r>[0034] 所述基质可以是能够支撑一种或多种探针的任何表面，但优选为生物芯片。"生物 芯片"是进行化学、生物化学、蛋白质组学或分子测试的反应平台的通用术语，其在医学诊 断、药物检测等也可能需要。典型地，生物芯片包括惰性基质，如硅、玻璃或陶瓷（在表面区 域通常为约Icm 2或更小），其上提供一个或多个反应位点。所述位点通常携带一种或多种 配体，例如一种或多种抗体，选择其用于将实施的测试（或分析），通过与应用到芯片上的 样本（如血液样本）和/或试剂结合而吸附到芯片表面被激活。可以使用很多可选的技术 来检测反应，包括检测反应产生的化学发光。一些生物芯片携带大量（数百或数千）的此 种测试位点，通常将其排列在一个网格或阵列中，使得使用同一样本，同时进行多个分析成 为可能。当鉴定本发明中各种各样的生物标志物/蛋白时，除鉴定全长的蛋白外，鉴定蛋白 的一个片段或多个片段对本领域技术人员将是显而易见的，只要允许准确地鉴定蛋白。同 样地，尽管本发明的优选探针是多克隆或单克隆抗体，也可以使用其它的探针如适配子、分 子印迹聚合物、噬菌体、短链抗体片段和其它的基于抗体的探针。本发明也允许使用核酸序 列探针。
[0035] 优选地，本发明的方法中使用固态元件，优选生物芯片阵列技术系统（BAT)(可 从 Randox Laboratories Limited 得到）。更优选地，可以使用 Evidence Evolution 和 Evidence Investigator检测仪（可从Randox Laboratories得到）测定样本中的生物标 志物水平。
[0036] 根据本发明使用的统计方法的准确性可以通过它们的接收器操作特征（ROC)进 行最好的描述。ROC曲线显示了测试的敏感性、真阳性的数量，以及特异性、真阴性的数量。 因此，生物标志物的给定组合的敏感性和特异性值是分析准确性的指示。例如，如果生物标 志物组合的敏感性和特异性值为80%，通过测定生物标志物的特定组合的存在，在100名 患者中将会正确地鉴定出80名作为疾病阳性，在没有疾病的100名患者中，将会有80名被 正确地测试为疾病阴性。
[0037] 如果在诊断方法中使用两种或更多生物标志物，可以推导出合适的数学或机器学 习分类模型，如逻辑回归方程。逻辑回归方程可以包括其它的变量，如患者的年龄和性别。 可以使用ROC曲线来评估逻辑回归模型的准确性。可以独立使用或在算法中使用逻辑回归 方程以帮助做出临床决策。尽管逻辑回归方程是在此种情况中常用的数学/统计学方法， 在本发明中也是优选的，也可以使用其它的数学/统计学、决策树或机器学习方法。
[0038] 通过示例的方式，可以按下述计算适用于本发明的逻辑回归方程（分类截止值）， 其为针对所述生物标志物组合的怀疑患有或有发展为AD风险的患者中AD相对于非AD (对 照）的指示：
[0040] 作为又一实例，决策树可以在决策分支从每一节点（亚群）生长的位置生长，以将 群分至分类组。图19表示使用本发明的数据进行生长的树的一个实例，其可以用相对小的 误差将所有的AD患者正确分类。
[0041] 方法
[0042] 1.标准化血楽_/Quantiplasma?
[0043] 按照US 2009/0136966实施血浆标准化。简而言之，通过使用适当的方法移除高 丰度的蛋白将人血浆标准化。首先，使用多亲和移除系统（MRS)技术移除高丰度的蛋白。 然后将得到的血浆加载于多免疫亲和标准化（MIAN)柱，在此通过改变流动速率调节标准 化的严密性。将流过的样本（flow-throw)与洗涤样本组合以产生差异的标准化样本。然 后将这些标准化血浆中的一些泛生物素化以提供示踪物质，被称为Quantiplasma?。
[0044] 2.抗体产生
[0045] 按照US 2009/0136966生产单克隆抗体。使用标准化的血浆作为免疫原以产生 多克隆抗体。然后将B细胞分离并产生单克隆杂交瘤。使用ELISA进行杂交瘤的初始筛 选。用鼠 Ig γ -Fc特异的GAM包被板，然后与mAb杂交瘤上清孵育，洗涤步骤后将复合物与 Quantiplasma?孵育，最终诱导酶-底物反应来检测生物素化的血衆（Quantiplasma ?)与 mAb的结合。这一选择鉴定出多于lOOOmAb。为了鉴定本研究中使用的单克隆抗体的革巴蛋 白，采用了 Western印迹、免疫沉淀和质谱分析技术。然而，有些抗原当时并未鉴定出来，但 是由于已知它们存在于人血浆蛋白质组中，它们已经包含在内。
[0046] 3.使用Quantiplasma?鉴定临床生物标志物
[0047] 血清样本取自19个临床确诊的阿尔兹海默症（AD)患者和19个有正常认知功能 的年龄/性别匹配的对照参与者。这些样本在收集之后不久被冷冻并保存于（-80°C)直 至进行分析。收集这些对象的另外的临床信息，包括基本的个人和家族病史。进一步，通 过本领域已知的方法测定ApoE和GSTO的基因型。对于每个患者，分离基因组DNA，并且 利用聚合酶链式反应（PCR)技术测定ApoE (E2、E3、E4) 3种亚型或GSTO (野生型、突变体 A140[rs4825])中每一种编码DNA的存在。进一步的分析允许通过本领域已知的方法测定 每一亚型的等位基因频率。
[0048] 从第二部分产生的> 1000的目录中选出一组69个mAb抗体（表1)。然后通过竞 争性免疫测定对抗体进行评估。首先将它们固定于生物芯片平台（9_X9mm)，这是免疫反 应的基质。使用半自动台式分析仪Evidence Investigator (EV3602, Randox Laboratories Ltd. , Crumlin, UK,专利-EP98307706、EP98307732、EP0902394、EP1227311、EP1434995 和 EP1354623)。测定原理基于无抗原（患者样本）和标记的示踪血衆（Quantiplasma?)对单 克隆抗体结合位点的竞争。
[0049] 向生物芯片中加入样本和试剂，并将其在受控条件下进行孵育。加入基质后产生 光信号，然后利用数字成像技术检测该信号。该系统包含专门的软件以自动地处理、报告和 存档产生的数据。通过如下来测定患者样本中的特定蛋白的水平：比较含有样本和示踪物 (测试）的生物芯片与只含有示踪物（空白）的生物芯片在各自相应的抗体位置的光信号 (RLU)差异。按下述测定测试样本与对照样本的比例：
[0051] 高比例显示样本中存在相对较高水平的对各自相应mAb具有特异性的蛋白，低 比例显示样本中存在相对少量的或不存在所述蛋白。针对全部mAbs测定AD患者与对照 患者的比例（实例图1-9)，并且进行非参数分析，以鉴定能够区分AD和对照患者的那些 mAbs (表2)。针对全部mAbs计算接收器操作特征（ROC)曲线的曲线下面积（AUC)，这些在 表3中详细说明。
[0052] 4.疾病分类模型
[0053] 作为如何组合本研究鉴定的多种标志物以提供对疾病状况未知的病人进行分类 的模型的一个实例，我们使用逻辑回归作为模型测定的方法。初始调查显示，组合使用 Afamin(BSI0268)和α-1-抗胰凝乳蛋白酶（BSI0221)的相对水平，产生了 AUC为0. 906 的模型（图10-13)，单独测定的预测能力有显著提升。为了将进一步的分析物加入模 型中，在不增加维数的情况下，把Afamin (BSI0268)的函数作为α-1-抗胰凝乳蛋白酶 (BSI0221)的比例用作单一变量（AUC = 0. 875)，并分析系统地向模型中加入全部其它分析 物的效果。向模型中加入补体C3(BSI0217)、α -2巨球蛋白（BSI0195)、丝氨酸苏氨酸蛋白 激酶 TBK1(BSI0112)或补体 C5(BSI0782)改进