合蛋白的存在。例如，我们已经表明引发酶 将稳定DNA寡核苷酸，否则DNA寡核苷酸将不够稳定来阻断发夹重新杂交长到足以被检测 的时间，参见图6。同样地，聚合酶结合到用作引物的小寡核苷酸的3'端增加其稳定性；这 种分析可用于确定聚合酶对其引物位点的亲和性。同样地，如果蛋白结合至特异性ssDNA 位点（例如，甲基化的碱基），其将在特异性位点阻断重新拉上拉链，并且时间长至足以被 检测。
[0230] 技术可以用来鉴定在ss或dsDNA上的DNA修饰。因此，使用针对DNA发夹碱基之 一特异性修饰的抗体（Ab)，来探测将珠锚定至表面的DNA发夹，人们通过在发夹重新杂交 时Ab结合发夹所导致的短暂阻断，可以检测这种修饰碱基在链上的存在与位置。使用一组 互补寡核苷酸探测结合位点，将允许鉴定显示这种修饰的DNA片段。
[0231 ] 检测RecQ与ssDNA模板的结合亲和性
[0232] 解旋酶结合ssDNA缺口以解旋dsDNA。这些酶的活性直接取决于其对ssDNA的亲 和性。我们建议此处直接测量或分析这种参数。这可以使用或不使用ATP或ADP或其它类 似物来完成。我们在此显示关于没有ATP时来自大肠杆菌的RecQ解旋酶的一些结果。典 型的结合信号可参见图7,其允许对于一种解旋酶浓度测量Phw。Phw相对于[RecQ]的演 化显示在图8中。我们观察到，[RecQ]的表征浓度等于226pM。在图9中，我们看到解旋酶 的非特异性结合。最后，酶所产生的阻断显示下滑（slippage)行为：Z位置不是一直恒定 的而是通过多个步骤减少的。由于这种行为，很难定义Th的真实值，因此我们只能测量Tff和kff〇
[0233] 在Z = 0处的峰不对应阻断，而只对应直接的重新折叠。发现RecQ阻断沿着模板 是均一的，在〇. 9 μπι处的衰减是因为具有略微不同伸展的分子进行平均。
[0234] 检测甲基化
[0235] 图11 :针对5mC的抗体的阻断时间的直方图。大部分阻断短并且可以合理地拟合 至具有1. 3秒表征时间的指数分布中。然而，实质上阻断数目的17. 5%超过30秒。在此条 件下不是很容易确定酶的Th，我们认为两种不同的结合机制以一个比另一个更强的方式 进行克争。
[0236] 或者，可以通过存在（或不存在）识别修饰的蛋白时（如识别甲基化胞嘧啶的甲 基结合结构域蛋白I (MBDl)，或针对特异性修饰的dsDNA产生的合适Ab)时，通过将互补寡 核苷酸杂交至推定的修饰位点来探测已知DNA修饰的存在。蛋白存在时的阻断时间将显著 增加，这使得易于鉴定和定位修饰碱基。
[0237] 通过使用识别错配的蛋白，类似地可以使用上述方法来鉴定DNA中的错配（即， SNP)。也可以使用该分析来检测将影响给定蛋白/DNA复合物稳定性的蛋白（或药物）。
[0238] 影响分析的参数。
[0239] F打开:20pN值是很好的选择，因为这确保了大量的珠将同时打开（其磁化强度和它 们由此而来的力变化10至20% )。
[0240] Tffff表现为与分子浓度相结合的重要参数：为观察阻断，必须使用根据下式推导 出（lead to) Ph断实质值的两个参数的组合：
[0241] P阻断=a(F). [I - exp(T打开· k开· [M])] 〇
[0242] 如果想要测量，最好避免饱和的Phw，以及调整[M]和Tffff以达到范围为0. 2 至0.5的Phw将确保最少的循环数以实现合理的统计。请注意，可以通过在获得的程序中 调整参数而简单改变Tffff，改变酶的浓度需要改变流室中的缓冲液。另一方面，如果不测量 kff，则有必要使Phw饱和，这将服从于（yield to)阻断的最佳统计。可通过分子浓度供应 或不希望的结合而限制分子浓度，例如，在使用针对5mC的抗体研究中，在高浓度中这种酶 结合到在其关闭状态的发夹的双链DNA以防止其展开。我们已经发现，将酶浓度限制到低 于35nM以解决这个问题。在这些实验中，增加Tffff是增加 Phw的唯一途径。
[0243] 如图3和4所示，参数a(F)在原理上接近1，评估其值的最佳方法是直到卩_逐 渐达到a(F)时改变Tffff或[M]进行饱和分析。或者，使用下列式估计a(F):
[0244] a (F) = exp (-T空载/T闭)
[0245] 其中是检测系统的空载时间（dead time)以及1^为平均阻断时间。通常，T 空载是〇· 1秒的量级。
[0246] ?_?是非常重要的调整参数：其范围取决于所使用的发夹，但一般跨度为[12pN， 2pN]。对于高于12pN的力，由于二级结构形成ssDNA，发夹的重新折叠表示已经存在一些阻 断，这掩盖了感兴趣的信号。在力低时，DNA的伸展变得非常小而且噪音骤增。发夹叉的压 力非常有效地推动分子进行去杂交，我们观察到的Th= T。exp F/F。;因此，随着Faw降低 T闭下降非常快。例如，9nt寡核苷酸在约Fiww= IlpN时会产生1秒阻断，在力低于9pN时 很难看到阻断（a(F)变小）。对于12nt寡核苷酸，观察范围是[10pN，6pN]。对于37nt寡 核苷酸，在6pN时阻断永远持续，但在Faw= 3pN时阻断下降到几秒钟。对于结合蛋白观察 到相同的：结合越强且力越低之处观察到阻断。
[0247] 我们调整Fam从而使阻断时间可测量（a(F)~1)但不会太长，这样1^相对较短 以便允许进行多循环。
[0248] 在这种分析中，我们可以在0. 2秒至20秒范围内测量Th。可以使用更快的测量 装置如快速摄像机观察到更短的时间，较长时间导致获取时间非常长，因为我们需要实现 一些循环以进行分布的平均。对于寡核苷酸，指数性变化；因此，我们可以通过调 整F测丨式将T闭带至可用范围。对于蛋白，不知道T闭随着Faii式的变化，但我们观察到减小F测 ?通常急剧减小Th。然而，之前的Th是未知的并且可以在大范围内变化。为了获知Faw的 典型值，我们发现如图12所示，随着力在几秒钟内以斜坡的形式升高和降低，方便地先实 现一系列的循环。阻断阶段的终点对应力F。。F。峰值的分布对应着这样的值，在此处T H是 斜坡持续时间的量级（order)。
[0249] 然后，当循环在F酒试比<FC>稍微大的力（F打开和F酒试）中进入平台期（plateaus) 时，可以进行循环以获得在可测量范围内的Th。
[0250] ??试和N循环:T测试应比Th大2或3倍。最后，循环数限定测量的整体精确度。为了 获得X %的准确度，我们需要Χ/100 = I/N阻断Zcomme P闭合=N阻断/N循环;在N循环=10000/ (X P阻断）。
[0251] 改进分析：由于各种问题频繁出现，酶的结合可以呈现短的以及很长的事件（图 9);最后的情况将会导致在测试阶段结束以及新循环开始的起始时，这种阻断仍然是有活 性的（图7)。由于阻断在打开阶段期间是隐藏的，延续连续循环的阻断是有可能的但未经 证实的事件。为了避免这种尴尬的局面，有可能采取这样的事实，即阻断通常在力低时很 短。因此，通过在测试后增加第三阶段，使用低的力时能够清理发夹任何结合的分子，当FSia= 0. 5ρΝ时Tsia = 2秒，我们为下一循环去除任何结合的分子并制备干净的发夹。分子 还可能存在几个结合位点，因此当在第一阻断之后分子又在第二结合位点进行阻断以及如 此等等时，阻断信号将具有阶梯表观（图10)。对于第二阻断，有效打开阶段是Tffff +Thwi (图10);如果Thw i大于T ，你更有可能在第一阻断弄乱动力学参数测量之后观察到第 二阻断。所以最好使用与Taw相比更大的Tffff以使这种影响最小化。
【主权项】
1. 一种用于确定蛋白与含有核酸序列的核酸分子结合的方法，所述方法包括步骤： a) 通过向含有核酸序列的双链核酸分子施加物理力，使所述分子变性； b) 提供所述蛋白； c) 在所述蛋白存在时使所述双链核酸分子复性； d) 检测双链核酸复性的阻断；以及 e) 确定所述阻断在所述双链核酸分子上的位置。2. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤b)中进一步提供与所述序列对应的单链核 酸分子。3. 根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述双链核酸分子是发夹。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中双链核酸的链之一的至少一个碱基 直接或间接地附着到表面，并且其中双链核酸另一条链的至少一个碱基附着到可移动的表 面。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在步骤a)中通过移开支持物使双链 核酸变性。6. 根据权利要求5所述的方法，其中通过移开支持物将物理力施加至双链分子，所述 物理力高于或等于15pN，优选高于或等于17pN，更优选高于或等于18pN。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在步骤c)中通过将支持物带至一起 而使变性的双链核酸复性。8. 根据权利要求7所述的方法，其中通过将支持物带至一起使施加至双链分子的力降 低到少于或等于12pN，优选少于或等于llpN，更优选少于或等于10pN。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中双链核酸未附着至支持物的端与另 一端共价或非共价相连。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中步骤a)至d)重复几次（以便积累 测量和增加信号/噪音比）。11. 根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤d)的检测包括测量双链核酸 分子附着至支持物的两端之间的距离（z)。12. 根据权利要求11所述的方法，其包括另一步骤，当双链核酸分子变性时，测量所述 双链核酸分子附着至支持物的两端之间的距离)。13. 根据权利要求12所述的方法，其中步骤e)还包括比较z和z s的在先步骤。14. 根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其包括测量阻断的持续时间的另一步 骤。15. 根据权利要求14所述的方法，其包括将阻断的持续时间与参考值相比较的另一步 骤。16. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其还包括测序所述蛋白结合的核酸序 列的步骤。17. -种用于鉴定含有能够结合特异性核酸-结合蛋白的序列的核酸分子的方法，所 述方法包括步骤： a) 提供双链核酸分子的群体； b) 通过权利要求1至16中任一项所述的方法，测试所述蛋白与所述核酸分子的结合； 以及 C)选择能够结合所述蛋白的核酸分子。18. -种用于检测双链核酸分子内所包含的至少一个修饰碱基的方法，所述方法包括 步骤： a) 提供所述双链核酸； b) 提供能够结合所述修饰碱基的蛋白；以及 c) 通过权利要求1至16中任一项所述的方法，测试所述蛋白与所述核酸分子的结合。19. 根据权利要求18所述的方法，其中修饰碱基选自4-甲基胞嘧啶（4mC)、5_甲基胞 嘧啶（5mC)、5-羟甲基胞嘧啶（5hmC)、5-甲酰胞嘧啶（5fC)、5-羰基胞嘧啶（5caC)、5-羟甲 基尿嘧啶（5hmU)和N6-甲基腺苷（m6A)。20. 根据权利要求18或19中任一项所述的方法，其中修饰碱基是5mC。21. 根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述蛋白是能够结合所述修饰碱 基的抗体。22. -种用于在双链核酸分子中检测至少一个错配的方法，所述方法包括步骤： a) 提供所述双链核酸分子； b) 提供能够结合错配碱基的蛋白；以及 c) 通过权利要求1-16中任一项所述的方法，测试所述蛋白与所述核酸分子的结合。23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述蛋白选自MutS二聚体、Msh2/Msh6 (MutS a ) 和 Msh2/Msh3(MutS 0)。24. -种用于在核酸分子所含有的序列中检测SNP的方法，所述方法包括步骤： a) 将所述核酸与含有在大多数群体中发现的序列的单链核酸杂交；以及 b) 通过权利要求22或23中任一项所述的方法，检测所得的错配。25. -种用于鉴定能够阻止蛋白和其结合位点之间相互作用的至少一种化合物的方 法，所述方法包括步骤： a) 提供所述蛋白和含有对应着所述结合位点的序列的核酸分子； b) 提供化合物；以及 c) 通过权利要求1至16中任一项所述的方法，测试所述蛋白与所述核酸分子的结合。
【专利摘要】本发明涉及用于确定蛋白是否结合特异性DNA序列的方法。这种方法特别用于通过特异性识别这些修饰的蛋白(例如，抗体)的结合来鉴定DNA序列的修饰(如甲基化)，也用于鉴定各种蛋白在DNA上的结合序列。
【IPC分类】C12Q1/68, G01N33/557
【公开号】CN105122063
【申请号】CN201480017389
【发明人】D·邦西蒙, V·克罗凯特, H·古埃, J-F·阿莱曼德, 丁方圆
【申请人】国家科学研究中心, 巴黎高等师范学院, 皮埃尔和玛利居里大学(巴黎第六大学)
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2014年1月22日
【公告号】CA2898151A1, EP2948774A1, US20150362488, WO2014114687A1