甲 醇稀释至刻度，摇匀后得一系列梯度浓度的溶液，进样体积为10 μ L，于高效液相色谱仪中， 按照实施例1的检测方法进行测定，以对照品浓度（μ g/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标进 行线性回归，绘制标准曲线，结果见图19。
[0160] 图19结果得线性回归方程为Y = 31995x+1524. 7,相关系数r= 1.0,表明线性范 围 10. 02 μ g/mL-100. 23 μ g/mL 线性良好。
[0161] 5、重复性测定
[0162] 平行称定6份注射用灯盏花乙素样品，每份配制成浓度约为50 μ g/mL的溶液，摇 匀，进样体积为10 μ L，于高效液相色谱仪每份进样一次，按照实施例1的检测方法进行测 定，记录色谱图。考察主峰面积变化（RSD)，结果见表19。
[0163] 表19注射用灯盏花乙素高效液相色谱法含量测定重复性实验结果
[0164]
[0165] 表19结果显示，平行操作测定的6份供试品溶液中灯盏花乙素含量的RSD为 0.56%，在规定范围内，说明本发明实施例1的检测方法的重复性较好。
[0166] 6、加样回收实验
[0167] 分别配置灯盏花乙素测试样品的进样浓度的80%、100%、120%的供试品溶液，进 行回收率测定，每个浓度设三个重复，于高效液相色谱仪进样体积10 μ L，按照实施例1的 检测方法进行测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算灯盏花乙素回收率，结果见表20。
[0168] 表20注射用灯盏花乙素高效液相色谱法含量测定回收率实验结果
[0169]
[0170] 结果显示，灯盏花乙素的加样回收率平均值为100. 69%，RSD为0.64%，表明该方 法的回收率符合要求，准确性好。
[0171] 7、系统适用性
[0172] 配制6份相同浓度的供试品溶液，按照实施例1的检测方法进行测定，并进行系统 适用性分析。可接受的标准为：主峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%，主峰保留时间的 相对标准差应不大于I. 〇%。另外，主峰的拖尾因子不得大于2. 0,主峰与杂质峰必须达到 基线分离，主峰的理论塔板数应符合质量标准的规定。结果见表21。
[0173] 表21含量测定的系统适用性实验结果
[0174]
[0175]
[0176] 实验结果显示，主峰峰面积的相对标准差为0. 15%，主峰保留时间的相对标准差 为0. 52%。另外，主峰的拖尾因子为0. 95~0. 97,主峰与杂质峰分离度为26,主峰的理论 塔板数也质量标准的规定。表明本发明所述检测方法系统适用性良好。
[0177] 8、耐用性
[0178] 分别考察流动相比例变化± 5 %、柱温变化± 5°C、流速相对值变化± 20 %时，仪 器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。可接受的标准为：主峰的拖尾因子不得大于 2.0,主峰与杂质峰必须达到基线分离；各条件下的含量数据（η = 6)的相对标准差应不大 于2.0%。结果见表22。
[0179] 表22耐用性检测结果
[0180]
[0181] 由表22结果可见，本发明所述检测方法对流速、pH、柱温的耐用性较好；使用不同 品牌同型号、同品牌不同批号色谱柱，系统适用性均符合要求，含量测定结果基本一致，对 色谱柱耐用性较好；增加流动相中有机相的比例，主峰与杂质峰的分离度远大于1. 5,达到 要求，表明本发明所述检测方法耐用性良好。
[0182] 上述方法学验证的结果显示本发明实施例1所述检测方法专属性、重复性、精密 度、加样回收试验、系统适用性试验以及耐用性的结果均符合要求，表明本发明实施例1所 述检测方法专属性强、精密度高、重复性好、准确度高、耐用性好。
[0183] 按照上述方法分别对实施例3和实施例5的检测方法进行方法学验证，结果显示 本发明实施例3和实施例5所述检测方法专属性、重复性、精密度、加样回收试验、系统适用 性试验以及耐用性的结果均符合要求，表明本发明实施例3和实施例5所述检测方法专属 性强、精密度高、重复性好、准确度高、耐用性好。
[0184] 以上对本发明提供灯盏花乙素的检测方法进行了详细的介绍。本申请中应用了具 体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发 明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明 原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利 要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种灯盏花乙素原料及其制剂的检测方法，包括： 提供供试品溶液和对照品溶液； 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以酸的水溶液或磷酸盐的水溶 液为流动相B，梯度洗脱，在液相色谱仪中检测所述供试品溶液和对照品溶液，外标法分析 得到所述灯盏花乙素的含量。2. 根据权利要求1所述的检测方法，所述酸的水溶液中的酸为甲酸、乙酸、盐酸、磷酸 中的一种或几种。3. 根据权利要求1所述的检测方法，所述磷酸盐的水溶液中的磷酸盐选自磷酸氢二 铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或几种。4. 根据权利要求1-3任意一项所述的检测方法，所述酸的水溶液中的酸的体积浓度为 0? 01%~0? 05%，所述磷酸盐的水溶液中的磷酸盐的浓度为0? 05mol/L~1.Omol/L〇5. 根据权利要求1-4任意一项所述的检测方法，所述酸的水溶液或磷酸盐的水溶液的 pH为 2. 0 ~7. 0,优选 3. 0 ~4. 5。6. 根据权利要求1-5任意一项所述的检测方法，检测波长为330nm~340nm，柱温为 25 ~45°C，流速为 0? 5mL/min~2. 0mL/min〇7. 根据权利要求1-6任意一项所述的检测方法，所述流动相B与流动相A的起始体积 比为 90:10 ~40:60,优选 90:10 ~60:40,88:12 ~65:35。8. 根据权利要求1-7任意一项所述的检测方法，所述流动相B为酸的水溶液时，梯度洗 脱程序为〇9. 根据权利要求1-7任意一项所述的检测方法，所述流动相B为磷酸盐的水溶液时，梯 度洗脱程序为〇10. 根据权利要求1所述的检测方法，还包括检测所述灯盏花乙素原料及其制剂中有 关物质含量的步骤，所述检测有关物质含量的步骤具体包括： 提供灯盏花乙素原料或其制剂的有关物质检查用供试品溶液； 取所述有关物质检查用供试品溶液稀释得到对照溶液； 取所述对照溶液和有关物质检查用供试品溶液在液相色谱中分析，对比所述供试品溶 液的有关物质峰面积与所述对照品溶液的主峰面积，得到所述有关物质的含量。11. 根据权利要求10所述的检测方法，所述对照溶液和有关物质检查用供试品溶液在 液相色谱中分析以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以酸的水溶液或磷 酸盐的水溶液为流动相B，检测时间为灯盏花乙素主成分峰保留时间的2倍以上。12. 根据权利要求10或11所述的检测方法，所述有关物质检查用供试品溶液的浓度为 0? 03mg/mL~1.Omg/mL，所述对照溶液的浓度为0? 3yg/mL~10yg/mL。13. 根据权利要求10-12任意一项所述的检测方法，所述取所述对照溶液和有关物质 检查用供试品溶液在液相色谱中分析检测具体包括： 取所述对照溶液注入液相色谱仪，使主成分峰高约为记录仪满量程的10% ; 取所述对照溶液与所述有关物质检查用供试品溶液注入色谱仪，使所述供试品溶液的 有关物质峰全部显示； 对比所述有关物质检查用供试品溶液的有关物质峰面积与所述对照品溶液的主峰面 积，得到所述有关物质的含量。
【专利摘要】本发明属于医药领域，具体涉及灯盏花乙素的检测方法，尤其是灯盏花乙素原料及其制剂的检测方法。本发明所述灯盏花乙素原料及其制剂的检测方法，包括：提供供试品溶液和对照品溶液；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以酸的水溶液或磷酸盐的水溶液为流动相B，梯度洗脱，在液相色谱仪中检测所述供试品溶液和对照品溶液，梯度洗脱，外标法分析得到所述灯盏花乙素的含量。该方法操作简单，重复性好，专属性强，洗脱完全，准确度高，通过该检测方法，可以在制备灯盏花乙素过程中，提高灯盏花乙素原料药及其制剂质量控制标准，对灯盏花乙素原料及其制剂的质量进行准确的检测，以保证最终得到质量稳定的灯盏花乙素原料及其制剂。
【IPC分类】G01N30/88
【公开号】CN104914206
【申请号】CN201510353559
【发明人】董知旭, 王珺, 张伟, 张国丽, 杨兆祥
【申请人】昆药集团股份有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月24日