)的基于生物标志物的方法。具体 地，检测了取自怀疑患有AD或有发展为AD风险对象的患者的流体样本中生物标志物的相 对水平或浓度对象。在本发明的内容中，将诊断AD的实用性作为一个实例。然而，本发明 设想其也可被用于监测AD的进程，以及诊断和监测其它形式的痴呆和认知障碍，这些包括 但不限于：帕金森痴呆、路易体痴呆、血管痴呆、轻微认知损伤、额颞痴呆。在本发明的内容 中，术语"生物标志物"指存在于患者生物样本中的分子，其在所述生物流体中的水平可以 指示阿尔兹海默症。这种分子可以包括肽/蛋白或核酸及其衍生物；在本
【发明内容】
中，术 语"相对水平"指来自生物分析的光强度或吸光度读数（然而该发明不限于使用这些技术 进行测定，技术人员将意识到其它检测生物分子的方法，这些方法不利用测定可见光的性 质来确定测量），所述生物分析通过比较给定生物样本与具有已知的生物标志物浓度（此 浓度可以为〇)的参考材料的生物标志物水平得到，或通过生物样本中的生物标志物与已 知含有所述生物标志物的参考材料直接竞争结合所述生物标志物的特定探针的水平得到， 后一种方法产生与所述生物标志物的浓度负相关的水平；本
【发明内容】
中的术语"探针"指 与生物标志物的区域特异性结合的合成的或生物分子；本
【发明内容】
中的术语"有发展为阿 尔兹海默症的风险"指患者表现出了早期临床症状，诸如通过本领域已知的方法（如MMSE) 确定的轻微的认知障碍（MCI)或血管痴呆、有阿尔兹海默症家族史、有阿尔兹海默症的遗 传流行（genetic prevalence)，或因为生活方式被分类为"有风险"（如年龄、饮食、总体 健康状况、职业、地理位置）；本
【发明内容】
中的术语"遗传流行"指患者基因组中含有某种 蛋白的特定基因型，本领域已知此种蛋白在患有AD的患者中发生改变，其包括但不限于， 载脂蛋白E(Ap 〇E4)和谷胱甘肽S-转移酶Ql(GSTO)，这可以通过基因分型或鉴定患者的 生物流体中表达的蛋白的疾病相关形式来测定。更具体地，应当测定编码Ap 〇E4和野生型 GSTO(WtGSTO)变体的等位基因的数量。本
【发明内容】
中的术语WtGSTO指在基因组序列中不 含有rs4825突变、或在蛋白序列的140位残基将丙氨酸替换为天冬氨酸的GSTO的任何变 体。本发明描述了不同的生物标志物在诊断AD中的用途，所述生物标志物单独使用或与其 它诊断方法组合使用或作为补充的生物标志物使用。本
【发明内容】
中，补充的生物标志物指 可以与其它AD生物标志物一起使用的生物标志物。
[0029] 本发明第一方面描述了在怀疑患有AD或有患AD风险的患者中诊断AD的方法， 所述方法包括：得到患者的体外样本，测定Afamin和选自表1的一种或多种生物标志物的 相对水平或浓度，确定Afamin和一种或多种生物标志物的相对水平或浓度的显著性。相 对水平或浓度的显著性，通过将特定生物标志物的相对水平或浓度与对照值进行比较来判 定。对照值来自对取自未患有AD的个体的生物样本中所述生物标志物的相对水平或浓度 的测定，对象如通过临床评估所确定。对于Afamin，在患有AD的患者中，其相对水平或浓 度低于对照值。本发明的一个优选实施方案使用将Afamin与至少一种其它生物标志物的 组合的方法，所述其它生物标志物选自：α -1-抗胰凝乳蛋白酶、α -2-巨球蛋白、载脂蛋白 Β100、补体C3、丝氨酸苏氨酸激酶TANK结合激酶-I (TBKl)、维生素 D结合蛋白、a -I-B糖 蛋白、血液结合素、血清白蛋白、血浆铜蓝蛋白、α-2-抗纤维蛋白溶酶、载脂蛋白AU补体 因子H、IgG、IgG fc结合蛋白、角蛋白、纤维蛋白原或补体C5。又一优选实施方案，本发明 使用下述方法：将Afamin的相对水平或浓度除以α -1-抗胰凝乳蛋白酶的相对水平或浓 度，从而得到Afamin/α -1-抗胰凝乳蛋白酶的比例。本发明实施方案内容中的术语"比例" 涉及将一种生物标志物的值除以另一种的值，对这两种生物标志物而言，该值应当相同，并 且可以用给定体积（浓度）中生物标志物的重量或摩尔来表示，或者用通过实验手段得 到的光强度或吸光度水平（相对水平）来表示。本发明的又一个实施方案，利用Afamin/ α-1-抗胰凝乳蛋白酶的比值与一种或多种生物标志物的相对水平或浓度的组合，所述生 物标志物选自：α -1-抗胰凝乳蛋白酶、α -2-巨球蛋白、载脂蛋白Β100、补体C3、丝氨酸苏 氨酸激酶ΤΒΚ-1、维生素 D结合蛋白、a -I-B糖蛋白、血液结合素、血清白蛋白、血浆铜蓝蛋 白、α-2-抗纤维蛋白溶酶、载脂蛋白AU补体因子H、IgG、IgG fc结合蛋白、角蛋白、纤维 蛋白原或补体C5。例如，本发明的一个优选组合为，Afamin/ α -1-抗胰凝乳蛋白酶的比例 与补体C3的相对水平或浓度的组合。本发明另一优选组合为，Afamin/ α -1-抗胰凝乳蛋 白酶的比例与丝氨酸苏氨酸激酶TBK-I的组合。
[0030] 本发明的又一方面针对Afamin、α-1-抗胰凝乳蛋白酶、α-2-巨球蛋白、载脂蛋 白Β100、补体C3、丝氨酸苏氨酸激酶TBK-I、维生素 D结合蛋白、a -I-B糖蛋白、血液结合 素、血清白蛋白、血浆铜蓝蛋白、α-2-抗纤维蛋白溶酶、载脂蛋白AU补体因子H、IgG、IgG fc结合蛋白、角蛋白、纤维蛋白原或补体C5中的一种或多种作为AD的补充生物标志物的用 途。作为补充生物标志物，它们可以与其它的临床证据（如精神状态评估（MMSE)、神经影像 学检查、β -淀粉样多肽、磷酸化的Tau蛋白、ApoE基因型和野生型GSTOl基因型（WtGSTO)) 一起用于AD诊断。在本
【发明内容】
中，基于输出的检测，可以向预测模型中加入该临床证 据。例如，可以通过下述方法测定患者的ApoE的状态：通过基因分型，通过鉴定在基因水平 (DNA和/或RNA)表达的蛋白的疾病相关形式，或通过检测取自患者的流体样本中蛋白的特 定表达形式的存在。在本发明的内容中，该输出（output)表述为二分式值（dichotomised value)，由此患者为Ap 〇E4基因或蛋白阳性或非阳性；或表述为患者基因组DNA中存在的 ApoE等位基因的数量的顺序输出（0-2)，其可以通过取自患者的样本中基因或蛋白的相对 水平来计算。
[0031] 可以通过将样本与探针接触来测定生物标志物的相对水平或浓度，优选地探针被 固定于基质上，且对包含于生物标志物的组合中的每种生物标志物具有特异性。可以使用 本领域熟知的不同技术来监测和量化生物标志物与其各自的探针之间的相互作用。合适的 技术的一个实例为酶联免疫吸附实验（ELISA)。实施ELISA涉及对特定抗原具有特异性的 至少一种抗体。将含有未知量的抗原的样本固定于固相载体上（通常为聚苯乙烯微量滴定 板），固定可以是非特异性的（通过吸附至表面）或特异性的（在"三明治"ELISA中，通过 被对同种抗原具有特异性的另一抗体捕获）。抗原被固定后，加入检测抗体，其与抗原形成 复合物。检测抗体可以共价地与酶连接，或者可以由通过生物偶联与酶连接的第二抗体来 检测自身。在每一步骤之间，通常洗涤该板以移除未特异性结合的任何蛋白或抗体。在最后 的洗涤步骤后，通过添加酶底物来处理该板以产生可见信号，该信号显示样本中抗原的量。
[0032] 在本发明的一个优选实施方案中，"样本（sample)"在本文指血清或血浆，但是也 可以是取自患者的任何样本，其中可以测定其生物标志物的水平或浓度。这些包括但不限 于：全血、尿、唾液、脑脊液和血小板。
[0033] 所述基质包含至少两种，优选三种或四种探针，每种探针对单独一种生物标志物 是特异的。本文使用的术语"特定的（specific)"指探针只与本发明的一种生物标志物结 合，而其与本发明其它生物标志物或与被分析的生物样本中其它分析物的结合可被忽略。 这确保了使用本发明生物标志物的诊断分析（assay)和结果的完整性不因其他的结合事 件而受损。