一种溶酶体定位荧光探针在近红外比率检测肼中的应用的制作方法

本发明属于分析化学中荧光传感技术领域，具体涉及一种溶酶体定位荧光探针、制备方法及在近红外比率检测肼中的应用。

背景技术：

水合肼可以作为火箭的推进系统高能量推进剂，同时水合肼具有较强还原性及碱性使得水合肼在工业领域也有很好的应用，如在金属防腐、在合成不同种类的聚合物中用作其共同的前驱体、作为纺织染料以及药物制备的中间体等。而同时，水合肼具有很强的毒性，当人体吸入或皮肤接触到水合肼时将会对人体造成很大的伤害。水合肼是一种神经毒素并且具有很强的诱变效应，对肝、肺、肾以及人体的中枢神经系统造成严重的伤害。美国环境环境保护协会把水合肼定义为潜在的人类致癌物质并建议把其检出限阈值规定低至10ppb。因此具有高灵敏度高选择性有效的检测水合肼的分析方法就显得尤为重要。

传统检测水合肼的分析方法较多，如：电量分析法、电位分析法、滴定法、比色法等等。相关专利文献包括西北大学郑建斌、董燕、盛庆林的专利“一种用于水合肼检测的电化学传感器及其应用”，专利授权公告号cn104181212b和大连理工大学刘凤玉、孙世国、李伟、李福胜的专利“一种三联吡啶钌电化学发光检测水合肼的方法”，专利授权公告号cn101975774b。但这些传统方法操作起来比较复杂，费时并且需要特殊的仪器设备。

另外，荧光探针因其自身的高灵敏度、高选择性、便捷、经济、实时检测、无破坏性以及高的生物相容性等特点使得荧光探针分析方法得到了越来越广泛的关注。目前检测肼的荧光探针能够实现近红外比率荧光检测的还很少，特别是实现细胞定位的荧光探针更少。由于近红外(＞650nm)的荧光探针对生物组织较低的光损伤、较深的组织穿透能力、较低的生物背景干扰等特点，因而其被广泛用于生物检测。而比率荧光探针同时检测两个不同波长的荧光强度，可以通过建立内标克服单纯一个波长荧光变化引起的多种因素干扰。细胞定位是对生物荧光成像提高信噪比、准确示踪的更高的要求。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种选择性好、灵敏度高溶酶体定位荧光探针在近红外比率检测肼中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种溶酶体定位荧光探针，该探针的化学结构式如下：

所述的探针的制备方法包括以下步骤：将化合物3和化合物2溶解在乙醇中，加热回流，将反应溶液冷却至室温后过滤，滤饼用乙醚洗涤。

所述化合物3的结构为化合物2的结构为

优选的，所述化合物3的合成方法如下：将3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2h-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮与seo2溶解在1，4-二氧六环中，回流7小时，减压蒸馏，过柱分离提纯即得化合物3。

优选的，所述3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2h-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮的合成方法如下：氩气保护下，将2-亚硝基-5-吡咯烷-1-苯酚和水合肼加入到乙醇中，将混合物加热，然后加入pd-c催化剂，回流直至溶液的红色消失，然后加入丙酮酸乙酯，将反应溶液加热回流，通过真空蒸馏得到的粗产物，将粗产物过柱分离提纯即得3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2h-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮，3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2h-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮的结构式如下：

优选的，所述2-亚硝基-5-吡咯烷-1-苯酚的合成方法如下：将3-吡咯烷基-1-苯酚溶解在浓盐酸和水混合溶剂中，将亚硝酸钠的水溶液加入到低于5℃的上述溶液中，反应并过滤，固体用饱和醋酸钠溶液洗涤三次即得2-亚硝基-5-吡咯烷-1-苯酚，2-亚硝基-5-吡咯烷-1-苯酚的结构式如下：

优选的，所述3-吡咯烷基-1-苯酚的合成方法如下：将3-氨基苯酚、碳酸钾和1，4-二溴丁烷溶解于dmf中，加热至80℃，反应2小时，冷却至室温，过柱分离提纯即得3-吡咯烷基-1-苯酚，3-吡咯烷基-1-苯酚的结构式如下：

所述化合物2的合成方法如下：取4-羧基苯肼盐酸盐和氢氧化钠，加入乙醇超声，室温条件下搅拌，溶解30min，随后将乙醇旋转蒸出，将剩余的固体转移至三口瓶中，加入冰乙酸溶解，再加入醋酸钠，超声溶解，最后加入3-甲基-2-丁酮，加热至100℃，回流反应16h，冷却至室温，减压蒸馏，旋转蒸出冰乙酸，用冰水冷却至0℃，慢慢加入饱和的碳酸钠溶液，直至没气泡产生为止，用盐酸调节ph＝4，用二氯甲烷萃取三次，收集油相，用无水硫酸钠干燥，抽滤，再旋转蒸出二氯甲烷，得红色油状物2，3，3-三甲基-3h-吲哚-5-羧酸；将2，3，3-三甲基-3h-吲哚-5-羧酸和碘甲烷溶解于乙腈中，混合物加热回流反应12小时，冷却至室温，过滤旋蒸除去溶剂得到化合物2。

本发明产生的有益效果是：本发明的荧光探针的合成条件温和、成本较低，对肼具有良好的检测效果，荧光变化明显，检测灵敏，对肼检测限达到339nm(3.39×10^-7m)，在70-210μm范围内可以定量检测肼，对肼具有很好的选择性和抗干扰性，在细胞内具有细胞溶酶体定位功能，能够实现比率荧光成像，在生物化学领域具有实际的应用价值。

附图说明

图1为实施例1制备的荧光探针(vwater/vdmso＝6/4，浓度1.0×10^-5m)滴定水合肼水溶液(0-50.0当量)的紫外可见光谱变化图(反应时间为30分钟)；

图2为实施例1制备的荧光探针滴定水合肼水溶液时450nm和650nm处水合肼浓度与紫外可见光谱吸收峰比率的关系图

图3为实施例制备的荧光探针(浓度1.0×10^-5min6∶4(v/v)water/dmso)滴定水合肼水溶液(从左到右浓度分别为0m，2×10^-5m，4×10^-5m，6×10^-5m，8×10^-5m，10×10^-5m，15×10^-5m，20×10^-5m，25×10^-5m，30×10^-5m，35×10^-5m，40×10^-5m，45×10^-5m，50×10^-5m)的日光下照片；

图4为实施例1制备的荧光探针(浓度1.0×10^-5m水与dmso体积比例6∶4)滴定水合肼水溶液(0-50.0当量)的荧光光谱图(反应时间30分钟)，(a)激发波长为470nm，(b)激发波长为630nm；

图5为实施例1制备的荧光探针(浓度1.0×10^-5m)滴定水合肼水溶液(0-50.0当量)的i570/i720发射强度比值的线性关系图，i570和i720分别表示570nm和720nm处的荧光强度；

图6为采用实施例1制备的荧光探针(浓度1.0×10^-5m)滴定水合肼水溶液时，720nm处的荧光强度与肼溶液浓度线性关系。

图7为实施例1制备的荧光探针(浓度为1.0×10^-5m水与dmso体积比例6∶4)在570nm和720nm处荧光强度与加入不同浓度的肼(浓度分别为1.0×10^-5m，5.0×10^-5m，1.0×10^-4m，1.5×10^-4m，2.0×10^-4m，3.0×10^-4m，4.0×10^-4m和5.0×10^-4m)的动力学曲线；(a)激发波长为470nm，(b)激发波长为630nm，i570和i720分别表示570nm和720nm处的荧光强度；

图8为实施例1制备的探针的溶液(浓度为1.0×10^-5m，水与dmso体积比例6∶4)加入不同的生物分子(浓度为荧光探针浓度的50倍当量，分别为gsh，iie，pro，thr，ser，met，glc，his，ala，gly，val，leu，phe，cys，asp，glu，tyr和trp)的柱状图(深色柱状图)和探针溶液(浓度为1.0×10^-5m)加入肼后再加入不同的生物分子(浓度为荧光探针浓度的50倍当量，分别为gsh，iie，pro，thr，ser，met，glc，his，ala，gly，val，leu，phe，cys，asp，glu，tyr和trp)抗干扰柱状图(浅色柱状图)，反应时间30分钟，(a)激发波长为470nm，(b)的激发波长为630nm，i570和i720分别表示570nm和720nm处的荧光强度；

图9为hela细胞的荧光成像结果，(a)hela细胞在加入探针15分钟(图像采集通道1：激发波长为560nm，发射波长570-620nm(a)；(b)hela细胞在加入溶酶体定位染料(2.0mm)15分钟(图像采集通道2：激发波长为640nm，发射波长663-738nm；(c)为(a)和(b)的混合图像；(d)明场图像；(e)hela细胞区域强度分布图；(f)探针分子与溶酶体定位染料在细胞中的强度相关性图；

图10为hela细胞在加入探针前(a，b，c，d)和加入探针后(1.0×10^-5m)(e，f，g，h)，以及加入探针分子(1.0×10^-5m)和水合肼后(5.0×10^-4m)(i，j，k，l)的共聚焦显微镜成像图，激发波长分别为488nm和560nm，图像采集的通道分别为525±25nm(第一行)和595±25nm(第二行)，比率图像由第一通道与第二通道的比值(i1/i2，第三行)；

图11为470nm光激发下实施例1制备的探针分子(1.0×10^-5m水与dmso体积比例6∶4)的荧光比率变化与肼浓度的关系图，i570和i720分别表示570nm和720nm处的荧光强度；

图12为630nm光激发下实施例1制备的探针分子(1.0×10^-5m水与dmso体积比例6∶4)的720nm处荧光强度与肼浓度的关系图，i720表示720nm处的荧光强度；

图13为实施例1制备的探针溶液(浓度为1.0×10^-5m水与dmso体积比例6∶4)加入不同的金属离子(浓度为探针分子的50当量，柱的颜色为深色)以及探针溶液[1.0×10^-5m水与dmso体积比例6∶4]加入不同金属离子(浓度为探针分子的50当量)和肼水溶液(在水中浓度为5.0×10^-4m)(柱的颜色为浅色)的荧光响应图，激发波长为470nm，反应时间为30分钟。i570和i720分别表示570nm和720nm处的荧光强度，金属离子分别为k⁺，ca²⁺，na⁺，mg²⁺，al³⁺，zn²⁺，ni²⁺，hg²⁺，mn²⁺和cd²⁺离子；

图14为实施例1制备的探针溶液(浓度为1.0×10^-5m水与dmso体积比例6∶4)加入不同的阴离子(浓度为探针分子的50当量，柱的颜色为深色)以及探针溶液[1.0×10^-5m水与dmso体积比例6∶4]加入不同阴离子(浓度为探针分子的50当量)和肼水溶液(在水中浓度为5.0×10^-4m)(柱的颜色为浅色)的荧光响应图。激发波长为470nm，反应时间为30分钟。i570和i720分别表示570nm和720nm处的荧光强度，阴离子分别为clo4^-，so4^2-，no3^-，c2o4^2-，hso3^-，hso4^-，s2o3^2-，sh^-，i^-，n3^-，so3^2-，clo3^-，f^-，br^-和cl^-离子；

图15为实施例1制备的探针溶液(浓度为1.0×10^-5m水与dmso体积比例6∶4)加入不同的金属离子(浓度为探针分子的50当量，柱的颜色为深色)以及探针溶液[1.0×10^-5m水与dmso体积比例6∶4]加入不同金属离子(浓度为探针分子的50当量)和肼水溶液(在水中浓度为5.0×10^-4m)(柱的颜色为浅色)的荧光响应图，激发波长为630，反应时间为30分钟。i720表示720nm处的荧光强度，金属离子分别为k⁺，ca²⁺，na⁺，mg²⁺，al³⁺，zn²⁺，ni²⁺，hg²⁺，mn²⁺和cd²⁺离子；

图16为实施例1制备的探针溶液(浓度为1.0×10^-5m水与dmso体积比例6∶4)加入不同的阴离子(浓度为探针分子的50当量，柱的颜色为深色)以及探针溶液[1.0×10^-5m水与dmso体积比例6∶4]加入不同阴离子(浓度为探针分子的50当量)和肼水溶液(在水中浓度为5.0×10^-4m)(柱的颜色为浅色)的荧光响应图。激发波长为630nm，反应时间为30分钟。i720表示720nm处的荧光强度，阴离子分别为clo4^-，so4^2-，no3^-，c2o4^2-，hso3^-，hso4^-，s2o3^2-，sh^-，i^-，n3^-，so3^2-，clo3^-，f^-，br^-和cl^-离子；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。本发明中除非特别指出，肼水溶液0-50.0当量为：0m，2×10^-5m，4×10^-5m，6×10^-5m，8×10^-5m，10×10^-5m，15×10^-5m，20×10^-5m，25×10^-5m，30×10^-5m，35×10^-5m，40×10^-5m，45×10^-5m，50×10^-5m。

实施例1

本实施例中的荧光探针采用如下合成路线：

1)合成3-吡咯烷基-1-苯酚：

将3-氨基苯酚(1.0913g，10.0mmol)、碳酸钾(1.5203g，11.0mmol)和1，4-二溴丁烷(1340μl，11.0mmol)溶解于10mldmf中。加热至80℃，反应2小时，冷却至室温。过柱提纯(展开剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10)，得到3-吡咯烷基苯酚，产率：58.8％。

表征如下：¹hnmr(400mhz，dmso-d6，tms)：δh7.10(t，1h)，6.19(t，2h)，6.09(s，1h)，4.86(s，1h)，3.28(t，4h)，2.02(t，4h).¹³cnmr(100mhz，dmso-d6)：δc156.55，149.47，130.06，104.81，102.57，98.69，47.71，and25.44。

2)合成2-亚硝基-5-吡咯烷-1-苯酚

将3-吡咯烷基苯酚(324.6毫克，2毫摩尔)溶解在12毫升的浓盐酸(37wt％)和4ml的水混合溶剂中，将亚硝酸钠(138毫克，2毫摩尔)的4毫升水溶液加入到低于5℃的上述溶液中，混合物反应1.5小时并过滤。固体用饱和醋酸钠溶液洗涤三次，获得呈红褐色固体最终产物(340毫克，产率：88.4％)。

表征如下：¹hnmr(400mhz，dmso-d6，tms)：δh7.30(d，1h)，6.72(d，1h)，5.91(s，1h)，5.32(s，1h)，3.44(t，4h)，1.92(t，4h).¹³cnmr(100mhz，dmso-d6)：δc173.88，169.19，156.46，134.66，117.30，96.28，49.63，and23.49。

3)合成3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2h-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮：

将2-亚硝基-5-吡咯烷-1-苯酚(720.75毫克，2.5毫摩尔)和1563微升80％的水合肼加入到17毫升乙醇中，将混合物加热至30-40℃，然后加入41.5毫克pd-c催化剂。将上述混合物回流直至溶液的红色在氩气氛消失。加入2.5毫升丙酮酸乙酯，将反应溶液回流4小时。通过真空蒸馏得到的粗产物，并用乙酸乙酯/石油醚(1/20)为洗脱液过柱提纯得到终产物，产率为68％。

表征如下：¹hnmr(400mhz，dmso-d6，tms)：δh7.40(d，1h)，6.56(d，1h)，6.37(s，1h)，3.31(t，4h)，1.98(t，4h)，1.26(s，3h).¹³cnmr(100mhz，dmso-d6)：δc149.39，148.96，146.66，129.21，122.24，110.08，97.11，61.96，and48.04。

4)合成7-(吡咯烷-1-)-2h-苯并[b][1，4]噁嗪-3-甲醛：

将3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2h-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮(345.4毫克，1.5毫摩尔)与seo2(204.4毫克，1.8毫摩尔)溶解在12ml1，4-二氧六环中，回流7小时。减压蒸馏，过柱分离提纯(展开剂为二氯甲烷/乙醇＝500∶1)得到产物(式iii)，产率：84.7％。

表征如下：¹hnmr(400mhz，cdcl3，tms)：δh10.08(s，1h)，7.67(d，1h)，6.68(d，1h)，6.31(s，1h)，3.51(t，4h)，2.15(t，4h).¹³cnmr(100mhz，cdcl3)：δc187.86，153.07，152.64，151.30，134.17，133.42，124.64，112.46，96.96，48.59，and25.33。

5)化合物2的制备：

称取4-羧基苯肼盐酸盐(500mg，2.46mmol)和氢氧化钠(98.5mg，2.46mmol)于100ml的茄形瓶中，加入适量的乙醇超声，室温条件下搅拌，溶解30min，随后将乙醇旋出，将剩余的固体转移至100ml三口瓶中，加入16ml冰乙酸溶解，再加入醋酸钠(405mg，4.94mmol)，超声溶解，最后加入3-甲基-2-丁酮(397μl，3.7mmol)，加热至100℃，回流16h，待反应完全后，停止反应，冷却至室温，减压蒸馏，旋出冰乙酸，用冰水冷却至0℃，慢慢加入饱和的碳酸钠溶液，直至没气泡产生为止，用盐酸调节ph＝4，用二氯甲烷萃取三次，收集油相，用无水硫酸钠干燥，抽滤，再旋出二氯甲烷，得红色油状物2，3，3-三甲基-3h-吲哚-5-羧酸(405mg，产率为81％)。

将2，3，3-三甲基-3h-吲哚-5-羧酸(1.0g，4.93mmol)和碘甲烷(700mg，4.93mmol)溶解于10毫升乙腈中。混合物加热回流反应12小时，冷却至室温。过滤旋蒸除去溶剂得到化合物2(0.76g，44.7％)。

化合物2表征如下：¹hnmr(400mhz，dmso-d6，tms)：δh8.38(s，1h)，8.19(d，1h)，8.03(d，21h)，4.00(s，3h)，2.82(s，3h)，1.57(sd，6h).¹³cnmr(100mhz，dmso-d6)：δc199.48，166.95，142.42，141.72，132.04，130.83，124.68，115.85，54.72，35.52，21.96，and15.12。

6)近红外比率检测肼的溶酶体定位荧光探针的制备：

将化合物3(209.9毫克，0.64毫摩尔)和化合物2(155.3毫克，0.64毫摩尔)溶解在17毫升乙醇中，加热至78℃并回流12小时。将反应溶液冷却至室温后过滤，滤饼用乙醚洗涤三次，得到为暗绿色固体，产率：76.4％。

表征如下：hrms(ei)m/z：calcdforc26h26n3o4[m-i]，444.1923；found，444.1921.¹hnmr(400mhz，dmso-d6，tms)：δh8.39(s，1h)，8.24(s，1h)，8.19(d，1h)，8.02(d，1h)，7.80(d，1h)，7.66(d，1h)，6.96(d，1h)，6.67(s，1h)，4.04(s，3h)，3.59(t，4h)，2.00(t，4h)，1.79(s，6h).¹³cnmr(100mhz，dmso-d6)：δc166.99，153.39，145.75，143.88，133.14，131.55，131.04，127.48，124.22，115.58，114.86，98.14，52.30，49.49，34.98，26.22，and25.25。

本实施例中制备的荧光探针的应用

荧光探针探针可以在水溶液中通过滴定的方式检测水合肼，当肼加入后溶液的颜色发生明显的变化由蓝色变为无色。由图1-3可以看出，肼的水溶液(浓度0.1m)，通过滴定加入荧光探针(vwater/vdmso＝6/4，浓度1.0×10-5m)的水溶液中，紫外-可见光谱中650nm处的峰减弱消失，450nm出现新的吸收峰。

由图4-6可以看出荧光探针(浓度1.0×10^-5m)滴定水合肼水溶液(0-50.0当量)的荧光光谱中探针的水溶液的荧光光谱在470nm的光激发下，570nm处的荧光强度增强，720nm处的荧光强度减弱。在630nm的光激发下720nm处的荧光强度明显减弱超过六十倍。由图7可以看出，探针识别肼在5分钟内完成响应，2分钟内有明显的强度变化。图8和图13-图16可以看出，通过水合肼与不同生物分子gsh，iie，pro，thr，ser，met，glc，his，ala，gly，val，leu，phe，cys，asp，glu，tyr和trp，及阳离子k⁺，ca²⁺，na⁺，mg²⁺，al³⁺，zn²⁺，ni²⁺，hg²⁺，mn²⁺和cd²⁺和阴离子clo4^-，so4^2-，no3^-，c2o4^2-，hso3^-，hso4^-，s2o3^2-，sh^-，i^-，n3^-，so3^2-，clo3^-，f^-，br^-和cl^-的选择性和抗干扰性实验表明，探针分子对肼具有很好的选择性和抗干扰性。图11和图12表明探针分子荧光比率和荧光强度在肼的浓度较小(10^-4m)时即有明显变化。

图9和图10可以看出细胞荧光成像实验表明探针在细胞内具有细胞溶酶体定位的性质，能够实现比率荧光成像。

本发明制备的荧光探针对肼具有良好的检测效果，荧光变化明显，检测灵敏，对肼检测限达到339nm(3.39×10-7m，在70-210μm范围内可以定量检测肼，选择性强，抗干扰性好；在细胞内具有细胞溶酶体定位功能，能够实现比率荧光成像，在生物化学领域具有实际的应用价值。