Cystatin SN与CYFRA21-1在制备诊断和预示食管癌标志物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN（Cystatin?SN）与细胞角蛋白19片段21-1（CYFRA21-1）的联合应用，具体为Cystatin?SN与CYFRA21-1在制备诊断和预示食管癌的标志物中应用，本发明还公开了食管癌标志物的捕获剂和含有该捕获剂的试剂盒，本发明公开的试剂盒具有特异性好、灵敏度高等优点，能够用于食管癌的早期诊断、治疗过程中的疗效评估以及治疗后转移复发监控，其诊断结果可早于临床症状。
【专利说明】Cystatin SN与CYFRA21-1在制备诊断和预示食管癌标志物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医学检测领域，涉及Cystatin SN与CYFRA21-1在制备诊断和预示食管癌标志物中的应用。
【背景技术】
[0002]食管癌是世界上常见的恶性肿瘤之一。我国是世界上食管癌发生率和死亡率最高的国家，其死亡率位居全国恶性肿瘤死亡率的第四位。早期食管癌的症状不显著，大部分食管癌患者确诊时已经是中晚期。早期食管癌手术治疗后，5年生存率能够达到80%以上。因此对于食管癌的早发现以及早治疗是改善食管癌患者生存率的最佳方式。
[0003]目前对于食管癌的诊断主要依赖于影像学和细胞学等方法。随着分子生物学的发展，肿瘤分子标志物的使用越来越广泛。寻找到食管癌相关的肿瘤标志物对于实现食管癌患者的早发现和早治疗具有十分重要的意义。鳞癌抗原(SCC)抗原和癌胚抗原(CEA)是目前常见的用于食管癌诊断的肿瘤分子标志物，但其灵敏度偏低，无法满足临床需要。在过去的四十年中，对于食管癌的治疗的模式发生了重大的变化，例如手术治疗方法和化疗方法，以及放疗方法的综合使用。随着治疗方法的创新，在临床上食管癌患者的五年生存率有了显著的提高。然而在临床上，即使处于同一病理分期的患者表现出差异显著的生存率。
[0004]因此寻找到新的食管癌标志物，对提高食管癌的诊断灵敏度和特异性具有非常重要的价值，帮助医生对于患者进行个体化治疗，并为食管癌早期发现、及时干预及疗效评估和术后复发转移监控奠定基础。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN (Cystatin SN)和细胞角蛋白19片段21-1 (CYFRA21-1)在制备诊断和预示食管癌标志物中的应用；本发明的目的之二在于提供食管癌标志物的捕获剂；本发明的目的之三在于提供含有上述捕获剂的检测试剂盒；本发明的目的之四在于提供试剂盒建立诊断和预示食管癌的方法。
[0006]为达到上述目的，本发明提供如下技术方案:
[0007]1.半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和细胞角蛋白19片段21-1在制备诊断和预示食管癌标志物中的应用，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述细胞角蛋白19片段21-1的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]优选的，所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
[0009]2.食管癌标志物的捕获剂，所述标志物为半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和细胞角蛋白19片段21-1，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述细胞角蛋白19片段21-1的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]优选的，所述捕获剂为识别半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和细胞角蛋白19片段21-1的特异性抗体。[0011]3.含有所述捕获剂的试剂盒。
[0012]优选的，所述试剂盒为检测血清中半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和细胞角蛋白19片段21-1浓度的试剂盒。
[0013]更优选的，所述试剂盒为酶联免疫检测试剂盒。
[0014]更优选的，所述试剂盒含有包被有单克隆抗体的固相载体、生物素标记的多克隆抗体和显色底物。
[0015]最优选的，所述单克隆抗体为鼠抗人Cystatin SN单克隆抗体,所述多克隆抗体为兔抗人Cystatin SN多克隆抗体，所述显色底物为四甲基联苯胺。
[0016]4.利用所述试剂盒建立计算诊断和预示食管癌阈值的方法，用所述试剂盒检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和细胞角蛋白19片段21-1浓度，然后利用P=exp(-5.382+0.551X1+2.658X2) /[1+exp (-5.382+0.551X1+2.658X2)]计算阈值 P 值，当 P >
0.5时，判断为阳性；当P < 0.5时，判断为阴性；
[0017]其中Xl为Cystatin SN的浓度，单位为pg/mL ；X2为CYFRA21-1的浓度，单位为ng/mLο
[0018]本发明的有益效果:本发明公开了诊断和预示食管癌的新标志物，即将CystatinSN和CYFRA21-1联合用于制备诊断和预示食管癌的标志物，通过联合两个标志物检测食管癌，提高了诊断的灵敏度和特异性，诊断食管癌的灵敏度为84.1%，特异性为92.5% ;本发明还公开了检测食管癌标志物的捕获剂，将捕获剂与常规试剂组合形成检测试剂盒，形成的试剂盒具有使用方便，重复性好，便于携带等特点，可用于食管癌的早期诊断、食管癌的疗效评估或食管癌移转复发监控等。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图:
[0020]图1为Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒检测Cystatin SN蛋白的标准曲线。
[0021]图2为Cystatin SN-CYFRA21-1联合检测试剂盒检测食管癌ROC曲线。
【具体实施方式】
[0022]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
[0023]本发明使用的试剂如下:鼠抗人Cystatin SN单克隆抗体购自美国R&D公司(货号:MAB1285);兔抗人Cystatin SN多克隆抗体、Cystatin SN蛋白标准品购自北京义翘神州生物技术有限公司；CYFRA21-1血清ELISA检测试剂盒购自北京华迈科生物技术有限公司(货号:HMK1428)。
[0024]实施例1建立Cystatin SN血清检测体系及其优化
[0025]用浓度为5 μ g/mL鼠抗人Cystatin SN单克隆抗体包被ELISA板,包被条件是于4°C条件下包被过夜，洗板；然后在质量分数为2%的BSA中室温封闭2小时，洗板；将浓度分别为 Opg/mL, 50pg/mL, 100pg/mL, 200pg/mL, 400pg/mL, 800pg/mL, 1600pg/mL 的 CystatinSN蛋白标准品(Cystatin SN编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.1)和样品加入封闭板中，于37°C反应I小时，洗板；然后用浓度为0.5 μ g/mL HRP标记的兔抗人Cystatin SN多克隆抗体，在37 °C条件下反应I小时，洗板；再与四甲基联苯胺(TMB )反应2-3分钟，最后用浓度为2M的硫酸终止反应，并于450nm条件下检测OD值(图1)。由图1可知，Cystatin SN酶联免疫检测的线性范围为50pg/mL-1600pg/mL，在线性范围内标准品线性相关系数r > 0.990，回收率在90%?110%范围内。
[0026]检测体系优化，比对分别由美国R&D，英国Abcam和美国NOVUS B10L0GICALS3个不同公司生产的Cystatin SN单克隆抗体、美国R&D公司和北京义翘神州生物技术有限公司生产的Cystatin SN蛋白标准品和美国R&D,英国Abcam和北京义翅神州生物技术有限公司生产的Cystatin SN多克隆抗体。结果表明，Cystatin SN单克隆抗体优选R&D公司提供的产品，最佳工作浓度为5 μ g/mL ；Cystatin SN蛋白标准品和Cystatin SN多克隆抗体优选北京义翘神州生物技术有限公司产品，最佳工作浓度为0.5μ g/mL，在最佳条件下，可实现背景(》值< 0.1，能够有效区分阴性组与阳性组，且具有统计学意义。
[0027]固相载体的确定:对美国Corning、德国Greiner、美国Thermo和丹麦Nunc4个不同厂家生产的酶标板进行了比较。结果显示，美国corning公司(货号为:9018)和thermo(货号为:468667)公司的酶标板符合背景OD值< 0.1，且信噪比较高。
[0028]包被液的选择:根据抗体包被于固相载体所需要的缓冲体系，ELISA常用包被液为缓冲盐溶液，分别用磷酸盐缓冲液(PH7.5)和碳酸盐缓冲液(pH9.6)检测包被环境对反应体系的影响，结果显示碳酸盐缓冲液(PH9.6)可满足空白组OD值< 0.1，有效区分空白组、阴性组和阳性组，信噪比较高。
[0029]稀释剂的选择:通过实验对比了 2种商品化稀释剂(分别购自天津博美科生物技术有限公司(货号BMKF017-1)和上海西唐生物科技有限公司(货号C0901))和自制稀释剂的稀释效果，主要从保护蛋白能力，自身稳定性两方面评价稀释剂的稀释效果。结果显示自制稀释剂的效果最佳，自制稀释剂各组分的浓度如下:3mM EDTA、质量分数为0.5%的BSA、1XPBS、质量分数为0.05%的Tween-20和质量分数为0.02%的硫柳汞(pH6.0)。
[0030]稳定剂的选择:使用3种稳定剂(3种稳定剂具体如下:稳定剂1:质量分数为3%的蔗糖，体积分数为8%的甘油和质量分数为1.3%的NaCl ;稳定剂I1:质量分数为3%的蔗糖，体积分数为8%的甘油，质量分数为0.1%的EDTA和质量分数为1.3%的NaCl，稳定剂III:体积分数为68.8%的PBS，体积分数为30%的胎牛血清和质量分数为0.2%的硫柳汞)分别稀释单克隆抗体、蛋白标准品和多克隆抗体至浓度为0.5mg/mL、0.16ng/mL和50 μ g/mL,使用时按体积比为1:100稀释。并于第O天、第7天和第14天进行检测，结果显示稳定剂III效果最佳，其组分为:体积分数为68.8%的PBS、体积分数为30%的胎牛血清、质量分数为0.2%的硫柳萊。
[0031]通过以上研究确定了检测体系的主要组分，然后建立Cystatin SN血清检测体系。
[0032]实施例2Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒
[0033]根据实施例1中建立Cystatin SN血清检测体系构建Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒，具体组分如表I所示:
[0034]表1.Cystatin SN酶联免疫检测试剂盒组分
[0035]
【权利要求】
1.半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和细胞角蛋白19片段21-1在制备诊断和预示食管癌标志物中的应用，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述细胞角蛋白19片段21-1的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
3.食管癌标志物的捕获剂，其特征在于:所述标志物为半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和细胞角蛋白19片段21-1，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述细胞角蛋白19片段21-1的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
4.根据权利要求3所述的捕获剂，其特征在于:所述捕获剂为识别半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和细胞角蛋白19片段21-1的特异性抗体。
5.含有权利要求3或4所述捕获剂的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒为检测血清中半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和细胞角蛋白19片段21-1浓度的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒为酶联免疫检测试剂盒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒含有包被有单克隆抗体的固相载体、生物素标记的多克隆抗体和显色底物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于:所述单克隆抗体为鼠抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN单克隆抗体，所述多克隆抗体为兔抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN多克隆抗体，所述显色底物为四甲基联苯胺。
10.利用权利要求5-9任一项所述试剂盒建立计算诊断和预示食管癌阈值的方法，其特征在于:用所述试剂盒检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和细胞角蛋白19片段21-1浓度，然后利用 P=exp (-5.382+0.551×1+2.658×2) /[1+e×p (-5.382+0.551×1+2.658×2)]计算阈值P值，当P > 0.5时，判断为阳性；当P≤0.5时，判断为阴性； 其中Xl为半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的浓度，单位为pg/mL ；X2为细胞角蛋白19片段21 -1的浓度，单位为ng/mL。
【文档编号】G01N33/577GK103901205SQ201310165091
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2013年5月7日 优先权日:2013年5月7日
【发明者】王弢, 秦勇, 吴孝林 申请人:上海良润生物医药科技有限公司