区(C)同 时出现紫色线，但检测线区（T)出现的颜色很浅；c、阴性:在观察孔内，只有对照线区（C)出 现紫色线;d、失效:在观察孔内，对照线区（C)和检测线区（T)都不出现紫色线;或仅检测线 区(T)出现紫色线。
[0018] 其中，步骤(2)中所述孵育震荡是在37°C反应10-50min;优选的，37°C反应30min; 步骤(4)中所述酶联试剂的稀释倍数为100-500倍;优选的稀释倍数为300倍;所述孵育震荡 是在37°C反应10-50min;优选的，37°C反应30min;步骤(5)中所述的室温下反应的时间为5-20min;优选的，时间为10min。
[0019] 为了提高试剂盒检测的灵敏度及准确性，本发明对血清样本最适反应时间、酶联 试剂工作浓度及最适反应时间、底物最适反应时间等参数进行了优化。
[0020] 对于血清样本最适反应时间的优化:加入血清样本后，在37 °C作用10、20、30、40、 50分钟，方阵试验，酶联试剂稀释度为1:300，经孵育、显色、终止后采用柯达(1( 〇(1&1〇0-14灰 阶卡进行判断分析。以显色强毒14以上、阴性血清对照不出现斑点确定为血清最适反应时 间。最终确定血清反应工作时间为37 °C作用30分钟。
[0021] 对于酶联试剂工作浓度的优化：用样品稀释液稀释碱性磷酸酶标记的兔抗猪IgG 至1:100、1:200、1:300、1:400、1:500不同的工作浓度，分别与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪 狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病 毒、猪IgG等标准阳性血清进行方阵检测，经孵育、显色、终止后采用柯达(Kodak)Q-14灰阶 卡进行判断分析。以显色强度14以上、阴性血清对照不出现斑点确定为血清最适反应时间。 最终确定酶联试剂实际使用工作浓度为1:300。
[0022] 对于酶联试剂最适反应时间的优化:用样品稀释液稀释碱性磷酸酶标记的兔抗猪 IgG至1:300的工作浓度，在37°C作用10、20、30、40、50分钟，分别与猪瘟病毒、猪细小病毒、 猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感 病毒、猪IgG等标准阳性血清检测方阵试验，经显色、终止后采用柯达(Kodak)Q-14灰阶卡进 行判断分析。以显色强度14以上、阴性血清对照不出现斑点确定为血清最适反应时间。最终 确定酶联试剂的最佳工作时间为30分钟。
[0023] 对于底物最适反应时间的优化:加入底物后反应5分钟、10分钟、15分钟、20分钟， 终止后采用柯达(Kodak)Q-14灰阶卡进行判断分析，确定最佳判断时间。以显色强度14以 上、阴性血清对照不出现斑点确定为血清最适反应时间。最终确定底物最适反应时间为10 分钟。
[0024] 本发明技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：
[0025] 本发明试剂盒可以准确的检测出猪瘟病毒抗体、猪细小病毒抗体、猪伪狂犬病病 毒抗体、猪蓝耳病毒抗体、猪圆环病毒抗体、猪流行性腹泻病毒抗体、猪传染性胃肠炎病毒 抗体、猪流感病毒抗体等，具有敏感度高、特异性强、准确性好，操作简便，样品消耗少，肉眼 判断，无需仪器，结果判断客观等优点，大大提高了检测效率，用于猪疫病免疫水平的监测。
【附图说明】
[0026] 图1试剂盒反应卡示意图；
[0027]图2为抗原最适工作浓度的优化:A:CSFV不同抗原浓度显色强度变化曲线图；B: PPV不同抗原浓度显色强度变化曲线图；C:PRV不同抗原浓度显色强度变化曲线图；D:PRRSV 不同抗原浓度显色强度变化曲线图；E: PCV2不同抗原浓度显色强度变化曲线图；F: PEDV不 同抗原浓度显色强度变化曲线图；G:TGEV;H:SIV(H1+H3)不同抗原浓度显色强度变化曲线 图；I:猪IgG不同浓度显色强度变化曲线图；
[0028]图3为血清最适反应时间的优化:A:CSFV加入血清后不同时间显色强度变化曲线 图；B: PPV加入血清后不同时间显色强度变化曲线图；C: PRV加入血清后不同时间显色强度 变化曲线图；D: PRRSV加入血清后不同时间显色强度变化曲线图；E: PCV2加入血清后不同时 间显色强度变化曲线图；F:PEDV加入血清后不同时间显色强度变化曲线图；G:TGEV加入血 清后不同时间显色强度变化曲线图；H:SIV(H1+H3)加入血清后不同时间显色强度变化曲线 图；I:猪IgG加入血清后不同时间显色强度变化曲线图；
[0029] 图4为酶联试剂工作浓度的优化:A:CSFV不同酶联试剂浓度的显色强度变化曲线 图；B:PPV不同酶联试剂浓度的显色强度变化曲线图；C:PRV不同酶联试剂浓度的显色强度 变化曲线图；D: PRRSV不同酶联试剂浓度的显色强度变化曲线图；E: PCV2不同酶联试剂浓度 的显色强度变化曲线图；F:PEDV不同酶联试剂浓度的显色强度变化曲线图；G:TGEV不同酶 联试剂浓度的显色强度变化曲线图；H:SIV(H1+H3)不同酶联试剂浓度的显色强度变化曲线 图；I:猪IgG最适工作浓度的优化；
[0030] 图5为酶联试剂的最佳工作时间的优化:A: CSFV酶联试剂不同反应时间的显色强 度变化曲线图；B:PPV酶联试剂不同反应时间的显色强度变化曲线图；C:PRV酶联试剂不同 反应时间的显色强度变化曲线图；D:PRRSV酶联试剂不同反应时间的显色强度变化曲线图； E:PCV2酶联试剂不同反应时间的显色强度变化曲线图；F:PEDV酶联试剂不同反应时间的显 色强度变化曲线图；G: TGEV酶联试剂不同反应时间的显色强度变化曲线图；H: SIV(H1+H3) 酶联试剂不同反应时间的显色强度变化曲线图；I:猪IgG最适工作浓度的优化；
[0031] 图6为底物反应时间的优化:A: CSFV底物不同反应时间显色强度变化曲线图；B: PPV底物不同反应时间显色强度变化曲线图；C:PRV底物不同反应时间显色强度变化曲线 图；D: PRRSV底物不同反应时间显色强度变化曲线图；E: PCV2底物不同反应时间显色强度变 化曲线图；F: PEDV底物不同反应时间显色强度变化曲线图；G: TGEV底物不同反应时间显色 强度变化曲线图；H: SIV(HI +H3)底物不同反应时间显色强度变化曲线图；I:猪IgG最适工作 浓度的优化。
【具体实施方式】
[0032]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域 技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和 形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0033]实施例1试剂盒的制备 [0034] 1、反应卡的制备
[0035] 1.1包被
[0036]将0.5ul的含有不同浓度的8种猪病特异性抗原及猪IgG，用全自动点样仪划线于 硝酸纤维素膜上，其中，猪瘟病毒(CSFV)抗原浓度2. Oug/ml，猪细小病毒(PPV)抗原浓度 1. Oug/ml，猪伪狂犬病毒(PRV)抗原浓度4. Oug/ml，猪蓝耳病毒(PRRSV)抗原浓度3. Oug/ml， 猪圆环病毒(PCV2)抗原浓度l.Oug/ml，猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗原浓度3.0ug/ml，猪传 染性胃肠炎病毒(TGEV)抗原浓度5.Oug/ml，猪流感病毒(SIV)抗原浓度3.Oug/ml，猪IgG抗 原浓度1. Oug/ml，4 °C包被16-24个小时。具体的，如图1所示，其中，用于划线的形式不局限 于所表示的形式，各种抗原的排列顺序可以进行任意调整。
[0037] 1.2封闭
[0038] 用 50-200ul 的封闭液（含0.05-0.5%Tween20，l-5%BSA，5-10% 脱脂奶粉，5-10% 蔗糖，0.01-0.1M磷酸盐缓冲液或者Tris缓冲液），37°C封闭0.5-3小时，用10倍稀释的浓缩 洗液洗涤。晾干后，于2-8 °C保存备用。
[0039] 1.3固定载片
[0040]将所制备的检测膜条固定在载片上，其中每一抗原或检测线对应或放置于载片反 应区中一个彼此分隔的反应槽(长8_、宽4_、高4mm的长方槽）中，形成独立的检测区域，得 到反应卡。
[0041 ] 2、试剂盒的组装
[0042] 反应卡1个，标准品1 X0.02ml、酶联试剂1 X3ml、样品稀释液1 X 100ml、浓缩洗涤 液1 X 50ml、显色液1 X 30ml。
[0043] 实施例2试剂盒的制备
[0044] 1、反应卡的制备
[0045] 1.1包被
[0046] 将0.5ul的含有不同浓度的8种猪病特异性抗原及猪IgG，用全自动点样仪划线于 硝酸纤维素膜上，其中，猪瘟病毒(CSFV)抗原浓度0.1ug/ml，猪细小病毒(PPV)抗原浓度 0.1ug/ml，猪伪狂犬病毒(PRV)抗原浓度0.1ug/ml，猪蓝耳病毒(PRRSV)抗原浓度0.1ug/ml， 猪圆环病毒(PCV2)抗原浓度O.lug/ml，猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗原浓度O.lug/ml，猪传 染性胃肠炎病毒(TGEV)抗原浓度0. lug/ml，猪流感病毒(SIV)抗原浓度0. lug/ml，猪IgG抗 原浓度0.1 ug/ml，4 °C包被16-24个小时。具体的，如图1所示，其中，用于划线的形式不局限 于所表示的形式，各种抗原的排列顺序可以进行任意调整。
[0047] 1.2封闭
[0048] 用 50-200ul 的封闭液（含0.05-0.5%Tween20，l-5%BSA，5-10% 脱脂奶粉，5-10% 蔗糖，0.01-0.1M磷酸盐缓冲液或者Tris缓冲液），37°C封闭0.5-3小时，用10倍稀释的浓缩 洗液洗涤。晾干后，于2-8 °C保存备用。
[0049] 1.3固定载片
[0050