，包括使膀胱癌细胞或膀胱组织(或包含膀胱癌转移的组织)与连接于治疗部分的本文所述膀胱癌特异性多肽或肽接触，其中所述肽结合膀胱癌细胞，并且所述治疗部分抑制、减少或阻止膀胱癌细胞的生长或杀伤膀胱癌细胞。膀胱癌特异性肽的实施方案如本文所述。因为膀胱癌特异性肽配体可以用于阻断、抑制、减少或阻止膀胱癌细胞的生长、迁移和转移，因此膀胱癌特异性肽配体自身也是治疗性的。因此，在相关方面，本发明提供了抑制或阻止有需要的个体中膀胱癌细胞生长的方法，包括使膀胱癌细胞或膀胱组织(或包含膀胱癌转移的组织)与本文所述的膀胱癌特异性多肽或肽接触，其中所述肽结合膀胱癌细胞并阻断、抑制、减少或阻止膀胱癌细胞的生长、迁移和转移。膀胱癌特异性肽的实施方案如本文所述在另一方面，本发明提供了原位检测组织中的膀胱癌的方法，包括使所述组织与本文所述膀胱癌特异性多肽或肽配体接触，其中所述肽结合所述组织中的膀胱癌细胞，从而原位检测所述组织中的膀胱癌细胞。组织可以位于疑似患有或已知患有膀胱癌的个体中。组织可以是膀胱组织或另一组织，例如疑似含有膀胱癌转移的另一组织。这可以用于例如对肿瘤切除进行成像或便于肿瘤切除。在一些实施方案中，所述方法还包括例如基于检测膀胱癌特异性肽配体的结合来捕获和/或记录组织中膀胱癌细胞的图像。在一些实施方案中，所述方法还包括例如基于检测膀胱癌特异性肽配体的结合来移除、切除或切掉组织的膀胱癌细胞。在一些实施方案中，膀胱癌细胞或膀胱组织是体外的。例如，在一些实施方案中，使肽与尿样中的膀胱细胞接触。在一些实施方案中，膀胱癌细胞或膀胱组织是体内的，即，位于个体内。在一些实施方案中，个体是哺乳动物，例如人、非人类灵长类或犬。在一些实施方案中，将肽以静脉内、肿瘤内或尿道内的方式给予个体。本发明还提供包含本文所述膀胱癌特异性配体的试剂盒。定义“毒性部分”是嵌合分子中使所述嵌合分子对目的细胞产生毒性的部分。术语“效应部分”或“治疗部分”指嵌合分子中意图对引导部分(即肽配体PLZ4)所靶向的细胞产生作用或意图鉴定免疫缀合物存在的部分。术语“嵌合分子”包括效应分子与本发明的膀胱癌特异性肽的共价连接的涵义。术语“细胞毒素”通常包括相思豆毒素、蓖麻毒素、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素或以上的修饰的毒素。例如,PE和DT是高毒性化合物，它们通常通过肝毒性引起死亡。然而，通过移除毒素的天然引导组分(例如PE的结构域Ia或DT的B链)并用不同的引导部分(例如抗体)取代它，可以将PE和DT修饰成可用作免疫毒素的形式。术语〃接触〃包括置于直接的物理结合。本文所用的〃多肽〃、〃肽〃以及〃蛋白〃可交换使用，并且包括氨基酸残基的多聚体的涵义。本文所用的术语“肽”以其最广泛的涵义使用，是指常规的肽(即，含有L或D-型氨基酸的短多肽)，以及保留了期望的功能活性的肽等同物、肽类似物和拟肽。肽等同物与常规肽的不同之处可以在于一个或多个氨基酸被相关有机酸(例如PABA)、氨基酸等取代，或侧链或官能团的取代或修饰。该术语适用于一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸多聚体，以及适用于天然存在的氨基酸多聚体。该术语还适用于含有保守型氨基酸取代从而能使蛋白保持功能的多聚体。
除非另外规定，术语〃肽等同物"、〃肽类似物"、〃肽模拟物〃以及〃拟肽"可交换使用。肽类似物在制药行业中通常用作性质与模板肽相似的非肽药物(Fauchere, J. (1986)Adv.Drug Res. 15:29;Veber and Freidinger(1985)TINS p.392;和Evans et al. (1987) J. Med. Chem 30:1229)。通常在计算机分子建模的辅助下研发肽类似物。在结构上与可用于治疗的肽相似的肽模拟物可用于产生等同的治疗作用或预防作用。通常，拟肽在结构上与范例多肽(即具有生物活性或药理活性的多肽，例如天然存在的受体结合多肽)相似，但是具有一个或多个任选地被选自以下的连接取代的肽键-CH2NH-、-CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(顺式和反式)、-COCH2-, -CH(OH) CH2-以及一CH2SO-,所述取代通过本领域已知的方法和在下述文献中进一步描述的方法进行Spatola, A. F. in^Chemistry and Biochemistry ofAmino Acids,Peptides, andProteins (氨基酸、妝和蛋白的化学和生物化学)，〃B. Weinstein, eds. , Marcel Dekker, NewYork, p. 267 (1983) ; Spatola, A. F. , Vega Data (March 1983), Vol. I, Issue 3，"PeptideBackbone Modifications (妝主链修饰)〃(general review(总论));Morley, J. S. , TrendsPharm Sci (1980) pp. 463-468 (general review (总论))；Hudson, D. et al. , Int J PeptProt Res (1979) 14:177-185(—CH2NH-, CH2CH2-) ; Spatola, A. F. et al. , Life Sci (1986) 38:1243-1249 (-CH2S) ; Hann, M. M. , J Chem Soc Perkin Trans I (1982) 307-314 (—CH—CH —，顺式和反式)；Almquist, R. G. et al. , J Med Chem(1980) 23:1392-1398 (—COCH2
);Jennings-White, C. et al. , Tetrahedron Lett(1982)23:2533 (—COCH2—) ;Szelke, M. etal. , European AppIn. EP 45665 (1982) CA: 97:39405 (1982) (-CH(OH) CH2-) ;Holladay, M.ff. et al. , Tetrahedron Lett (1983) 24:4401-4404(—C(OH)CH2—);和 Hruby, V. J. , LifeSci (1982) 31:189-199 (-CH2-S-)。如下述文献所述，肽主链的部分或全部也可以被构象上受限的环状烷基或芳基取代基取代，从而限制本文指定的功能氨基酸侧链的运动性I. Bondinell et al. Design of a potent and orally active nonpeptide plateletfibrinogen receptor(GPIIb/IIIa)antagonist. Bioorg Med Chem 2:897(1994). 2. Keenanet al. Discovery of potent nonpeptide vitronectin receptor(alpha v beta 3)antagonists. J Med Chem 40:2289 (1997). 3. Samanen et al. Potent, selective, orallyactive 3-oxo-l, 4-benzodiazepine GPIIb/IIIa integrin antagonists. J Med Chem39:4867(1996)。可以通过公认的方法产生本发明的肽，例如本领域公知的重组方法和合成方法。重组技术通常描述于 Sambrook, et al. , Molecular Cloning: ALaboratory Manual(分子克隆实验室手册)，(3rd ed. ) Vols. 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory, (2001)。月太合成技术是熟知的，并且包括下述文献所述的技术Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2456 (1963), Atherton, et al. , Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (固相肽合成实用方法)，IRL Press (1989)和 Merrif ield, Science 232:341-347(1986)。术语〃残基〃或〃氨基酸残基〃或〃氨基酸〃包括并入蛋白、多肽或肽(统称为“肽”)中的氨基酸的涵义。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，氨基酸可以包括能够以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥功能的天然氨基酸的已知类似物。本文涉及的氨基酸和类似物以表A中下述缩写名称描述表A :氨基酸命名名称3字母 I字母
丙氨酸AlaA
精氨酸ArgR
天冬酰胺AsnN
天冬氨酸AspD
半胱氨酸CysC
谷氨酸GluE
谷氨酰胺GlnQ
甘氨酸GlyG
组氨酸HisH
高丝氨酸Hse-
弄亮氨酸HeI
亮氨酸LeuL
赖氨酸LysK
蛋氨酸MetM
蛋氨酸亚砜 Met (O)- 蛋氨酸曱基铳Met (S-Me)-
正亮氣酸Nle-
苯丙氨酸PheF
脯氨酸ProP
丝氨酸SerS
苏氨酸ThrT
色氨酸TrpW
赖氨酸TyrY
缬氨酸ValV当描述蛋白时，“保守型取代”指蛋白的氨基酸组成的变化，所述变化不会显著改
变蛋白的活性。因此具体氨基酸序列的“保守型修饰的变异”指对蛋白活性并非关键的那
些氨基酸的取代，或用具有相似性质(例如酸性、碱性、带正电荷或带负电荷、极性或非极
性等)的其它氨基酸取代氨基酸，使得即便是关键氨基酸的取代也不会显著改变活性。提
供功能上相似的氨基酸的保守型取代表在本领域中是熟知的。表B中的下述6组中的每组
都包括彼此为保守型取代的氨基酸表B
I)丙氨酸(A)、丝氨酸⑶、苏氨酸⑴；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸⑷；5)异亮氨酸⑴、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V);以及
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。还可参阅 Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (蛋白结构和分子特性),W. H. Freeman and Company, New York (2nd Ed. , 1992)。对于肽，术语〃基本上相似〃表示肽包含在7-10个氨基酸的比较窗中与参考序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的序列。通过在比较窗比较2条最佳比对的序列来测定序列同一性百分比，其中，与用于两条序列最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗中的多核苷酸序列的部分可以包含添加或缺失(即空位)。通过以下方式计算百分比测定两条序列中都存在的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数，从而得到匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗中的总位置数并将结果乘以100，从而得到序列同一性百分比。本文所用术语〃逆反肽(retro-inverso peptide) 〃指这样的肽,其通常包含与具有L-型氨基酸的肽相同的氨基酸序列，但是其序列部分或完全由D-型氨基酸组成，因此具有与利用L-型氨基酸合成的肽相反的立体化学。通过按照逆序(即，从左到右为从C末端氨基酸到N末端氨基酸表示序列，这与对于L-型氨基酸，从N末端到C末端的书写或表示相反，参阅下文)利用D-型氨基酸构建肽，可以获得恢复了与母体L-型氨基酸肽相同的侧链立体化学的逆反肽。使用逆反肽能最小化酶促降解，因此延长了肽部分的生物半衰期。同样，这些序列可以有利地改变由正常L-型氨基酸序列制备的类似缀合物的潜在免疫原性性质。逆反序列(作为游离肽或缀合物)在需要或优选口服活性剂的应用中特别有用(由于对酶解的抗性)。对于本发明的目的而言，逆反肽以"ri"表示，并从左到右书写为从C末端氨基酸到N末端氨基酸，例如，与典型的L-型肽表示法相反。在一个实施方案中，本发明的逆反肽并入所有D型异构体氨基酸。当逆反肽并入所有D型异构体氨基酸时，其称为"D-型反向妝(reverse peptide)"。当用于描述肽时，术语〃基本上纯的〃或〃分离的〃指这样的肽，所述肽与和其天然相关联或在合成过程中相关联的蛋白或其它混杂物质是分离的。在一个实施方案中，肽或多肽构成含有肽的组合物的总多肽含量的至少50%，在一个实施方案中，构成含有肽的组合物的总肽含量的至少75%，在一个实施方案中，构成含有肽的组合物的至少90%，且在一个实施方案中，构成含有肽的组合物的至少95%。术语“缀合”、“连接(joining)”、“结合(bonding) ” 或“连接(linking) ” 指使两条多肽成为一个连续的多肽分子。对于本发明，所述术语包括将抗体部分连接于效应分子(EM)的涵义。连接可以是通过化学方式或重组方式。化学方式指抗体部分与效应分子间的反应，使得在两个分子之间形成共价键，从而形成一个分子。术语〃体内〃包括位于细胞所获自的生物体的内部的涵义。〃离体〃和“体外”表示位于细胞所获自的生物体的外部。短语“恶性细胞”或“恶性肿瘤”指侵袭性的和/或能发生转移的肿瘤或肿瘤细胞，即癌细胞。本文所用的"哺乳动物细胞"包括来源于哺乳动物的细胞的涵义，所述哺乳动物包括人、大鼠、小鼠、豚鼠、黑猩猩或猕猴。细胞可以在体内或体外培养。
对于抗原而言，术语〃选择性反应〃指配体(在此，指膀胱癌特异性肽配体)全部地或部分地与携带所述抗原的细胞或组织优先结合，且不与缺乏所述抗原的细胞或组织结合。当然，应当认识到，一定程度的非特异性相互作用可以发生于分子和非靶细胞或组织之间。尽管如此，可以以通过抗原的特异性识别介导来辨别选择性反应性。尽管选择性反应性的配体能结合抗原，但是它们结合的亲和力可能会较低。另一方面，特异性结合导致配体与携带抗原的细胞之间的结合大大强于结合配体与缺乏抗原的细胞之间的结合。特异性结合通常导致携带靶抗原的细胞或组织在结合的配体的量上(每单位时间)比缺乏靶抗原的细胞或组织增加大于2倍、优选大于5倍、更优选大于10倍且最优选大于100倍。在这类条件下与蛋白的特异性结合需要针对对具体蛋白的特异性进行选择过的配体。多种测定模式适合选择能与具体蛋白发生特异性免疫反应的配体。例如，固相测定通常用于特异性结合抗原的配体。有关测定模式和可用于确定特异性结合反应性的条件的描述，可参阅Harlow
&Lane, Antibodies, A Laboeatoey Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York(1988)。术语“阈值”是指信号(在此，指膀胱癌特异性肽与膀胱细胞或膀胱组织结合的信 号)的预定水平，高于所述水平表示结合和膀胱癌的阳性诊断，而低于所述水平表示未结合和膀胱癌的阴性诊断。信号的水平可以基于来自个体群体的测定。术语“患者”、“个体(subject) ”、“个体(individual) ”可互换地指哺乳动物，例如人或非人类灵长类、驯养的哺乳动物(例如犬或猫)、农业哺乳动物(例如牛、猪、绵羊、马)、实验室动物(小鼠、大鼠、仓鼠、兔)。术语“共同给予”指在个体的血液中同时存在两种活性剂。共同给予的活性剂可以同时递送或依次递送。术语〃有效量(effectiveamount) 〃或〃对......有效的量(amount effective
to)或"治疗有效量"指足以产生期望的结果的治疗剂剂量，所述期望的结果如抑制、减少或阻止膀胱癌细胞生长或肿瘤生长，促进膀胱肿瘤减小或消除，或阻断、减少、抑制或阻止膀胱癌生长、迁移或转移。当对于药物组合物时，术语〃有效量〃通常指实现期望目标所需的活性成分(例如本发明的肽)的量。例如，在治疗应用中，有效量是需要给予患者从而使治疗所针对的具体病症(例如膀胱癌)得到治疗的量。术语"病症的治疗"表示具体病症的症状的减少或消除。有效量通常根据病症的性质、所用的肽、给药模式和患者的体型及健康而会改变。在一个实施方案中，本发明肽的有效量对于70kg的患者为1μ g-lg肽，在一个实施方案中，为lyg-10mg。在一个实施方案中，所给予的肽(或肽类似物)的浓度为
0.1口] -101111，在一个实施方案中为5 4]\1-11111，在一个实施方案中为5 4]\1-10(^]\1，在一个实施方案中为5μΜ-40μΜ。本文所用术语“治疗(treating) ”和“治疗(treatment) ”指延迟该术语所应用的疾病或疾病状况(例如膀胱癌)或所述疾病或疾病状况的一种或多种症状的发生、阻止或逆转所述疾病或疾病状况或所述症状的进展、或缓解或预防所述疾病或疾病状况或所述症状。对于肿瘤或癌的生长或进展而言，术语“抑制”、“减少”、“降低”指利用本领域已知的任何方法将个体中的肿瘤或癌症的生长、扩散、转移抑制了可测量到的量。与共同给予本发明的肽(例如作为嵌合分子的一部分)之前的肿瘤负荷相比，如果肿瘤负荷减少至少约10%、20%、30%、50%、80%或100%，则肿瘤或癌症的生长、进展或扩散得到抑制、减少或降低。在一些实施方案中，与给予肽之前的肿瘤负荷相比，肿瘤或癌症的生长、进展或扩散被抑制、减少或降低了至少约I倍、2倍、3倍、4倍或更多倍。附图
简要说明图I.用于筛选结合膀胱癌细胞的配体的全细胞结合测定。在该测定中，将单细胞悬浮液与OBOC文库一起孵育。如果珠表面上的肽能够结合细胞表面分子，则这些珠会被细胞覆盖。在每个图的中部，一个阳性珠被膀胱癌细胞覆盖，这表示该珠上的肽能结合测试的膀胱癌细胞，而其它珠上的肽不能结合测试的细胞。孵育时间、细胞类型和文库类型显示在每幅图旁边。珠的平均直径为约90 μ m。图2A-H. PLZ4能够结合膀胱肿瘤细胞，但是不能结合正常的尿道上皮细胞或其它混杂的细胞。PLZ4结合3种膀胱TCC细胞5637 (A)、T24 (B)以及TCCSUP (C)，但是不结合正常的尿道上皮细胞(D)。图D中正常尿道上皮细胞的细胞大小的不均一性表明存在从尿道上皮的基底层(小细胞)到基底上层的细胞。利用全血细胞(E)、PBMC (F)、正常成纤维细胞(G)和来自接受BCG膀胱内治疗的有效治疗的患者的细胞(H)，在显微镜下未观察到PLZ4的结合。珠的直径为约90 μ m。图3A-E. PLZ4与人和犬膀胱癌细胞的结合。将来自新鲜切除的人膀胱癌样本的单细胞悬浮液与包被有PLZ4的珠一起孵育。利用来自人类患者的细胞，观察到显著的结合(A和B)。来自与图B相同患者的正常膀胱的细胞未结合包被有PLZ4的珠(C)。洗掉图C的细胞来减少细胞与珠的交叠。包被了 PLZ4的珠在pH 6. O的尿液中孵育4小时后能结合膀胱癌细胞5637细胞(D)。PLZ4-FITC缀合物能结合犬膀胱癌细胞(E)。珠的直径为90 μ m。图4A-B.膀胱癌细胞的荧光染色。A.用于测定PLZ4与5637细胞的结合亲和力的流式细胞术分析。随着PLZ4-PE浓度的增加，荧光强度增加。该图表示在每一浓度下三个平行试验的平均值。结合亲和力(Kd5tl)为约30 μ M。B.利用缀合FITC的PLZ4，对膀胱癌细胞和正常尿道上皮细胞进行的荧光染色。在载片池中培养细胞，并用PLZ4-FITC染色。膀胱癌细胞5637、TCCSUP和T24染上绿色，而正常尿道上皮细胞未被染色(左起第I柱)。所有的细胞核都被DAPI染成蓝色(左起第2柱和第4柱)。当仅添加链霉抗生物素-FITC而不添加PLZ4-生物素时，没有细胞被染成绿色(左起第3柱)。放大率200倍。图5A-F.荷瘤小鼠的体外NIRF成像。用来自经历为了切除膀胱癌的膀胱切除术的患者的原代膀胱癌组织建立小鼠肿瘤异种移植物。通过尾静脉注射PLZ4-Cy5. 5 (7nmol)。图A-D :近红外成像。图A :小鼠仅接受SA-CY5. 5。图B :小鼠接受PLZ4-CY5. 5缀合物。红色箭头指示具有CY5. 5强摄取的肿瘤异种移植物。图C :来自接受SA-Cy 5. 5的小鼠的异种移植物和器官的离体成像，显示了肾的摄取以及肿瘤异种移植物的微弱自身荧光。图D 来自接受PLZ4-Cy5. 5的小鼠的异种移植物和器官的离体成像，显示了肿瘤异种移植物和肾的荧光。图E和F :分别为图C和D的光成像。荧光强度在底部以任意单位显示。
图6A-C.PLZ4与α νβ3整联蛋白的结合。A :PLZ4结合α νβ3整联蛋白。将包被有PLZ4肽的珠与用不同整联蛋白亚基转染的Κ562细胞一起孵育。当α ν β 3整联蛋白在表面上表达时，PLZ4仅能结合Κ562细胞。B :确定对细胞结合重要的氨基酸的丙氨酸步移(Alanine walk)。用丙氨酸一次一个取代PLZ4中的每个氨基酸,从而产生覆盖有新的肽的珠(丙氨酸步移)，并测试它们与5637膀胱癌细胞的结合。用半定量系统测定结合活性++++表示非常强的结合，75-100%的珠表面被细胞覆盖；+++表示强结合，50-74%的珠表面被细胞覆盖；++表示中度结合，25-49%的珠表面被细胞覆盖；+表示弱结合，1-24%的珠表面被细胞覆盖；_表示无结合。C =X5位置的甘氨酸残基对PLZ4与膀胱癌细胞结合的影响。每一图中的珠上的肽具有与PLZ4(cQDGRMGFc;SEQ ID NO: 12)相同的主链序列(cQDGRKGFc; SEQ ID NO: 11)，除了 X5位置的M已经被取代为K。从图c到h，数量为I (c)到6(h)的甘氨酸缀合于K(SEQ ID N0:13)。将OBOC珠与5637TCC细胞一起孵育。与母体PLZ4配体(a)相比，当蛋氨酸被赖氨酸取代时，未观察到与5637细胞的结合的显著变化(b)。当添加仅一个(c)或两个(d)甘氨酸残基时，该配体仍然能强烈结合5637细胞。但是当添加3个(e)或4个(f)甘氨酸时,细胞结合显著降低，当添加5个(g)和6个(h)甘氨酸时,无结合。图7A-B. PLZ4结合犬TCC细胞系。A :用PLZ4珠测定细胞结合和正常犬尿道上皮细胞结合的全细胞结合测定。将人膀胱癌细胞系5637和犬K9TCC-PU用胰蛋白酶处理、洗涤并在完全培养基中重悬成IO6个细胞/ml的单细胞悬浮液。将正常犬膀胱尿道上皮细胞轻轻刮擦并消化成单细胞悬浮液。用水将PLZ4珠洗涤两遍，用PBS洗涤两遍，并将其添加于60_培养皿中的细胞悬浮液中。于37° C下轻轻摇动60分钟后，在倒置显微镜下直接观察细胞结合。如果PLZ4结合溶液中的细胞，则珠会被细胞覆盖，从而在显微镜观察时表现出花环模式。该实验对于细胞系重复3次。在2个不同的犬中，重复正常犬尿道上皮细胞的细胞结合测定。a 5637人膀胱癌细胞系；b K9TCC-PU细胞系；c :正常犬尿道上皮细胞；d :来自慢性膀胱炎的膀胱的细胞。珠的平均直径为90 μ m。B PLZ4肽对犬TCC细胞系的亲和荧光。将犬 TCC 细胞系、K9TCC-PU、K9TCC-PU-In、K9TCC_PU_AxA、K9TCC_PU_Nk 以及K9TCC-PU-AxC和人膀胱癌细胞系5637培养于载片池上。用来自因非膀胱疾病而实施安乐死的犬的正常犬膀胱尿道上皮细胞制备接触式制备涂片(touch preparation smear)。在封闭之前，用丙酮将载片固定2分钟。用IyM PLZ4-生物素将细胞于4° C孵育I小时，然后根据制造商的方案用1:1000稀释的链霉抗生物素-Alexa Flour 488缀合物(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)孵育。洗漆后，将载片用含有DAPI的介质封片,用于核染色，并在倒置荧光显微镜下观察载片。该实验重复3次。(200倍)图8A-B. PLZ4对犬TCC细胞系的结合亲和力和生物效应。A PLZ4对K9TCC-PU和KOTCC-PU-In的结合亲和力。在96孔板中接种2万个K9TCC-PU和K9TCC_PU_In。在培养24小时后，将细胞固定，用不同浓度的PLZ4-生物素孵育I. 5小时，然后用抗生物素蛋白-HRP再孵育I小时。用仅用抗生物素蛋白-HRP处理的细胞作为背景对照。利用TMB底物显色并用ELISA读数器读取。以三个平行样品进行实验，并重复3次。显示了 3个实验的平均值。B PLZ4对犬TCC细胞系的生物效应。在96孔板中接种I万个K9TCC_PU_In和K9TCC-PU细胞，并用浓度渐增的PLZ4或PBS处理2天。根据制造商的方案，通过WST-8测定，评价细胞增殖测定。将用PBS处理的细胞用作100%对照。以三个平行样品进行每一组的实验，重复3次。显示了每一浓度下的平均值。图9A-C. PLZ4向犬膀胱癌的小鼠异种移植物的归巢。A :具有PLZ4的犬KOTCC-PU-In异种移植物的体内成像。上图注射后，在不同的时间点，采集体内近红外荧光图像。B :接受链霉抗生物素_Cy5. 5的对照小鼠。PLZ4 :接受PLZ4_Cy5. 5的小鼠。红色箭头指向肿瘤异种移植物。下图器官的荧光强度的离体成像。在来自接受PLZ4-Cy5.5的小鼠的肿瘤移植物中观察到荧光的特异性摄取。在对照小鼠和接受PLZ4-Cy5. 5的小鼠中还观察到肾和肝中的非特异性摄取。C :肿瘤异种移植物中荧光摄取的离体定量分析。将肿瘤异种移植物的荧光强度针对相同小鼠的肝和肾的荧光强度进行标准化(肝和肾的标准化的值定义为I. O)。标准化后，来自接受PLZ4-Cy5. 5的小鼠的肿瘤异种移植物的摄取大大高于来自对照小鼠的异种移植物的摄取(对于标准化的值，分别为P=O. 003和p〈0. 001).发明的详细描述
I.导言大部分膀胱移行细胞癌病例是在非侵袭性阶段被诊断出的。非侵袭性膀胱癌对于靶向治疗而言是理想的，这是因为其易于通过膀胱内输注达到、与人体的其余部分相对分离以及仅具有少许混杂细胞。进行了一珠一化合物组合肽文库的高通量筛选，并鉴定出示例性的膀胱癌特异性配体PLZ4(氨基酸序列cQDGRMGFc ;SEQ ID NO: 12)。PLZ4可以选择性结合膀胱癌细胞系和来自患者的原代膀胱癌细胞，但是不结合正常尿道上皮细胞、来自膀胱样本的正常细胞混合物、成纤维细胞和血细胞。其可以结合所测试的所有5种犬膀胱癌细胞系。该配体可以结合用PH 6. O的尿液处理的肿瘤细胞，但不结合从用膀胱内卡介苗治疗主动治疗的4名患者的尿中收集的细胞。连接了近红外染料Cy5. 5的PLZ4的静脉内注射显示出从切除的人原代膀胱癌样本发展成的小鼠异种移植物中的荧光摄取。因此，该配体可以用于膀胱癌的成像检测和靶向治疗。PLZ4结合表达α ν β 3整联蛋白而不是其它整联蛋白的Κ562细胞。利用丙氨酸步移和彩虹珠编码系统(rainbow bead coding system),确定对细胞结合重要的氨基酸。结构分析表明细胞结合需要2个结构域。本文所述的膀胱癌特异性肽配体(包括PLZ4)可以用于例如膀胱癌的诊断和随访/监测和靶向治疗的成像检测。本发明在一定程度上基于由肽PLZ4 (cQDGRMGFc (SEQ ID N0:12)所示例的膀胱癌特异性配体，肽PLZ4在体外特异性结合人膀胱移行细胞癌(TCC)细胞系和来自临床患者的膀胱癌细胞，并且在体内集中于小鼠中从患者膀胱切除术样本发展出的肿瘤异种移植物(Zhang, et al, Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations (2010)Inpress)中。此外，临床前研究表现出膀胱癌特异性配体在人类和其它哺乳动物中的诊断和靶向治疗用途的潜力。因为携带TCC的犬作为人中TCC的自发、远交、免疫感受态大动物模型，并且膀胱TCC是犬中最常见的泌尿系癌症(占所有病例的87%) (Fink, et al.，CancerRes (1997) 57:1841-1845)，因此确定膀胱癌特异性配体能结合犬膀胱癌。因为发生膀胱癌特异性配体的结合，因此患有天然发生的犬膀胱癌的犬是用于人类治疗和诊断的临床前研究中的相关模型(Deborah, et al. , Urologic Oncology (2000) 5:47-59. ; Dhawan, et al. , Urologic Oncology (2009) 27:284-292)，因为犬的膀胱肿瘤与人的肌肉侵袭性膀胱TCC具有相似的组织病理学表观、分子学特征、生物学行为以及化疗反应(Patrick, et al. , J Comp Pathol (2006) 135:190-199 和 Mutsaers, et al. , J Vet InternMed(2003) 17:136-144)。本发明的膀胱癌特异性配体可以用于膀胱癌控制中的诊断和治疗目的。2.膀胱癌特异性肽配体本发明提供了优先且特异性结合膀胱癌组织并且最低限度地结合或不结合正常的膀胱组织或非膀胱组织的肽配体。通常，膀胱癌特异性肽配体包含氨基酸序列X1DGRX5GF,其中X1和X5是除了半胱氨酸以外的任何氨基酸(例如A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y) (SEQ ID NO: I)。肽的长度通常为约7-10或7-9个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度不超过10个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度不超过9个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度不超过8个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度不超过7个氨基酸。在不同实施方案中，多肽包含氨基酸序列X1DgRX5GFGEQ ID NO: I)，其中X1和X5是任何氨基酸，其中多肽的长度不超过300个氨基酸，例如不超过250、200、150、100、75、50 或25个氨基酸，并能结合膀胱癌细胞。在不同实施方案中，多肽或肽包含氨基酸序列X1DGRX5GF(SEQ ID NO: I)，其中i) 一个或多个氨基酸残基是D-型氨基酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或所有氨基
酸残基是D-型氨基酸；ii)多肽或肽在N末端、或C末端、或N末端和C末端包含保护基(例如，N末端可以乙酰化，而C末端可以具有氨基)；iii)多肽或肽是全部逆反的或部分逆反的；iv)多肽或肽包含膀胱癌特异性肽氨基酸序列(例如X1DGRX5GF(SEQ ID NO: I))的2个或更多个重复，例如3、4、5、6或更多个重复，；V)多肽或肽是环化的；vi) 一个或多个氨基酸残基连接于类肽主链；vii) 一个或多个氨基酸残基是β氨基酸残基；或viii)多肽或肽是用烃钉进行稳定化的。在一些实施方案中，肽在N末端和C末端可以具有1-5个侧翼L-型或D-型半胱氨酸残基，例如，从而允许肽的环化和/或缀合。例如，肽配体可以包含氨基酸序列CX1DGRX5GfC (SEQ ID NO: 17)或 CX1DGRX5GFc (SEQ ID NO: 10)，其中 X1 和 X5 是除了半胱氨酸以外的任何氨基酸(例如A、D、Ε、F、G、H、I、K、L、Μ、N、P、Q、R、S、Τ、V、W、Y)且c是D-型半胱氨酸。在不同实施方案中，肽配体是环化的。在一些实施方案中，乂1是0、6或A(SEQ ID NO:2)且X5是除了半胱氨酸以外的任何氨基酸(例如六、03、卩、6、!1、1、1(、1^、]\1、队？、0、1 、5、1\￥、胃、￥)。在一些实施方案中，X1是除了半胱氨酸以外的任何氨基酸(例如A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y)且乂5是] 、1(、6、4或GG(SEQ ID NO: 3) 在一些实施方案中，X1是Q、G或A且X5使M、K、G、A 或 GG(SEQ ID NO:4).在一些实施方案中，膀胱癌特异性肽配体具有氨基酸序列QDGRMGF(SEQ IDNO: 5)。在一些实施方案中，肽具有氨基酸序列QDGRKGF (SEQ ID NO: 6)。在一些实施方案中，肽具有氨基酸序列QDGRKGGF(SEQ ID NO: 7)，其中Ke表示侧链连接了甘氨酸残基的赖氨酸残基。可以将其它氨基酸残基添加于氨基末端和/或羧基末端，例如添加1-5个氨基酸残基，例如1、2、3、4或5个氨基酸残基。可以将半胱氨酸残基添加于氨基末端和羧基末端，从而允许环化。在一些实施方案中，膀胱癌特异性肽配体具有氨基酸序列x(1_5)x6dgrx7gfx(8_12)(SEQ ID N0:8)，其中 X(1_5)和 X(8_⑵是任何氨基酸(即 A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y) ；X6和X7是除了半胱氨酸以外的任何氨基酸(即A、D、E、F、G、H、I、K、L、Μ、Ν、P、Q、R、S、T、V、W、Y)。在一些实施方案中，膀胱癌特异性肽配体具有氨基酸序列X1X2X3DGRX4GFX5X6(SEQ ID NO:9)，其中 X1'X2、X5、X6 是任何氨基酸(即 A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y) ;X3和X4是除了半胱氨酸以外的任何氨基酸(即A、D、E、F、G、H、I、K、L、Μ、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y)。在一些实施方案中，膀胱癌特异性肽配体具有氨基酸序列CX1DGRX5GFc (SEQ ID NO: 10)，其中X1是除了半胱氨酸以外的任何氨基酸(即A、D、
E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y) ;X5是除了半胱氨酸以外的任何氨基酸(即A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y)且c是D-型半胱氨酸。在一些实施方案中，膀胱癌特异性肽配体具有氨基酸序列cQDGRKGFc (SEQ ID NO: 11)，其中c是D-型半胱氨酸。在一些实施方案中，膀胱癌特异性肽配体具有氨基酸序列cQDGRMGFc (SEQ ID NO: 12)，其中c是D-型半胱氨酸。在一些实施方案中，膀胱癌特异性肽配体具有氨基酸序列cQDGRK(ei_6)Fe (SEQ ID NO: 13)，其中c是D-半胱氨酸，其中K(ei_6)表示侧链连接了 1-6个甘氨酸残基的赖氨酸残基。在一些实施方案中，膀胱癌特异性肽配体具有氨基酸序列CQDGRMGFC (SEQ IDNO: 14)。在一些实施方案中，肽是环化的。膀胱癌特异性肽中的一个或多个氨基酸可以是D-型氨基酸。在一些实施方案中，肽配体中所有的氨基酸残基都是D-型氨基酸。在不同实施方案中，肽配体是部分逆反的或全部逆反的。通常，膀胱癌特异性肽是基本上纯化的和/或分离的。可以将其它氨基酸残基或多肽序列任选地连接于(例如通过化学连接或融合)肽配体的氨基末端和/或羧基末端。在一些实施方案中，本文所述的膀胱癌特异性肽序列可以嵌于或位于较长的多肽序列中，例如，融合序列或另一非天然存在的多肽序列。例如，在不同实施方案中，将肽连接于免疫球蛋白的Fe部分(例如用于促进抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(⑶C))，或连接于细胞毒素。在一些实施方案中，将膀胱癌特异性肽配体连接于IgG抗体的Fe区。在一些实施方案中，将膀胱癌特异性肽配体连接于人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4同种型的Fe区。在一些实施方案中，将膀胱癌特异性肽配体与治疗剂缀合。在一些实施方案中，治疗剂是肿瘤剂(neoplastic agent)。示例性的肿瘤剂包括但不限于烧化剂(顺钼、卡钼以及奥沙利钼)；抗代谢药物(嘌呤或嘧啶模拟物，包括例如硫唑嘌呤和巯嘌呤)；植物碱和类萜(长春花生物碱和紫杉烷)；长春花生物碱(长春新碱、长春碱、去 甲长春碱以及长春地辛)；鬼臼毒素(包括依托泊甙和替尼泊甙)；紫杉烷(紫杉醇、泰素(taxol)以及多烯紫衫醇)；拓扑异构酶抑制剂(I型抑制剂喜树碱、伊立替康(irinotecan)和拓扑替康(topotecan) ;11型抑制剂安吖唳、依托泊式、依托泊式磷酸盐以及替尼泊式)；抗肿瘤药物(antineoplastics)(更生霉素、阿霉素、表阿霉素、氟达拉滨和博来霉素)。可将用于治疗目的癌症的任何化疗剂与膀胱癌特异性肽配体缀合。在不同实施方案中，将抗肿瘤药物封装于脂质体中。在一些实施方案中，治疗剂是细胞毒素。可以使用的示例性细胞毒素包括相思豆毒素、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素或以上的修饰的毒素。也可以使用其它细胞毒素。在不同实施方案中，将膀胱癌特异性肽配体与放射性同位素缀合，例如125I、32P、14C、3H、35S、123I、nC、13N、150、18F、82Rb、锝-99m (Tc_99m)或铊-201。在不同实施方案中，将膀胱癌特异性肽配体与磁性颗粒缀合，例如磁性珠或氧化铁颗粒(例如用于磁共振成像(MRI))。3.包含膀胱癌特异性配体的组合物可以将膀胱癌特异性肽配体制备成多种用于给予患者的药物制剂，包括液体形式和固体形式的制剂。包含膀胱癌特异性肽配体的组合物可用于预防性和/或治疗性处理的胃肠外、局部、口服或定位给药，包括气雾剂或经皮给药。可以根据给药方法以各种单位剂量形式给予药物组合物。例如，适合口服给药的单位剂量形式包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊和锭剂。应当认识到，当口服给予本发明的多肽和药物组合物时，必须保护其免于消化作用。通常通过以下方式实现这点将多肽与组合物复合，使得多肽能抵抗酸水解和酶水解，或将蛋白包装于诸如脂质体 的合适抗性载体中。保护蛋白免于消化作用的方式在本领域中是熟知的。包含膀胱癌特异性肽配体的组合物对于胃肠外给药特别有用，例如静脉内给药或向体腔或器官(例如膀胱)的腔内给药。用于给药的组合物通常包含多肽的溶液，所述溶液包含溶解于药物可接受载体、优选水性载体中的多肽。可以使用各种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，且通常不含不希望的物质。可以通过常规的公知灭菌技术将这些组合物灭菌。组合物可以视需要含有药物可接受的辅助物质，以接近生理条件，所述辅助物质例如PH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的多肽浓度变化很大，并且主要基于流体量、粘度、体重等并根据所选的具体给药模式和患者需要来选择。液体形式的药物制剂可以包括溶液、悬浮液和乳剂，例如水溶液或水/丙二醇溶液。适合口服用途的水性溶液可以通过将活性组分溶解于水中并按照需要添加合适的着色齐U、调味剂、稳定剂和增稠剂来制备。适合口服用途的水性悬浮液可以通过将精细分开的活性组分分散在具有粘性材料的水中来制备，所述粘性材料如天然或合成的树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素纳以及其它熟知的悬浮剂。对于胃肠外注射，可以将液体制剂配制于水性聚乙二醇溶液中。利用合适的载体，可以实施经皮给药。如果需要，可以使用经设计能促进经皮递送的设备。合适的载体和设备在本领域中是熟知的，这在美国专利第6，635，274号、第6，623，457号、第6，562，004号和第6，274，166号中作了举例说明。在一些实施方案中，将膀胱癌特异性肽配制成纳米颗粒。肽纳米颗粒及其制备方法在本领域中是已知的，并描述于例如美国专利公开第2006/0251726号，美国专利公开第2004/0126900号，美国专利公开第2005/0112089号，美国专利公开第2010/0172943号，美国专利公开第2010/0055189号，美国专利公开第2009/0306335号，美国专利公开第2009/0156480号以及美国专利公开第2008/0213377号中，每一专利公开特此通过援引整体并入本文，用于所有目的。可用的其它纳米颗粒制剂描述于例如Emerich andThanos, Curr Opin Mol Ther (2008) 10(2):132-9;Kogan, et al. , Nanomedicine(2007)2(3):287-306;Zhang, et al. , Bioconjug Chem(2008) 19(I):145-152;Scarberry, et al. , JAm Chem Soc(2008) 130(31):10258-10262 ；以及 Fraysse-Ailhas, et al. , Eur CellsMaterials (2007) 14(Suppl. 3) : 115中。如果合适,可以将氨基酸序列添加于肽配体的N末端、C末端或N末端和C末端，以便允许肽纳米颗粒的组装和形成。还考虑到固体形式的药物制剂，其用来在即将使用前转化成液体形式的制剂，用于口服给药。这类液体形式包括溶液、悬浮液以及乳剂。在含有活性组分之外，这些制剂可以含有着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲剂、人工和天然增甜剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。药物制剂优选采用单位剂量形式。在这类形式中，将制剂细分为含有适量活性组分的单位剂量。单位剂量形式可以是包装的制剂，所述包装可以含有独立量的制剂，如包装的片剂、胶囊和在瓶或安瓿中的粉剂。此外，单位剂量形式自身可以是胶囊、片剂、扁馕剂或锭剂，或单位剂量形式可以是包装形式的合适数量的任何上述形式。本说明书所用的术语"单位剂量形式"指适合作为用于人类个体和动物的单位剂量的物理上独立的单元，每一单元含有经计算能与所需的药物稀释剂、载体或介质联合后产生希望的药物效应的预定量的活性物质。本发明的新的单位剂量形式的规格服从于并且直接取决于(a)活性物质的独特性质和待实现的具体效果，以及(b)如本说明书所详细公开的，将活性物质复合用于人和动物的领域所固有的限制，这些是本发明的特征。在一个实施方案中，将药物制剂以治疗有效剂量给予患者来预防、治疗或控制疾 病或诸如癌症的恶性疾病状况。将药物组合物或药物以足以在患者中引起有效的治疗或诊断反应的量给予所述患者。有效的治疗或诊断反应是至少部分地阻止或延缓疾病或恶性疾病状况的症状或并发症的反应。足以实现该反应的量被定义为“治疗有效剂量”。4.治疗和/或预防方法a)适合治疗和/或预防的个体本文所述的膀胱癌特异性肽配体可以用于治疗和预防膀胱癌。膀胱癌指几种类型的膀胱恶性生长物中的任何类型。最常见的膀胱癌类型始于衬于膀胱内部的细胞，并称为移行细胞癌(TCC)(有时称为尿道上皮细胞癌(UCC))。其它类型的膀胱癌包括鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤和小细胞癌。在一些实施方案中，例如，由于遗传、生活方式或环境风险因素，个体患有膀胱癌或处于发展为膀胱癌的风险中。在一些实施方案中，个体患有膀胱组织的移行细胞癌或处于发展为膀胱组织的移行细胞癌的风险中。在一些实施方案中，个体患有表达或过表达整联蛋白0 50 3和/或整联蛋白α5β 5的膀胱癌或处于发展为表达或过表达整联蛋白^150 3和/或整联蛋白α5β 5的膀胱癌的风险中。个体可以是无症状的或表现出膀胱癌症状。个体可以具有膀胱癌家族史，例如，父母、祖父母、或兄弟姊妹已诊断为膀胱癌。可以将膀胱癌特异性肽配体给予个体，从而实现膀胱肿瘤或膀胱癌细胞的增殖或生长的抑制、减少、回缩或预防。对于实现治疗，患者患有膀胱癌或具有膀胱肿瘤负荷，且给予膀胱癌特异性肽配体可以逆转、延迟或抑制该疾病的进展。对于实现预防，患者可以得到缓解，或可能经历原发肿瘤的消除，且给予膀胱癌特异性肽配体可以延迟、减少、抑制或消除转移生长。b)给予多肽的方法i.给药途径可以将本文所述的膀胱癌特异性肽配体配制成药物制剂用于给予患者。可以通过各种方法给予药物制剂。方法可以包括系统性给药，其中通过循环系统将多肽或多肽的组合物递送到体内的位点，包括药物作用靶点。系统性给药包括但不限于口服给药、尿道内给药和胃肠外给药(即除了通过消化道以外的给药方式，如肌肉内、静脉内、动脉内、经皮以及皮下)。在其它实施方案中，膀胱癌特异性肽配体的给药是局部的，例如，直接向膀胱内给药或肿瘤内给药。
ii.剂量给药可以给予膀胱癌特异性肽配体用于预防性治疗和/或治疗性处理。在治疗性应用中，将包含膀胱癌特异性肽配体的组合物以足以治愈或至少部分阻止膀胱癌和其并发症的量给予膀胱癌患者。足以实现此目的的量被定义为“治疗有效剂量”。对于此目的有效的量会取决于疾病的严重性和患者健康的一般状态，且经常进行临床研究来确定给定癌症类型的最佳剂量。化合物的有效量是能提供症状的主观缓解或临床医师和其它有资格的观察者所注意到的客观可辨认的改善的量。在预防性应用中，将含有膀胱癌特异性肽配体的组合物给予未处于疾病状态的患者，从而预防疾病的发生。这样的量被定义为“预防有效剂量”。在此用途中，确切的量也取决于患者的健康状况。确定有效量完全位于本领域技术人员能力范围内，特别是根据本文所提供的详细公开。通常，通过以下方式确定本发明的一种或多种多肽的组合的有效(efficacious)量或有效(effective)量首先给予低剂量或少量的多肽或组合物，然后逐渐增加给药剂量(dose)或剂量(dosage),如果需要,可增加第二或第三药物,直到在治疗的个体观察到期望的效果，同事毒副作用非常小或没有毒副作用。确定给予本发明的组合的合适剂量和给药方案的合适方法描述于例如Goodman and Gilman，s The Pharmacological Basisof Therapeutics, Ilth Edition, 2006,同上；aPhysicians，Desk Reference (PDR), 64thEdition, 2010 ；Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 21stEd. , 2006,同上；和 Martindale: The Complete Drug Reference, Sweetman, 2005, London: Pharmaceutical Press.,以及 Martindale, Martindale: The Extra Pharmacopoeia, 31stEdition. , 1996, Amer Pharmaceutical Assn中，将每一上述文献特此通过援引并入本文。本文所述药物制剂的示例性剂量包括每千克个体或样品重量毫克或微克量的膀胱癌特异性肽配体(例如每千克约I微克至每千克约500毫克，每千克约100微克至每千克约5毫克，或每千克约I微克至每千克约50微克)。还应当理解，对于要实现的期望效果而言，膀胱癌特异性肽配体的合适剂量取决于组合物的效力。当将膀胱癌特异性肽配体给予哺乳动物时，医师、兽医或研究人员可以例如首先开立相对低剂量的处方，随后增加剂量，直到获得合适的反应。另外，应当理解，对于任何具体哺乳动物个体而言，具体剂量水平会取决于各种因素，包括所用的具体组合物的活性，个体的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食，给药时间，给药途径，排泄率，任何药物联合以及待调节的表达或活性的程度。本发明多肽的合适剂量会根据若干因素而变化，包括所选的给药途径、组合物的配制、患者反应、疾病状况的严重性、个体体重以及处方医师的判断。按个体患者所需，可以随时间增大或减小剂量。通常，最初给予患者低剂量，随后将剂量增加到患者可耐受的有效剂量所给予的膀胱癌特异性肽配体的剂量取决于温血动物(哺乳动物)的种类、体重、年龄、个体疾病状况、待治疗区域的表面积以及给药形式。剂量的大小还由具体患者中伴随具体化合物给药的任何副作用的存在、性质和程度决定。约50-710kg的哺乳动物的给药单位剂量可以含有约5-500mg活性组分。通常，膀胱癌特异性肽配体的剂量是足以实现所需效果的剂量。
组合物的最佳剂量、毒性以及治疗功效还能根据个体组合物的相对功效而变化，并且可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序确定，例如通过测定LD5tl (致50%群体死亡的剂量)和ED5tl(在50%的群体中有治疗效果的剂量)。毒性作用和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且可以表达为比值LD5(i/ED5(i。优选表现出大治疗指数的组合物。尽管可以使用表现出毒性副作用的组合物，但是应认真设计能将这类组合物靶向于受累组织的位点的递送系统，从而使对正常细胞的可能损伤最小化，由此降低副作用。从例如动物研究(例如啮齿动物和猴)获得的数据可以用于制定用于人类的剂量范围。本发明多肽的剂量优选位于循环浓度的范围内，所述浓度包括具有很小毒性或无毒性的ED5tlt5剂量可以在该范围内变动，这取决于所用的剂量形式以及给药途径。对于用于本发明方法的任何组合物，最初可以由细胞培养测定来估计治疗有效剂量。可以在动物 模型中制定剂量来达到循环血浆浓度范围，所述浓度范围包括在细胞培养物中所测定的IC5tl (实现症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)。这类信息可以用于更准确地确定人类的有用剂量。血浆中的水平可以通过例如高效液相色谱(HPLC)来测量。通常，对于通常个体，多肽或组合物的剂量当量为约lng/kg至100mg/kg。用于静脉内给药的本发明典型多肽组合物为约O. Ι-lOmg/kg/患者/天。可以使用从O. I至高达约100mg/kg/患者/每天的剂量。制备可给予的组合物的实际方法对本领域技术人员而言是已知的或显而易见的，并较详细地描述于诸如Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy (雷明顿药物科学和实践)，21stEd. , 2006, LippincottWilliams & Wilkins 的出版物中。在本发明的一实施方案中，例如，以约Img化合物/kg个体重量(lmg/kg)至约Ig/kg的每日剂量给予本发明的药物制剂。在另一实施方案中，剂量为约5mg/kg至约500mg/kg ο在另一实施方案中，剂量为约10mg/kg至约250mg/kg。在另一实施方案中，剂量为约25mg/kg至约150mg/kg。优选的剂量为约10mg/kg。根据需要，药物制剂的示例性剂量可以包括100_500mg的每日剂量。可以以约25mg/mL至约50mg/mL的浓度给予药物制剂。药物制剂的示例性剂量可以包括约50_200mg/kg，例如约100mg/kg的每日剂量。在成功治疗后，使患者进行维持治疗是可取的，从而防止所治疗的疾病或恶性疾病状况的复发。iii.方案通过测量个体体内的多肽能计算出给药方案。通常，剂量为Ing至l，000mg/kg体重，并且根据需要或是否合适，可以每天、每半周、每周、每两周、每半月、每月、每两月或每年给予一次或多次。本领域技术人员可以容易地确定最佳剂量、给药方法以及重复率。按照本领域已知的已确立的方案和本文公开的内容，本领域技术人员能确定本发明的多肽或多肽组合物对人类的最佳给药方案。药物制剂可以单次或多次给药，这取决于所需要的和患者所能耐受的剂量和频率。在任何情况下，组合物应当提供足量的本发明多肽，从而有效治疗患者。优选地，给予剂量一次，但是可以定期施用，直到实现治疗结果或直到副作用迫使治疗中断。通常，剂量足以治疗或改善疾病的症状或体征，而不会对患者产生不能接受的毒性。每日剂量可以每日给予一次或者分成亚剂量并以多剂量给予，例如每日两次、三次或四次。然而，正如本领域技术人员所理解的，可以以不同的量并在不同的时间给予本文所述的组合物。本领域技术人员还应当认识到，某些因素可以影响有效治疗个体所需的剂量和时间安排，包括但不限于疾病或恶性疾病状况的严重性、先前的治疗、个体的总体健康和/或年龄以及存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的组合物治疗个体可以包括单一治疗或优选可以包括一系列治疗。因此，用于静脉内给药的其药物制剂可以为约0.01-100mg/kg/患者/天。可以使用O. I至高达约1000mg/kg/患者/天的剂量，特别是，当将药物给予隐蔽位点并且不是给予到血流中，如进入体腔或器官的腔中。制备可胃肠外给予的组合物的实际方法对本领域技术人员而言是已知的或显而易 见的，并较详细地描述于诸如Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy (雷明顿药物科学与实践)，21stEd. , 2006, LippincottWilliams & Wilkins 的出版物中。为了实现期望的治疗效果，可以以治疗有效每日剂量在多日中给予药物制剂。因此，治疗个体中本文所述的疾病或恶性疾病状态的组合物的治疗有效给药可能需要定期(例如，每天)给药，其可以持续三天至两周或更长的时期。通常，如果需要，可给予组合物至少连续3天，经常至少连续5天，更经常至少连续10天，并且有时连续20、30、40或更多天或更长的时期。尽管连续的每日剂量是达到治疗有效剂量的优选途径，但是，即使不是每天给予化合物或组合物，也可以实现治疗有益效果，只要给药的重复频率足以在个体中保持化合物的治疗有效浓度。例如，可以每隔一天、每隔两天给予组合物，或如果使用更高的剂量且患者能耐受，可以一周一次给予组合物。c)与建立的抗癌治疗的联合治疗i.化疗本文所述的膀胱癌特异性肽配体可以和其它药剂共同给予作为联合治疗。可以与膀胱癌特异性肽配体共同给予的化疗剂的实例包括但不限于烷化剂(顺钼、卡钼以及奥沙利钼)；抗代谢药物(嘌呤或嘧啶模拟物，包括例如硫唑嘌呤和巯嘌呤)；植物碱和类萜(长春花生物碱和紫杉烷)；长春花生物碱(长春新碱、长春碱、去甲长春碱以及长春地辛)；鬼白毒素(包括依托泊甙和替尼泊甙)；紫杉烷(紫杉醇、泰素以及多烯紫衫醇)；拓扑异构酶抑制剂(I型抑制剂喜树碱、伊立替康以及拓扑替康；11型抑制剂安吖啶、依托泊甙、依托泊甙磷酸盐和替尼泊甙)；抗肿瘤药物(更生霉素、阿霉素、表阿霉素、氟达拉滨以及博来霉素)。可以将用于治疗目的癌症的任何化疗剂与膀胱癌特异性肽配体在联合治疗方案中共同给予。ii.放射膀胱癌特异性肽配体可以连同放射学操作一起给予。多种放射学操作可以用于疾病的治疗。可以将本领域技术人员已知的任何操作与本发明的多肽联合用于治疗患者。放射学操作包括利用放射治疗来损伤细胞DNA的处理。对细胞DNA的损伤可以由光子、电子、质子、中子或直接或间接使构成DNA链的原子离子化的离子流造成。间接离子化是由于水的离子化而发生，从而形成自由基，特别是羟基自由基，其随后损伤DNA。在最常见的放射治疗形式中，放射作用的大部分是通过自由基。由于细胞DNA修复机制，利用诱导双链DNA断裂的试剂(例如放射治疗)已经证实对于癌症治疗而言是非常有效的技术。癌细胞经常是未分化的且类似干细胞，与健康的和分化程度更高的细胞相比，这些细胞增殖更快且修复亚致死损伤的能力减弱。此外，DNA损伤通过细胞分裂而遗传，这导致对癌细胞损伤的积累，从而诱导更慢的增殖并经常诱导死亡。放射治疗过程中所用的射线的量以戈瑞(Gy)测量，并且射线的量根据所治疗的癌症的类型和分期以及患者健康的总体状况而变化。癌症类型也可以影响剂量范围，例如，对于实体上皮细胞瘤，典型的治疗剂量为60-80Gy，而对于淋巴瘤，剂量为20-40Gy。也可以使用预防(辅助)剂量，并且其通常为45-60Gy，以I. 8_2Gy的部分进行给予(对于乳腺癌、头颈癌)。许多其它因素是熟知的，并且当选择剂量时，本领域技术人员应当考虑它们，包括患者是否正接受其它治疗(例如但不限于膀胱癌特异性肽配体的给药、给予化学治疗等)、患者的伴随疾病、放射治疗的时间安排(例如在外科手术之前还是之后 给予放射治疗)以及任何外科手术操作的成功程度。规定放射剂量的递送参数可以在治疗计划中由技术人员确定。可以利用专门的治疗计划软件，在专用计算机上进行治疗计划。根据放射递送方法，可以使用若干角度或来源来合计达到必须的总剂量。通常，所设计的计划向肿瘤递送一致的规定剂量并使周围健康组织受到的剂量最小。iii.外科手术膀胱癌特异性肽配体可以连同肿瘤的外科手术移除或减瘤一起给予。多种外科手术操作可以用于疾病的治疗。可以将本领域技术人员已知的任何方法与本发明的多肽联合用于治疗患者。外科手术操作的分类通常是根据紧急程度、方法的类型、涉及的身体系统、侵袭程度以及专用仪器。外科手术操作的实例可以包括紧急情况以及预定操作。紧急外科手术是必须迅速进行从而挽救生命、肢体或功能能力的外科手术。外科手术操作的其它实例可以包括探查外科手术、治疗性截肢术、再植术、重建、整容术、切除、器官或身体部分的移植或移除以及本领域已知的其它外科手术。可以进行探查外科手术来辅助或证实诊断。治疗性外科手术是治疗先前确诊的疾病状况。截肢术涉及截除身体的一部分，通常是肢体或手指或足趾。再植术涉及再接上断离的身体部分。重建外科手术涉及重建损伤的、毁伤或变形的身体部分。可以进行整容术来改善正常结构的外观或用于修复由于疾病而受损或丧失的结构。切除是切掉患者的器官、组织或其它身体部分。移植外科手术是通过将来自另一人(或动物)的另一器官或身体部分移入患者来代替器官或身体部分。从有生命的人或动物移除器官或身体部分用于移植也是外科手术类型。除了使用大切口进入目的区域的传统开放式外科手术操作之外，外科手术操作还包括微创外科手术。微创外科手术通常涉及较小的外部切口，用于将小型化设备插入体腔或结构中，正如腹腔镜外科手术或血管形成术。激光外科手术涉及使用激光代替解剖刀或相似的外科仪器来切割组织。显微外科涉及外科医生使用外科显微镜来观察小的结构。机器人外科手术利用手术机器人(例如Da VincidntuitSurgical, Sunnyvale, California)),从而在技术人员(如外科医生)的指导下控制仪器的使用。5.监测治疗功效的方法可以利用多种方法测定利用本文所述的膀胱癌特异性肽配体的治疗性处理和预防性处理的功效。通常，功效是产生效果而无显著毒性的能力。功效表示治疗能为给定的干预(干预的实例可以包括但不限于给予药物制剂、使用医疗装置或使用外科手术操作)提供治疗性或预防性效果。可以通过比较治疗与未治疗的个体或通过比较治疗前后的同一个体来确定功效。可以利用多种方法测定治疗功效，包括药理学研究、诊断研究、预测研究以及预后研究。功效指标的实例包括但不限于肿瘤细胞生长的抑制和肿瘤细胞死亡的促进。可以利用本领域已知的多种方法评估抗癌治疗的功效。可以在动物模型中，通过与未治疗对照或安慰剂对照进行比较来筛选膀胱癌特异性肽配体的预防性功效或治疗性功效。随后分析通过此类筛选所鉴定的膀胱癌特异性肽配体的诱导肿瘤细胞死亡或增强免疫系统激活的能力。例如，可以在培养的肿瘤细胞系中测试血清的多重稀释液，并且可以使用检测细胞死亡或细胞生长抑制的标准方法。(参见例如Maniatis, et al. , MolecularCloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. , New York, 1982;Ausubel,etal. Editor, Current Protocols in Molecular Biology, USA, 1984-2008 ;以及Ausubel, etal.Editor, Current Protocols in Molecular Biology, USA, 1984-2008;Bonifacino, etal. , Editor, Current Protocols in Cell Biology, USA, 2010 ;上述所有文献在此通过援引整体并入)。 本发明的方法提供了检测患有各种癌症或易患各种癌症的患者的疾病抑制。多种方法可以用于监测有症状的患者的治疗性处理和无症状患者的预防性处理。监测方法必须分别确定患者在给予膀胱癌特异性肽配体剂量之前的肿瘤负荷的基线值，并将该值与治疗后肿瘤负荷的值进行比较。对于利用膀胱癌特异性肽配体的治疗，肿瘤负荷的值的显著降低(即，大于同一样品重复测量的实验误差的典型界限，所述界限表示为距这些测量的平均值的一倍标注差)指示阳性的治疗结果(即，膀胱癌特异性肽配体的给药已经阻断或抑制或减少肿瘤生长和/或转移的进展)。在一些实施方案中，如果所治疗的个体的肿瘤负荷减少至少约10%，例如至少约20%、30%、40%或50%或肿瘤负荷完全消除(例如比较个体在治疗前后的肿瘤负荷)，则认为用膀胱癌特异性肽配体的治疗是有效的。在其它方法中，从已经经历膀胱癌特异性肽配体治疗的个体的对照群体确定肿瘤负荷的对照值(例如平均值和标准差)。将患者肿瘤负荷的测量值与对照值进行比较。如果个体的测量水平与对照值无显著差异(例如大于一倍标准差)，则可以停止治疗。如果患者的肿瘤负荷水平显著高于对照值，则应当继续给予药剂。在其它方法中，监测目前未接受治疗但是经历过先前的治疗过程的患者的肿瘤负荷，从而确定是否需要恢复治疗。可以将患者的肿瘤负荷的测量值与之前治疗过程后患者达到的肿瘤负荷值进行比较。肿瘤负荷相对于之前的测量结果的显著降低(即，大于同一样品重复测量的误差的典型界限)表示可以恢复治疗。可选地，可以将患者中的测量值与经历治疗过程后的患者群体中所测定的对照值(平均值+标准差)进行比较。可选地，可以将患者的测量值与仍无疾病症状的经过预防性处理的患者群体或表现出疾病性状改善的经过治疗性处理的患者群体的对照值进行比较。在所有这些情况下，肿瘤负荷相对于对照水平的显著增加(即，大于标准差)指示患者应当恢复治疗。用于分析的组织样品通常是患者的血液、血浆、血清、粘液、组织活检、肿瘤、腹水或脑脊髓液。可以分析样品中肿瘤形成的指示。可以利用本领域已知的任何方法检测肿瘤形成或肿瘤负荷，例如由合格的病理学者进行活检的肉眼观察，或其它可视化技术，例如放射线照相术、超声、磁共振成像(MRI)。6.诊断方法a)接受诊断的患者膀胱癌特异性肽配体的结合可以用于个体膀胱癌的检测和诊断。本发明的膀胱癌特异性配体可以结合细胞表面的整联蛋白α5β3和整联蛋白α5β5。可以在疑似为癌性的膀胱组织中测定膀胱癌特异性肽配体的结合水平。为了确定膀胱癌特异性肽配体是否结合膀胱组织，可以采集膀胱组织的组织活检。在其它实施方案中，测定膀胱癌特异性肽配体与尿样中的膀胱细胞的结合。因此，可以从本发明的方法获益的患者可能已经表现出膀胱癌症状。例如，可能存在膀胱癌或者肿瘤的证据(通过肉眼检查或触诊或扫描技术，例如磁共振成像(MRI)或正电子放射断层造影术(Positron Emission Tomography PET)扫描)。本发明的诊断方法可以与目前可用的癌症诊断测试联合使用。患者可能已 经得到癌症的初步诊断，例如基于血清生物标志物、尿生物标志物或基因分析。便于膀胱癌诊断的生物标志物在本领域中是已知的，并且描述于，例如Netto andEpstein, Pathology. (2010) 42(4):384-94;Gaston and Grossman, Methods Mol Biol.(2010)641:303-23;Goebell, et al.,Urologe A. (2010)49 (4):547-59;Mowatt, etal., Health Technol Assess. (2010) 14(4):1-331;Mitra and Cote,Nat Rev Urol.(2010)7 (I):11-20;Bryan, et al. , BJU Int. (2010) 105 (5):608-13;Apolo, et al. , FutureOncol. (2009)5(7) :977-92中。在这些情况下，可以合理地进行活检，并且疑似癌性的组织中膀胱癌特异性肽配体的结合水平或整联蛋白。50 3和/或整联蛋白α5β5的表达水平可以证实或反驳癌症的初步诊断。在其它情况下，患者可能具有膀胱癌或另一泌尿组织癌的个人或家族史。例如，在膀胱癌的成功治疗性处理后，患者可能好转。对于与膀胱癌风险增加或者膀胱癌复发有关的基因，患者的测试还可能是阳性的。b)获得生物样品测量表达水平的生物样品取决于疑似癌性的组织。通常，生物样品来自疑似癌性的组织，例如膀胱细胞或膀胱组织。在一些实施方案中，生物样品是尿样。膀胱细胞可从膀胱组织脱落并在尿中排出。可以对排泄的尿液实施尿液细胞学检查，或可以在膀胱镜检查(“膀胱清洗(bladder washing) ”)时实施尿液细胞学检查。尿液细胞学检查依赖于在局部肿瘤生长过程中流入尿中的恶性细胞的病理学分析(Sullivan, et al. , Am J Transl Res.(2010) 2 (4) : 412-40; Caraway, et al. , Cancer Cytopathol. (2010) 118 (4) : 175-83)。通常通过排泄或从内窥镜检查方法过程中的膀胱清洗获得样品。尿液细胞学检查可以与尿道膀胱镜检查联合使用，用于在认为处于高风险的人中检测膀胱癌，特别是当尿液分析揭示临床相关的血尿症时。可以例如通过离心集中尿样中的膀胱细胞，随后使之与膀胱癌特异性肽接触。在一些实施方案中，生物样品来自活检。在一些实施方案中，生物样品是上皮膀胱组织。在某些情况下，例如在确定是否存在膀胱癌转移的情况下，生物样品可以来自膀胱组织以外的组织。
在一些实施方案中，在与疑似癌性的组织的不同的组织中测量膀胱癌特异性肽配体的结合水平是合适的，例如用来确定是否存在转移。c)确定膀胱癌的存在可以根据本领域熟知的和本文所述的方法来测量膀胱癌特异性肽配体的结合水平。可以利用例如直接或间接标记的检测试剂来检测肽配体的结合水平，例如荧光标记的、放射性标记的或酶标记的膀胱癌特异性肽配体。例如，可以将肽与标记的珠缀合，所述标记的珠例如为可以通过荧光标记、化学发光标记、量子点标记或本领域已知的任何其它标记检测的珠。利用标记的珠的测定在本领域中是熟知的。作为说明性实例，从个体获得尿样，并且通过例如离心集中样品中的细胞。然后，将来自尿样的集中的细胞(包括膀胱细胞)与本文所述的膀胱癌特异性肽配体接触。可选地，将膀胱癌特性肽配体添加于尿样中，而不是首先集中细胞。可以在暴露于肽之后集中细胞。例如，可以通过与标记的珠缀合或连接来直接标记肽。例如，可以用荧光团、化学发光部分或量子点或任何其它可检测的标记来标记珠。与珠缀合的肽便于肽配体与尿样中癌细胞的结合的检测以及与肽配体结合的膀胱癌细胞的集中。随后可以对标记的细胞的存在进行检测和定量。例如，可以利用显微镜或通过流式细胞术来检测包被了与膀胱癌特异性肽配体缀合的珠的细胞。在一些实施方案中，将膀胱癌特异性配体与用于抗体结合的已知表位(例如FLAG-标签或c-myc表位)连接(例如通过化学连接或融合)。可以利用本领域已知的免疫分析来测定单独的肽配体或连接于抗体表位的肽配体，包括利用选择性结合抗体表位或其片段的抗体的免疫组织化学染色、Western印迹、ELISA等。在免疫测定中利用抗体检测妝在本领域中是已知的(参阅例如Harlow & Lane, Using Antibodies:A LaboratoryManual (利用抗体实验室手册)(1998) ; Coligan, et al. , eds. , Current Protocolsin Immunology (现代免疫学实验方案)(1991-2010) ;Goding, Monoclonal Antibodies Principles and Practice (单克隆抗体原理和实践)(3rd ed. 1996);以及 Kohler &Milstein, Nature 256:495-497 (1975).可以利用本领域已知的任何方法来检测膀胱癌特异性肽配体与疑似癌性的膀胱细胞或膀胱组织的结合水平。示例性的方法包括流式细胞术、组织裂解物检测、Western免疫印迹以及免疫组织化学。作为说明性实例，将膀胱组织样品(例如活检)与抗体在足以允许特异性结合的条件(即时间、温度、样品的浓度)下一起孵育，所述抗体能特异性结合单独的膀胱癌特异性肽配体或连接于表位标签的膀胱癌特异性肽配体。在与抗体一起孵育之前，可以任选地固定(例如在甲醛中)和透化组织。如果合适，可以将抗肽抗体暴露于组织样品约0. 5,1. O、
I.5,2. 0,2. 5,3. O小时或过夜约8、10或12小时。然而，孵育时间可以更长或更短，这取决 于例如抗原的组成、样品的稀释度以及孵育的温度。利用稀释度较低的样品和较高温度进行的孵育可以进行较短的时间。孵育通常在室温(约25° C)或在生物学温度(约37° C)下进行，并且可以在冰箱中(约4° C)中进行。根据已知的免疫测定方法，在添加二抗之前进行洗涤来除去未结合的样品。可以直接标记膀胱癌特异性肽配体，或可以用标记的二抗来检测样品中已与肽配体结合的抗体。二抗能结合不同类别或同种型的免疫球蛋白(IgM、IgD、IgG、IgA以及IgE)的恒定区或“C”区。通常，本发明的方法使用针对IgG恒定区的二抗。针对IgG亚类(例如IgGl、IgG2、IgG3以及IgG4)的二抗也可以用于本发明的方法中。可以用任何可直接或间接检测的部分来标记二抗，包括荧光团(即荧光素、藻红蛋白、量子点、Luminex珠、荧光珠)、酶(即过氧化物酶、碱性磷酸酶)、放射性同位素(例如3H、32P、125I、123I、nC、13N、150、18F、82Rb、锝-99m (Tc-99m)、铊-201)或化学发光部分。可以利用生物素和生物素结合部分(即抗生物素蛋白、链霉抗生物素、亲和素)的复合物来放大标记信号。荧光标记的抗人IgG抗体可以从Molecular Probes, Eugene, OR购得。酶标记的抗人 IgG抗体可从 Sigma-Aldrich, St.Louis, MO and Chemicon, Temecula, CA 购得。检测样品中膀胱癌特异性肽配体的结合水平的方法应对应于选择的二抗标记。例如，如果将含有结合的肽配体的组织裂解物转移到适合免疫印迹的膜基底上，则在使用酶标记时，可以利用电子成像仪来定量可检测的信号(即印迹)，或在使用放射性同位素标记时，可以利用X射线胶片显影仪来定量可检测的信号。同样，可以利用免疫荧光显微术或扫描显微镜以及能检测和定量荧光、化学发光和/或比色信号的自动扫描软件来评估进行免疫组织化学的组织样品。此类检测方法在本领域中是熟知的，并且在本文中有描述。 一般的免疫测定和免疫组织化学技术在本领域中是熟知的。优化参数的指导可以见于例如 Wu, Quantitative Immunoassay :A Practical Guide for AssayEstablishment, Troubleshooting, and Clinical Application(测定建立、答疑以及临床应用的实用手册)，2000，AACC Press; Principles and Practice of Immunoassay (免疫测定的原理和应用)，Price and Newman, eds. , 1997, Groves Dictionaries, Inc. ; TheImmunoassay Handbook (免疫测定手册)，Wild, ed.，2005，Elsevier ScienceLtd. ;Ghindilis, Pavlov and Atanassov, Immunoassay Methods and Protocols (免疫测定方法和方案),2003, Humana Press;Harlow and Lane, Using Antibodies:ALaboratory Manual (利用抗体实验室手册)，1998，Cold Spring Harbor LaboratoryPress; Immunoassay Automation:An Updated Guide to Systems (免疫测定自动化更新的系统指南),Chan, ed. , 1996, Academic Press; Dabbs, Diagnostic Immunohistochemistry: Theranostic and Genomic Applications (诊断免疫组织化学治疗诊断以及基因组应用)，2010，Saunders;Renshaw, Immunohistochemistry:Methods ExpressSeries (免疫组织化学方法快递系列)，2007，Scion Publishing Ltd. ; and Buchwalowand B6cker, Immunohistochemistry:Basics and Methods (免疫组织化学基础和方法),2010,Springer。在免疫测定或免疫组织化学测定中，当将来自患者的生物样品与能特异性结合肽配体或表位标签的抗体或抗体片段接触时，可检测的信号(即印迹、荧光、化学发光、颜色、放射性)指示存在膀胱癌特异性肽配体的结合或其结合增加。将可检测的信号与来自膀胱组织或膀胱细胞的正常或非癌对照样品的信号或与阈值进行比较。在一些实施方案中，检测到膀胱癌特异性肽配体结合或增加的结合的存在，例如，当测试样品中肽配体的结合水平的可检测信号高于正常或非癌对照样品中肽配体的结合水平的信号或预定阈值至少约10%、20%、30%、50%、75%时，指示存在癌症或癌症风险增力口。在一些实施方案中，检测到膀胱癌特异性配体的结合水平的增加，并且当测试样品中膀胱癌特异性肽配体的结合水平的可检测信号高于正常或非癌对照样品中膀胱癌特异性肽配体的结合水平的信号或预定阈值至少约I倍、2倍、3倍、4倍或更多倍时，指示存在癌症或癌症风险增加。通常，样品和对照或预定阈值水平来自相同组织类型。在一些实施方案中，将膀胱癌特异性肽配体的结合水平与已知为癌性的对照组织或对照细胞中的膀胱癌特异性肽配体的结合水平进行比较。在这种情况下，当测试生物样品中的膀胱癌特异性肽配体的结合水平等于或大于已知为癌性的阳性对照样品时，则指示癌症。通常，样品和对照或预定阈值水平来自相同组织类型(例如膀胱组织)。可选地，如果测试生物样品中膀胱癌特异性肽配体的结合水平低于阳性癌组织对照中的膀胱癌特异性肽配体的结合水平或预定阈值，则通常不指示癌症的诊断。同样，如果测试生物样品中的膀胱癌特异性肽配体的结合 水平等于或小于正常或非癌对照或预定阈值水平，则不指示癌症的诊断。在一些实施方案中，将膀胱癌特异性肽配体的结合水平测定的结果记录于有形媒介中。例如，可以将本发明诊断测定的结果(例如膀胱癌特异性肽配体结合的存在或增加的存在的观察结果)和确定是否存在癌症或癌症风险增加的诊断记录于例如纸张上或电子媒介中(例如录音磁带、磁盘、⑶、闪存盘等)。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤基于膀胱癌特异性肽配体的结合水平测定的结果，向患者提供所述患者是否存在癌症或癌症风险增加的诊断。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤基于膀胱癌特异性肽配体的结合水平测定的结果，向患者提供或推荐合适的治疗过程。基于本文所述的膀胱癌特异性肽配体与含有膀胱细胞或膀胱组织的生物样品的结合，确定个体中膀胱癌存在的方法可以与其它已知的膀胱癌诊断方法联合进行。7.原位成像方法 本文所述的膀胱癌特异性肽配体可以用于例如膀胱癌的局部可视化方法中，例如在膀胱癌的经尿道切除术(TURBT)过程中。与荧光染料缀合的膀胱癌特异性肽配体可用于本应用。本文所述的膀胱癌特异性肽配体的另一应用是膀胱癌成像检测，其可以补充或减少侵入性且昂贵的膀胱镜检查。可以在疑似患有或已知患有膀胱癌的个体中进行磁共振成像(MRI)和正电子放射断层造影术(PET)。MRI和PET扫描已经广泛用于恶性肿瘤的诊断，并且可用于膀胱恶性肿瘤的诊断和检测。因此，MRI和PET或单光子发射计算机断层显像(single photon emission computed tomography, SPECT)可以用于便于利用与显像剂缀合的本文所述的膀胱癌特异性肽配体的膀胱癌检测，例如，对于MRI，显像剂为氧化铁，对于 PET/SPECT，显像剂为放射性同位素(例如 123I、nC、13N、150、18F、82Rb、锝-99m(Tc_99m)、铊-201)。为了允许原位成像，将连接于合适的显像剂的膀胱癌特异性肽配体与个体中疑似含有或已知含有膀胱癌细胞的组织接触。通过对患者进行合适的成像方法，可以确定成像的组织中膀胱癌细胞的位置和程度。在一些实施方案中，所述方法还包括，例如基于膀胱癌特异性肽配体的结合检测，从组织移除、切除或切掉膀胱癌细胞。与膀胱癌特异性肽配体缀合的磁性颗粒还可以用于获取或移除膀胱癌细胞。用于癌细胞的体外和体内靶向和提取的磁性纳米颗粒-肽缀合物的应用描述于例如 Scarberry, et al. , J Am Chem Soc (2008) 130 (31) : 10258-10262 中。
8.试剂盒本发明还提供了包含本文所述的膀胱癌特异性肽配体的试剂盒。试剂盒中的膀胱癌特异性肽配体的实施方案在本文中做了描述。在一些实施方案中，将膀胱癌特异性肽配体缀合于或连接于标记的珠。另外，试剂盒通常包括公开了膀胱癌特异性肽配体使用方式的说明性材料。在试剂盒中，膀胱癌特异性配体可以经配制用于给药，并且提供在一个或多个单位剂量中。试剂 盒还可以包括其它组分来便于试剂盒所设计针对的具体应用。试剂盒还可以包括常规用于实施具体方法的缓冲液和其它试剂。这类试剂盒和合适的内容物对本领域技术人员而言是熟知的。尽管出于清楚理解的目的，已经通过说明和举例较详细地描述了本发明，但是根据本发明的教导，对本领域技术人员显而易见的是，在不脱离后附权利要求的实质和范围的情况下可以对本发明进行某些改变和修改。
实施例提供下述实施例是为了说明，并非限制请求保护的本发明。实施例I :膀胱癌特异性配体的发现材料和方法最初的和集中的OBOC文库的合成在固相TentaGel S NH2 树脂(Rapp Polymere Gmbh, Germany)上，通过“分裂-混合合成(split-mix synthesis)” 方法(Lam, et al. , Nature, (1991) 354:82-84; Lam, etal. , Chem Rev, (1997)97:411-448;以及Peng, et al.，Nat Chem Biol, (2006)2:381-389)，合成OBOC文库。通过标准固相肽合成技术，利用9-芴甲氧羰基(Fmoc)化学法和N-羟基苯并三唑(HOBt)/N，N’ - 二异丙基碳酰二亚胺(DIC)偶联，合成肽模拟物的肽部分。并且，用茚三酮测试证实偶联的完成。将珠于4° C下保存在70%乙醇中，直到使用。细胞从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection, Manassas, VA)购买 4 种膀胱癌细胞细胞系，包括 5637 (HTB-9)、SCaBER,TCCSUP(HTB-5)以及T24(HTB-4)。正常尿道上皮细胞的分离、表征和保持在之前已有详细描述(Bagai，et al. , J Biol Chem, (2002) 277:23828-23837)。利用 Ficoll-Paque 梯度方法，从健康供体的外周血制备正常的外周血单核细胞。根据制造商的方案，将从膀胱切除术获得的膀胱癌组织切成片、用胶原蛋白酶于37° C消化1-2小时，并且将其过滤通过40-μ m的过滤器,从而制备单细胞悬浮液。然后,用Ficoll-Paque梯度方法(800g, 30分钟，4° C)分离肿瘤细胞。在采集样品之前，从每一患者或健康供体获得知情同意书。标为K9TCC、K9TCC-AxA、K9TCC_AxC、K9TCC_Nk 以及 K9TCC_In 的 5 种犬膀胱移行细胞系由普渡大学(Purdue University)的 Deborah ff. Knapp (Dhawan, et al. , UrolOncol, (2009)27:284-292)惠赠。将这些细胞保持在含10%FBS和2mM谷氨酰胺的DMEM/F12中，并于37° (、5%0)2中孵育。OBOC文库中膀胱癌特异件配体的筛诜在筛选之前，用双蒸水和磷酸缓冲盐溶液(PBS)充分洗涤珠。用胰蛋白酶/EDTA或Detach试剂盒(PromoCell, Heidelberg, Germany)使膀胱癌细胞和正常尿道上皮细胞从培养皿脱离，用对应的培养基进行洗涤，以IO6个细胞/ml重悬，并与OBOC珠于皮式培养皿中、37° C下、在湿润的C02培养箱内振荡孵育^Orpm)。被细胞结合的珠在显微镜下看起来像花环，中央的珠覆盖有细胞层。在倒置显微镜下，用移液器挑选阳性珠，用QuanidineHCl (8M, 20min)进行处理以去除珠表面的细胞和蛋白，并用相同细胞进行第二轮孵育以确认结合。如之前所述(Peng, et al.，Nat ChemBiol, (2006) 2:381-389)，仅将在两轮中都具有细胞结合的那些珠送去进行氨基酸测序。肽和肽-生物素的合成用于生物学测试的溶液相PLZ4和PLZ4-生物素的合成化学与利用HOBt/DIC偶联 的文库的合成化学相似。用Rink酰胺树脂作为固相支持体来制备具有羧基酰胺的化合物。荧光显微术将膀胱癌细胞和正常尿道上皮细胞(2X104个细胞/孔)接种于载片池上。当细胞生长融合超过70%时，将它们用PBS洗漆，并用3%BSA-PBS于4° C封闭I小时，并与肽-生物素缀合物(I μ Μ) 一起于4° C、在TBS缓冲液中孵育I小时。随后用TBS将细胞洗涤3次，并与 FITC-链霉抗生物素(O. 5 μ g/ml) (ZYMED, South San Francisco, California) 一起孵育。洗涤细胞，并利用奥林巴斯倒置荧光显微镜(20倍)检查。流式细胞术所有下述步骤在冰上进行。将5 X IO5个5637细胞用Iml冷PBS (pH7. 4) -BSA (1%)洗涤3次，用300μ I冷BSA(5%)-PBS(pH 7.4)重悬，随后在冰上孵育I小时。将细胞离心，并用 50μ I 的 800、400、200、100、50、25、10、5、2· 5、1、0· I 以及 ΟμΜ 的 PLZ4-生物素溶液悬浮，并在冰上孵育I小时。将未用PLZ4-生物素处理的细胞作为对照。用Iml冷PBS-Tween-20 (0. 05%)缓冲液洗涤6次后，用50 μ I链霉抗生物素(SA) -PE (1:500配制于 PBS-BSA 1% 中)(lmg/ml, Invitrogen, Carlsbad, CA)重悬细胞，在冰上孵育 I 小时,用PBS (pH 7. 4)洗涤 3 次，用 500 μ I PBS (pH 7. 4)重悬，以及利用 Coulter Epics XL-MCL 流式细胞仪(Beckman Coulter, Inc.)进行分析。实验重复3次。平均值显示在图4中。体内和离体小鼠成像通过将PLZ4-生物素缀合物与链霉抗生物素(SA)-CY5. 5 (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA) 一起孵育来制备PLZ4-CY5. 5缀合物。一个链霉抗生物素分子可以结合多至4个生物素分子。为了确保至少一个PLZ4-生物素分子结合SA-CY5. 5，将PLZ4-生物素与SA-Cy5. 5以5:1的摩尔比于4° C混合I小时。利用体外细胞结合测定来证实突光标记。无胸腺裸小鼠购自Harlan Laboratories (Indianapolis, IN)。遵守规章指导并根据方案进行所有实验。在从患者获得知情同意后，由病理学者从膀胱切除术获得原代膀胱癌样本。该方案获得UC Davis IRB的许可。将原代癌组织切碎，并与胶原蛋白酶于37° C旋转孵育I小时。利用通过40 μ m过滤器的过滤获得单细胞悬浮液。将部分的原代细胞与0B0C珠一起孵育来确定细胞结合(图3)。根据制造商的说明书(BDBiosciences, Sparks, MD),将原代膀胱癌细胞与基质胶混合,并皮下注射到小鼠的一侧肩部。在成像时，经测量肿瘤直径为约0. 5 - I. 0cm。利用戊巴比妥(60mg/kg)腹膜内注射来麻醉小鼠，并利用配备了 625nm激发通带滤光片和700nm发射的柯达多模式成像系统IS2000MM(Kodak)进行成像。曝光时间为每幅图30秒。利用成像工作站(imaging station)IS2000MM软件(Kodak, Rochester, NY)分析图像。在体内成像后，用过量C02对小鼠实施安乐死。切除肿瘤和其它正常器官和组织，并用上文所述的柯达成像系统进行成像。数据处理和统计以2个或3个平行样品来重复实验。将平均值提供于此。为了确定肿瘤对比，利用柯达ID图像分析软件(Kodak)、借助于目的区功能，计算肿瘤区和正常组织区的平均荧光强度，然后通过整合肿瘤和正常组织区中相等区域的荧光强度，基于NIRF图像的半定量 信息绘制伪彩色比例(图5)。结果膀胱癌特异性配体的鉴定用全细胞珠结合测定筛选能结合膀胱癌细胞培养物的肽的文库(图I)。针对4种膀胱癌细胞系(3种移行细胞癌(TCC)系T24、TCCSUP和5637和一种鳞状细胞系SCaBER)中的每一种，筛选约150，000个文库珠(肽)。筛选所用的两个环式随机肽文库为7-merCX1X2X3X4X5X6X7C (SEQ ID NO: 15)和 5_mer c (U/Z) 5c (SEQ ID NO: 16)，其中 “c” 表示 D-型半胱氨酸，“X”表示除了半胱氨酸以外的19种天然L-型氨基酸，“U”表示8种非天然氨基酸，“Z”表示除了精氨酸、半胱氨酸和赖氨酸以外的17种L-型氨基酸。每个肽在氨基末端和羧基末端含有2个侧翼D-型半胱氨酸残基。通过二硫键将这些肽环化，以便更有效地在细胞结合中暴露氨基酸。最初，用每一细胞系筛选约150，000个文库珠(肽)。具有结合癌细胞表面受体的配体的珠被癌细胞包被。分离阳性珠(即包被有细胞的珠)，并用相同的细胞进行第二轮筛选以去除假阳性珠。根据这些筛选，鉴定了 28种能结合4种细胞系之一的肽。在这28种肽中，选择结合膀胱癌细胞但是不结合不同来源的12种细胞系中大多数细胞系的21种肽，且针对培养的原代正常尿道上皮细胞(Bagai, et al. , J Biol Chem, (2002)277:23828-23837)筛选这21种肽。这些配体中具有序列cQDGRMGFc (SEQ ID NO: 12)的一种配体结合所有3种膀胱TCC细胞系(图2A-C)，但不结合正常尿道上皮细胞(图2D)。将该配体命名为PLZ4。PLZ4不结合全血细胞(图2E)、外周血单核细胞(PBMC，图2F)或成纤维细胞(图2G)，这表明膀胱内这些混杂细胞不影响PLZ4与膀胱癌细胞的结合。这与PLZ4不结合不同来源的12种细胞系中的10种细胞系的观察结果一致。PLZ4不结合从采集自4名连续患者的尿样分离的细胞，所述患者没有患膀胱癌的证据，但是已用BCG膀胱内疗法主动治疗(图2H)。这表明，PLZ4可能不结合在BCG治疗的患者中通常观察到的有炎症的细胞。包被有PLZ4的珠可以结合患者的膀胱肿瘤细胞培养的已建立细胞系上的细胞表面分子可能不同于原代膀胱癌细胞上的那些分子。评估PLZ4是否能结合患者的膀胱癌细胞。包被有PLZ4的珠可以结合患者的原代膀胱癌细胞(图3A和B)。到目前为止，PLZ4可以结合来自所测试的所有5个新鲜膀胱癌样本的细胞。在一名患者中，获得来自同一膀胱切除术样本的正常组织和膀胱癌组织。包被有PLZ4的珠可以结合癌症样本的细胞(图3B)，但不结合来自同一膀胱的正常样本的细胞(图 3C)。尿中的酸性环境可能改变配体的3-D结构，并且影响配体结合。在此，确定癌症特异性珠是否可以结合尿液中的5637 TCC癌细胞。在37° C下，将细胞与珠在pH 6. O的尿液中孵育4小时。4小时孵育是用于模拟患者的体内尿液留存，并允许构象变化和蛋白酶消化。PLZ4仍然能结合尿液中的细胞(图3D)。
犬天然发展出通常为侵袭性的膀胱癌。如果PLZ4能结合犬膀胱癌细胞，则可以在进行人类的临床研究之前，在患有天然发生的膀胱癌的犬中进行临床前研究。已经测试了 5种犬癌细胞系。PLZ4-FITC复合物能结合所有5种犬膀胱癌细胞系(图3E)。当利用非小细胞肺癌细胞系A549细胞时或当在FITC复合物中使用白血病特异性配体代替PLZ4时，未检测到结合。具有PLZ4的人膀胱癌细胞的细胞分选和荧光检测接下来，确定荧光细胞分选是否可以用于鉴定膀胱癌细胞。合成通过亲水连接物与生物素缀合的PLZ4肽。然后将生物素化的PLZ4与链霉抗生物素-PE —起孵育，从而通过生物素与链霉抗生物素的强结合而产生PLZ4-PE缀合物。将新鲜的用胰蛋白酶消化的膀胱癌5637细胞的悬浮液与PLZ4-PE缀合物一起孵育，并进行流式细胞术细胞分选。对于5637细胞，观察到荧光的浓度依赖性增加(图4A)。结合亲和力(Kd)为约30 μ M。接着，确定荧光标记的PLZ4是否能结合膀胱癌细胞。利用与PLZ4-PE缀合物相同的方法产生5637缀合物，并用于对生长于载片池上的5637、TCCSUP、T24以及正常尿道上皮细胞进行染色。在对照实验中，添加链霉抗生物素-FITC，而不添加生物素化的配体。与对照细胞相比，在荧光显微镜下，对5637、TCCSUP和T24细胞可检测到强荧光信号(图4B)。用相同的染色条件，对正常尿道上皮细胞未观察到显著结合。携带膀胱癌异种移植物的裸鼠的体内成像为了研究PLZ4是否可用于体内膀胱癌检测和靶向治疗，使用具有膀胱癌异种移植物的小鼠的体内光学成像，所述膀胱癌异种移植物由来自经历了膀胱切除术的患者的原代膀胱癌组织发展而来。近红外荧光(NIRF)染料Cy5. 5允许深层组织成像，这是因为近红外光具有高穿透力、低组织吸收率和散射率。当肿瘤异种移植物经测量达到5-10mm(移植后4-5周)时，通过尾静脉注射PLZ4-Cy5. 5缀合物(7nmol)。在接种后O、1、2、4、8、16、24小时对小鼠进行成像。肿瘤对PLZ4-Cy5. 5的摄取大大高于正常组织和接受SA_Cy5. 5的小鼠的肿瘤区的摄取(图5A和B)，这种差异从注射后2小时开始并在4小时达到最大。为了进一步证实PLZ4_Cy5. 5复合物的体内摄取，在静脉内注射24小时后，对切除的肿瘤和器官进行离体成像。PLZ4-CY5. 5复合物主要累积在肿瘤异种移植物和肾中，而在包括膀胱在内的其它器官中未观察到显著的摄取(图5C和D)。在仅注射SA-CY5. 5的对照小鼠中，在肾中检测到强荧光信号(白色伪彩色)，这表明PLZ4-Cy5. 5复合物在肾中的累积可能是继于肾对SA-Cy5. 5的非特异性摄取或捕获(图OT)。进行组织化学染色，并证实肿瘤异种移植物是膀胱移行细胞。PLZ4与靶标整联蛋白的结合—些研究表明，含有NGR基序的肽能结合整联蛋白。在此，将表面携带PLZ4肽的OBOC珠与转染了不同整联蛋白的K562细胞一起孵育。K562细胞表达内源性α 5 β I整联蛋白。PLZ4结合转染了 α5β3整联蛋白的Κ562细胞，但不结合母体Κ562细胞或转染了其它整联蛋白的细胞(图6Α)。从最初的筛选获得的几个其它配体也含有DGR基序。然而，仅PLZ4是膀胱癌特异性的，这表明除了 DGR外的其它氨基酸决定了结合特异性。为了鉴定哪些氨基酸参于决定细胞结合和结合特异性，联合进行“丙氨酸步移”和彩虹珠编码方法(Luo, et al. , J Comb Chem, (2008) 10:599-604)。氨基酸天冬氨酸(D,X2 位置)、精氨酸(R, X4)以及苯丙氨酸(F，X7)对于细胞结合是重要的。用丙氨酸取代这些氨基酸中的任何氨基酸完全消除了肽与5637细胞的结合(图6B)。X3和X6位置的甘氨酸残基(G)对于细胞结合是重要的，因为这两个氨基酸中的一个的取代显著降低但不会消除肽与5673细胞的结合。X5位置的蛋氨酸可以被取代为许多其它氨基酸，而不破坏结合亲和力。基于该分析，N末端的3个氨基酸(D、G和R)以及C末端的2个氨基酸(G和F)决定结合特异性。因此，结合袋(binding pocket)可能是三叶草形状的一叶为N末端3个氨基酸,一叶为C末端的2个氨基酸，以及中间的袋。因此通过向X5位置添加不同数量的甘氨酸残基中间结合袋的深度。可以添加2个甘氨酸残基来填充中央袋，而不会显著影响细胞结合(图6C)。添加超过4个甘氨酸完全消除PLZ4与靶细胞的结合。讨论膀胱癌特异性配体可以改善膀胱癌的诊断和控制。首先，这些配体可以用于肿瘤定位。约75-80%的膀胱癌病例是在非侵袭性阶段诊断出的，并通常用TURBT治疗。然 而，无论泌尿科医师的专业技术如何，可以在约三分之一的病例中发现不完全切除(Herr，JUrol, (2005) 174:2134-2137。5-氨基酮戊酸(ALA)与膀胱镜检查的联合已经用于肿瘤定位(Daniltchenko, et al. , J Urol, (2005) 174:2129-2133)。非癌尿道上皮细胞对 ALA 的非特异性摄取，特别是在BCG治疗的有炎症的膀胱中，会引起高背景荧光，这会干扰利用膀胱镜的癌症检测(Grossman, Society of Urological Oncology Winter Meeting 2005 (Podiumpresentation), Bethesda, Maryland. , 2005)。PLZ4可以特异性结合膀胱癌细胞,但不结合正常尿道上皮细胞、来自含有癌症的同一膀胱的正常细胞或来自用BCG主动治疗的患者的细胞。已经证实，缀合FITC的PLZ4能对膀胱癌细胞进行染色，这表明这种配体可以用于非侵袭性膀胱癌的荧光检测和肿瘤定位。我们的PLZ4配体可以结合pH为6的尿液中的癌细胞，这表明PLZ4可以用于酸性的尿液环境中。因为膀胱与人体的其它部分是相对隔离的，因此缀合荧光体的癌症特异性配体的膀胱内滴注会引起很小的或不引起不期望的副作用。膀胱癌特异性配体可以用于针对非侵袭性膀胱癌和晚期膀胱癌的靶向治疗。BCG的膀胱内滴注或化疗已经用来减少膀胱癌复发的风险。然而，该疗法仍然与显著的复发风险有关(Herr, et al. , J Clin Oncol, (1995) 13:1404-1408 ；和 Herr, et al. , JUrol, (1989) 141:22-29)。可以将PLZ4与化疗药物连接起来通过膀胱内滴注或通过静脉内注射用于靶向治疗。膀胱癌特异性配体PLZ4可以用于非侵袭性膀胱癌或晚期膀胱癌的成像检测。一旦膀胱癌已经转移，则预后很差，且膀胱切除术无法治愈。诸如计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)的现有成像方式不是灵敏的和/或特异的。尽管已经在临床测试了 18F-FDG-PET用于膀胱癌分期的用途，但其并未在临床上得到广泛应用，因为其灵敏性和特异性并不令人满意(Drieskens, et al. , Eur J Nucl Med MolImaging, (2005) 32:1412-1417;和 Liu, et al. ,Urol Int, (2006)77:69-75)。已经证明，通过与NIRF Cy5. 5连接，PLZ4可用于检测与转移性膀胱癌相似的皮下肿瘤异种移植物(图5)。对于该成像研究而言，仅需要7nmol的癌症特异性配体。癌症特异性配体可以增强射线照相检测的检测特异性和灵敏度，从而替代或补充用于膀胱癌的诊断和随访的昂贵的膀胱镜检查方法。具有天然发生的膀胱癌的犬是在人类临床试验前进行研究的出色模型。在大多数癌症研究中，使用通常位于皮下空间具有肿瘤异种移植物的癌症模型。然而，该模型可能无法反映实际上发生的情况。PLZ4结合所测试的所有5种犬膀胱癌细胞系，这提示天然发生的犬膀胱癌可以用于临床前研究。还测试并发现PLZ4可以结合从一条病犬新鲜切除的原代犬膀胱癌细胞。进一步的研究将在天然发生犬膀胱癌的犬中用PLZ4进行临床前研究。DGR和一些其它氨基酸决定PLZ4的结合特异性。PLZ4含有DGR。RGD的反向基序结合几种整联蛋白异二聚体，包括 α5β3 和 α 5 β 5 (Ruoslahti, et al. , Annu Rev Cell DevBiol, (1996) 12:697-715)。DGR基序是结合分泌型卷曲相关蛋白的另一蛋白中结合基序的核心(Chuman, et al. , Peptides, (2004)25:1831-1838)。之前还鉴定为低亲和力整联蛋白结合基序的(D/N)GR基序是在腺相关病毒的壳体上被鉴定出的，并且对于病毒壳体-整联蛋白5 β I相互作用和细胞进入是重要的(Koivunen, et al. , J Biol Chem, (1993)268:20205-20210, 1993; Koivunen, et al. , J Cell Biol, (1994) 124:373-380 ;以及 Asokan, etal. , J Virol, (2006)80:8961-8969)。PLZ4 不结合表达 5 β I 整联蛋白的母体 K562 细胞，但是结合转染了 α 5β 3整联蛋白的Κ562细胞(图6Α)。IsoDGR还结合肿瘤脉管系统中的α 5β 3(Curnis, et al. , Cancer Res, (2008)68:7073-7082)。几种肽含有相同的 DGR 基序， 但是仅PLZ4是膀胱癌特异性的。丙氨酸步移证实除了 DGR以外，G(甘氨酸，X6)和F(苯丙氨酸，X7)对于细胞结合也是重要的。这两个氨基酸的改变消除或极大地降低PLZ4与膀胱癌细胞的结合(图6B)。总之，0B0C组合文库方法已经用于鉴定PLZ4膀胱癌特异性配体。临床应用包括用于指导TURBT的肿瘤定位、非侵袭性膀胱癌和转移性膀胱癌的成像检测和靶向药物递送。实施例2 :犬膀胱癌动物模型的证实为了确定PLZ4与犬TCC细胞系的结合，进行全细胞结合测定。在TentaGel S NH2 树脂珠(Rapp Polymere Gmbh, Germany)(Pegram, et al. ,JClinOncol (1998) 16:2659-2671)上合成PLZ4，并将其与5种不同的犬癌细胞系的IO6个细胞/ml的单细胞悬浮液一起孵育，所述5种细胞系包括K9TCC-PU、K9TCC_PU_AxA、K9TCC-PU-In、K9TCC-PU-AxC 以及 K9TCC_PU_Nk(由普渡大学(Purdue University, WestLafayette, IN, USA)的Deborah Knapp惠赠)。阴性对照为从犬获得的正常尿道上皮细胞，所述犬是由于非膀胱相关病症被施以安乐死的。人膀胱癌细胞系5637作为阳性对照。如果PLZ4结合悬浮的细胞，则珠表面被细胞覆盖。超过95%的珠表面被5637和K9TCC细胞覆盖(分别为图7A-a和b)。相比而言，当将珠与正常犬膀胱尿道上皮细胞(图7A-c)或来自患有慢性膀胱炎的犬的膀胱细胞(图7A-d) —起孵育时，则无细胞结合，且观察到圆润光滑的珠表面。为了进一步评估PLZ4对犬TCC细胞系的结合，进行了亲和荧光测定。合成PLZ4并将其与生物素共价缀合。将犬TCC细胞系培养于载片池上。用接触式制备涂片制备来自犬的正常尿道上皮细胞，其中将犬正常的膀胱组织在载片的表面上接触并轻轻地摩擦。在固定后，将载片与PLZ4-生物素一起孵育，并用链霉抗生物素探测。与未进行肽孵育的对照(图7B a)相比，所有5种犬TCC细胞系都表现出弥散的细胞膜染色(图7B b-f)。为了进一步定量结合亲和力，将K9TCC-PU和K9TCC_PU_In细胞接种于96孔板中、固定、并与浓度渐增的PLZ4-生物素一起孵育，随后与抗生物素蛋白-HRP —起孵育。如图8A所示，PLZ4以剂量依赖方式表现出对犬TCC细胞系的结合。对于K9TCC-PU和K9TCC_PU_In，PLZ4的Kd5tl值(使50%的细胞表面受体饱和的PLZ4浓度)分别为21. 31和10. 29 μ Μ。 结合于细胞表面分子上的配体可以启动细胞信号转导，并对细胞发挥生物学作用。测定PLZ4对细胞活力和增殖的影响，因为其可能具有潜在的临床应用。将K9TCC、KOTCC-PU-In和KOTCC-PU-Nk细胞接种于96孔板中，与不同浓度的PLZ4肽一起孵育或不与PLZ4肽一起孵育。在与PLZ4 —起培养48小时后，根据制造商(Cayman Chemical, AnnArbor, MI, USA)的方案，进行WST-8细胞增殖测定。与用PBS对照处理的细胞相比，与不同浓度的PLZ4 —起培养的这3个细胞系的细胞增殖/活力并无显著变化(图8B)。还测定了 PLZ4对犬TCC异种移植物小鼠模型的肿瘤特异性归巢/引导特性以及体内生物分布/结合特异性。将与基质胶混合的TCC-PU-In细胞植入8周龄的裸鼠3-4周。当异种移植物的大小为直径O. 5-0. 8cm时，随机选择小鼠并在麻醉的情况下用100μ l(7nmol)预孵育的PLZ4-生物素-链霉抗生物素_Cy5. 5复合物或链霉抗生物素-Cy5. 5染料进行注射。在注射后0、1、3、6以及12小时，采集全身图像(图9a)。信号的大量累积在注射PLZ4-Cy5. 5复合物的小鼠的肿瘤位点以时间依赖性方式累积，在12小时观察到最大信号。相比之下，在接受链霉抗生物素_Cy5. 5的对照小鼠中，检测到肿瘤对Cy5. 5染料的可忽略的荧光摄取。为了确定是否存在任何其它能非特异性摄取注射的染料复合物的重要器官，在注射后12小时，对小鼠实施安乐死，切除重要器官和癌症异种移植物用于离体成像。即使在接受链霉抗生物素_Cy5. 5的对照小鼠中，肝和肾都表现出相当高的信号，这表示非特异性摄取(图9A)。与来自用链霉抗生物素_Cy5. 5处理的对照小鼠的肿瘤异种移植物相比，在将荧光针对肝(3. 2倍，p=0. 003)和肾(3. 8倍，p〈0. 001)进行标准化后，来自接受PLZ4-Cy5. 5的小鼠的异种移植物累积显著更高的荧光信号(图9B)。在包括膀胱在内的其它器官中未观察到显著的荧光摄取。总之，这些数据表明，PLZ4在体内表现出针对TCC异种移植物的出色的归巢特性。本研究表明，人膀胱癌特异性配体也可以靶向于犬膀胱TCC细胞。这些发现不仅对于人类应用的药物研发是重要的，而且对于犬膀胱癌的诊断和治疗也是重要的。在人类应用的药物研发中遇到的一个主要问题是缺少合适的动物模型。具有肿瘤异种移植物的免疫功能低下的小鼠最常用作代替。从生理学上而言，小鼠异种移植物模型在本质上不同于人类患者中天然发生的癌症。最常用的异种移植物模型是皮下异种移植物，而对于大多数人类癌症，即使在很晚阶段，也很少转移到皮下空间。此外，由于异种移植物模型中快速的肿瘤形成(数周)，局部脉管系统的形成和可通过性可以显著不同于可能需要数月至数年才发展出的天然发生的癌症的脉管系统。本研究证明，PLZ4也可以在体外和体内结合犬膀胱癌细胞(图7和9)。还发现，PLZ4可以结合来自一条犬的膀胱TCC临床样本的癌细胞，但不结合来自另一临床犬的膀胱淋巴样增生样本(数据未显示)。本发现表明，膀胱癌特异性配体的临床前研究可以在患有天然发生的膀胱癌的犬中进行。PLZ4的一项主要应用是膀胱癌经尿道切除术(TURBT)过程中的膀胱癌局部显示。膀胱癌的局部显示是在临床上作用重大，这是因为在高达三分之一的TURBT之后的病例中观察到不完全切除，而不完全切除与治疗后膀胱癌的高复发有关。利用5_氨基酮戍酸(ALA)的突光膀胱镜检查已经用于这一目的(Daniltchenko, et al. JUrol (2005) 174:2129-2133)。但是非癌尿道上皮细胞对ALA的非特异性摄取，特别是在有炎症的膀胱中，会妨碍其广泛的临床应用。我们之前的发现表明，PLZ4可以结合pH 6.0的尿液中的膀胱癌细胞，且PLZ4不结合从用卡介苗主动治疗的患者的尿样中收集的细胞。因此，与荧光染料缀合的PLZ4是该应用的出色的候选者。已经研发了原位小鼠膀胱癌模型。由于体型的限制，用膀胱镜检查在小鼠(甚至大鼠)中进行临床前研究是不太可能的。膀胱镜检查已常规用于诊断犬的膀胱病症。PLZ4的10. 29和21. 31 μ M的Kd5tl可以通过局部膀胱内输注而容易地实现。PLZ4的另一应用是膀胱癌的成像检测，其可以补充或减少侵入性的且昂贵的膀胱镜检查。可以在小鼠中进行微MRI (MicroMRI)和微PET (microPET)。由于原位小鼠膀胱癌模型的体型很小，因此小鼠中肿瘤的大小、数量和位置的鉴别根本是不可能的，并且不能转移到人类患者。此外，由于膀胱的位置接近外部成像装置、组织吸收和散射少，因此小鼠中的成像研究不适于诸如同人类患者的大型动物。MRI和PET扫描已经广泛用于犬恶性肿瘤的诊断。因此，可以确定是否可以用MRI和PET或SPECT来便于利用与显像剂缀合的PLZ4检测膀胱癌，例如，对于MRI而言显像剂为氧化钛，对于PET/SPECT而言显像剂为放射性同位素。在本发明的体内研究(图9)中，仅使用7nmol PLZ4_Cy5. 5 (相当于在75Kg患者中使用20mg PLZ4)，且观察到很少的非特异性摄取。这与我们之前的发现一致，即，PLZ4仅结合12种不同组织/癌症来源的人细胞系中的一种，且不结合可能存在于膀胱内的任何混杂细胞，例如正常尿道上皮细胞、全血、外周血单核细胞(PBMC)、成纤维细胞以及血管内皮细胞。该特异性结合可以用于利用PLZ4缀合物的体内引导。总之，以PLZ4为例进行说明的本发明的人膀胱癌特异性配体也可以结合犬膀胱癌细胞。因此，PLZ4作为人类诊断剂和治疗剂的临床前研究也可以在患有天然发生的膀胱TCC的犬中进行。以PLZ4为例进行说明的本文所述的人膀胱癌特异性配体也可以用于犬膀胱癌的控制。应当理解，本文所述实施例和实施方案仅用于说明目的，且根据所述实施例和实施方案进行的各种修改或变化对本领域技术人员是显而易见的，并包括在本申请的实质和范围以及后附权利要求的范围内。在此将本文所引用的所有出版物、专利以及专利申请通过援引整体并入，用于所有目的。非正式序列表SEQ ID NO: I-X1DGRX5GF,其中X1是除了半胱氨酸以外的任何氨基酸(即A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y) ;X5 是除了半胱氨酸以外的任何氨基酸(A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y)。SEQ ID NO: Z-X1DGRX5GF,其中X1是Gin、Gly或Ala ；X5是除了半胱氨酸以外的任何氨基酸(即 A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y)。SEQ ID NOJ-X1DGRX5Gf,其中 X1 是任何氨基酸；X5 是 Met、Lys、Gly、Ala 或Gly-Gly。SEQ ID NOM-X1DGRX5Gf,其中 X1 是 Gin、Gly 或 Ala ;X5 是 Met、Lys、Gly、Ala 或Gly-Gly。 SEQ ID NO:5 - QDGRMGFSEQ ID NO:6 - QDGRKGFSEQ ID NO: 7- QDGRKeGF,其中Ke表示侧链连接了甘氨酸残基的赖氨酸残基。SEQ ID NO: 8 - X(1_5)X6DGRX7GFX(8_12)，其中 X(1_s 和父(8_12)不存在或为任何氨基酸(SPA、C、D、E、F、G、H、I、K、L、Μ、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y) ；X6 和 X7 是除了半胱氨酸以外的任何氨基酸(即 A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y)。SEQ ID NO:9 - X1X2X3DGRX4GFX5X6，其中 X1J2J5J6 不存在或为任何氨基酸(即 A、
C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y);X3 和 X4 是除了半胱氨酸以外的任何氨基酸(即 A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y)。SEQ ID NO: 10 - CX1DGRX5GFc,其中X1是除了半胱氨酸以外的任何氨基酸(即A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y) ;X5是除了半胱氨酸以外的任何氨基酸(即A、
D、E、F、G、H、1、1(、1^、]\1、队？、0、1 、5、1\￥、胃、￥)，且。是0-型半胱氨酸。SEQ ID NO: 11 - cQDGRKGFc，其中 c 是 D-型半胱氨酸。SEQ ID NO: 12 - cQDGRMGFc，其中 c 是 D-型半胱氨酸。 SEQ ID NO: 13 - CQDGRK(ei_6)FC，其中c是D-型半胱氨酸，其中K(ei_6)表示侧链连接了 1-6个甘氨酸残基的赖氨酸残基。SEQ ID NO: 14 - CQDGRMGFCSEQ ID NO: 15 - CX1X2X3X4X5X6X7C，其中X是除了半胱氨酸以外的任何天然L-型氨基酸(即 A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y);且 c 是 D-型半胱氨酸。SEQ ID NO: 16_c (U/Z) i (U/Z) 2 (U/Z) 3 (U/Z) 4 (U/Z) 5c-其中 U 是非天然氨基酸，且 Z是除了精氨酸、半胱氨酸以及赖氨酸以外的任何天然L-型氨基酸(即A、D、E、F、G、H、I、L、Μ、N、P、Q、S、T、V、W、Y)。SEQ ID NO: H-CX1DGRX5GFC,其中X1和X5是除了半胱氨酸以外的任何氨基酸(例如，A、D、Ε、F、G、H、I、K、L、Μ、N、P、Q、R、S、Τ、V、W、Y)。
权利要求
1.包含氨基酸序列X1DGRX5GF的肽，其中X1和X5是任何氨基酸，其中所述肽的长度不超过10个氨基酸且能结合膀胱癌细胞。
2.包含氨基酸序列X1DGRX5GF的肽，其中X1和X5是任何氨基酸，其中 i)一个或多个氨基酸残基是D-型氨基酸； ii)所述肽在N末端、或C末端、或N末端和C末端包含保护基； iii)所述肽是完全逆反的或部分逆反的； iv)所述肽包含氨基酸序列X1DGRX5GF(SEQID NO: I)的2个或更多个重复；或 v)所述肽是环化的。
3.如权利要求1-2中任一项所述的肽，其中X1是Gin、Gly或Ala。
4.如权利要求1-3中任一项所述的肽,其中X5是Met、Lys>Gly、Ala或Gly-Gly0
5.如权利要求1-4中任一项所述的肽，其中所述肽具有氨基酸序列QDGRMGF。
6.如权利要求1-5中任一项所述的肽，其中所述肽不结合正常的膀胱组织。
7.如权利要求1-6中任一项所述的肽，其中所述肽在氨基末端和/或羧基末端还包含1-5个侧翼氨基酸残基。
8.如权利要求1-7中任一项所述的肽，其中所述肽在氨基末端还包含半胱氨酸残基且在羧基末端还包含半胱氨酸残基。
9.如权利要求1-8中任一项所述的肽，其中所述肽与治疗部分或可检测的标记连接。
10.如权利要求9所述的肽，其中所述可检测的标记是珠、荧光团、化学发光部分、磁性颗粒、金属颗粒或放射性同位素。
11.如权利要求9所述的肽，其中所述治疗部分是免疫球蛋白的Fe部分、细胞毒素或抗癌剂。
12.检测膀胱癌存在的方法，包括使膀胱细胞或膀胱组织与与可检测的标记连接的权利要求1-8中任一项所述的肽接触，并检测所述肽与所述膀胱细胞或膀胱组织的结合，其中检测出所述肽与所述膀胱细胞或膀胱组织的结合指示膀胱癌。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述肽连接于可检测的标记。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述可检测的标记选自珠、荧光团、化学发光部分、磁性颗粒、金属颗粒或放射性同位素。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述膀胱细胞或膀胱组织是在体外的。
16.如权利要求12所述的方法，其中所述膀胱细胞或膀胱组织位于尿样中。
17.如权利要求12所述的方法，其中所述膀胱细胞或膀胱组织是在体内的。
18.如权利要求12所述的方法，其中在个体内原位检测所述膀胱细胞或膀胱组织。
19.抑制或阻止有需要的个体中膀胱癌细胞生长的方法，包括使膀胱组织与连接于治疗部分的权利要求1-8中任一项所述的肽接触，其中所述肽结合膀胱癌细胞，且所述治疗部分抑制或阻止所述膀胱癌细胞的生长。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述个体是哺乳动物。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述治疗部分是免疫球蛋白的Fe部分、细胞毒素、抗癌剂或放射性同位素。
22.如权利要求19所述的方法，其中将所述连接于治疗部分的肽通过静脉内、肿瘤内或尿道内的方式给予所述个体。
全文摘要
本发明涉及包含氨基酸序列X1DGRX5GF(SEQ ID NO:1)的膀胱癌特异性配体肽和其使用方法，例如，用于膀胱诊断的成像检测、用来指导膀胱癌经尿道切除术的肿瘤定位、能够代替或补充昂贵的膀胱镜检查的初始治疗后随访的膀胱癌成像检测、转移性膀胱癌的成像检测以及浅表性膀胱癌和转移性膀胱癌的靶向治疗。
文档编号G01N33/574GK102639555SQ201080052434
公开日2012年8月15日 申请日期2010年9月23日 优先权日2009年9月24日
发明者基特·S·拉姆, 张洪勇, 欧鲁拉努·H·艾纳, 潘崇贤 申请人:加利福尼亚大学董事会