]将所制备的检测膜条固定在载片上，其中每一抗原或检测线对应或放置于载片反 应区中一个彼此分隔的反应槽(长8_、宽4_、高4mm的长方槽）中，形成独立的检测区域，得 到反应卡。
[0051 ] 2、试剂盒的组装
[0052] 反应卡1个，标准品1 XO.02ml、酶联试剂1 X3ml、样品稀释液1 X 100ml、浓缩洗涤 液1 X 50ml、显色液1 X 30ml。
[0053]实施例3试剂盒的制备 [0054] 1、反应卡的制备
[0055] 1.1包被
[0056]将0.5ul的含有不同浓度的8种猪病特异性抗原及猪IgG，用全自动点样仪划线于 硝酸纤维素膜上，其中，猪瘟病毒(CSFV)抗原浓度5.0ug/ml，猪细小病毒(PPV)抗原浓度 5. Oug/ml，猪伪狂犬病毒(PRV)抗原浓度5. Oug/ml，猪蓝耳病毒(PRRSV)抗原浓度5. Oug/ml， 猪圆环病毒(PCV2)抗原浓度5. Oug/ml，猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗原浓度5. Oug/ml，猪传 染性胃肠炎病毒(TGEV)抗原浓度5.Oug/ml，猪流感病毒(SIV)抗原浓度5.Oug/ml，猪IgG抗 原浓度5. Oug/ml，4 °C包被16-24个小时。具体的，如图1所示，其中，用于划线的形式不局限 于所表示的形式，各种抗原的排列顺序可以进行任意调整。
[0057] 1.2封闭
[0058] 用 50-200ul 的封闭液（含0.05-0.5%Tween20，l-5%BSA，5-10% 脱脂奶粉，5-10% 蔗糖，0.01-0.1M磷酸盐缓冲液或者Tris缓冲液），37°C封闭0.5-3小时，用10倍稀释的浓缩 洗液洗涤。晾干后，于2-8 °C保存备用。
[0059] 1.3固定载片
[0060] 将所制备的检测膜条固定在载片上，其中每一抗原或检测线对应或放置于载片反 应区中一个彼此分隔的反应槽(长8_、宽4_、高4mm的长方槽）中，形成独立的检测区域，得 到反应卡。
[0061 ] 2、试剂盒的组装
[0062] 反应卡1个，标准品1 XO.02ml、酶联试剂1 X3ml、样品稀释液1 X 100ml、浓缩洗涤 液1 X 50ml、显色液1 X 30ml。
[0063]实施例4试剂盒的使用方法
[0064] 样品要求:静脉取血2-5ml，置试管待凝固后离心分离血清，血清样本保存2-8°C， 在24小时内不能测试的标本应放-20°C，严重溶血，有絮状物或霉变的血清标本会影响测 试。
[0065] 1、加样
[0066] 用样品稀释液(磷酸盐缓冲液)按照1:100稀释血清样本，反应卡的每一反应槽中 加入lOOul稀释血清样本，放入孵育震荡器。37°C反应30分钟。
[0067] 2、洗板
[0068]样本反应结束后，弃去反应液，振荡洗涤3 X 5min。
[0069] 3、加入酶联试剂
[0070]碱性磷酸酶标记的兔抗猪IgG的抗体300倍稀释，向每一反应槽中加入lOOul，放入 孵育振荡器，37°C反应30分钟。反应结束后洗膜。
[0071] 4、检测
[0072] 每一反应槽加入配置好的显色液lOOul，室温10min观察结果。
[0073] 5、结果判定
[0074] a、阳性：在观察孔内，检测线区（T)及对照线区（C)同时出现紫色线。抗体滴度越 高，检测线(T)颜色越深。
[0075] b、弱阳性:在观察孔内，检测线区(T)及对照线区(C)同时出现紫色线，但检测线区 (T)出现的颜色很浅；
[0076] c、阴性:在观察孔内，只有对照线区（C)出现紫色线；
[0077] d、失效:在观察孔内，对照线区（C)和检测线区（T)都不出现紫色线;或仅检测线区 (T)出现紫色线。
[0078]实施例5试剂盒的使用方法：
[0079] 样品要求:静脉取血2_5ml，置试管待凝固后离心分离血清，血清样本保存2_8°C， 在24小时内不能测试的标本应放-20°C，严重溶血，有絮状物或霉变的血清标本会影响测 试。
[0080] 1、加样
[0081] 用样品稀释液(磷酸盐缓冲液)按照1:100稀释血清样本，反应卡的每一反应槽中 加入lOOul稀释血清样本，放入孵育震荡器。37°C反应10分钟。
[0082] 2、洗板
[0083] 样本反应结束后，弃去反应液，振荡洗涤3 X 5min。
[0084] 3、加入酶联试剂
[0085]碱性磷酸酶标记的兔抗猪IgG的抗体100倍稀释，向每一反应槽中加入lOOul，放入 孵育振荡器，37°C反应10分钟。反应结束后洗膜。
[0086] 4、检测
[0087] 每一反应槽加入配置好的显色液lOOul，室温5min观察结果。
[0088] 5、结果判定
[0089] a、阳性：在观察孔内，检测线区（T)及对照线区（C)同时出现紫色线。抗体滴度越 高，检测线(T)颜色越深。
[0090] b、弱阳性:在观察孔内，检测线区(T)及对照线区(C)同时出现紫色线，但检测线区 (T)出现的颜色很浅；
[0091] c、阴性:在观察孔内，只有对照线区(C)出现紫色线；
[0092] d、失效:在观察孔内，对照线区（C)和检测线区（T)都不出现紫色线;或仅检测线区 (T)出现紫色线。
[0093]实施例6试剂盒的使用方法：
[0094] 样品要求:静脉取血2-5ml，置试管待凝固后离心分离血清，血清样本保存2-8°C， 在24小时内不能测试的标本应放-20°C，严重溶血，有絮状物或霉变的血清标本会影响测 试。
[0095] 1、加样
[0096] 用样品稀释液(磷酸盐缓冲液)按照1:100稀释血清样本，反应卡的每一反应槽中 加入lOOul稀释血清样本，放入孵育震荡器。37°C反应50分钟。
[0097] 2、洗板
[0098]样本反应结束后，弃去反应液，振荡洗涤3 X 5min。
[0099] 3、加入酶联试剂
[0100]碱性磷酸酶标记的兔抗猪IgG的抗体500倍稀释，向每一反应槽中加入lOOul，放入 孵育振荡器，37 °C反应50分钟。反应结束后洗膜。
[0101] 4、检测
[0102] 每一反应槽加入配置好的显色液lOOul，室温20min观察结果。
[0103] 5、结果判定
[0104] a、阳性：在观察孔内，检测线区（T)及对照线区（C)同时出现紫色线。抗体滴度越 高，检测线(T)颜色越深。
[0105] b、弱阳性:在观察孔内，检测线区(T)及对照线区(C)同时出现紫色线，但检测线区 (T)出现的颜色很浅；
[0106] c、阴性:在观察孔内，只有对照线区(C)出现紫色线；
[0107] d、失效:在观察孔内，对照线区（C)和检测线区（T)都不出现紫色线;或仅检测线区 (T)出现紫色线。
[0108] 实验例1有关参数的优化
[0109] 1、实验方法
[0110] 1.1抗原最适工作浓度的优化
[0111]用优化好的包被缓冲液，将包被抗原稀释成Ο . lug/ml，1. Oug/ml，2 . Oug/ml， 3. Oug/ml，4. Oug/ml，5. Oug/ml等六个浓度，点样于单诊膜片，分别与猪瘟病毒、猪细小病 毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪 流感病毒、猪IgG等标准阳性血清进行方阵检测，酶联试剂稀释度为1:300,经孵育、显色、终 止后采用柯达(Kodak)Q-14灰阶卡进行判断分析。该灰阶卡从白到黑共20个阶调，其中0为 白色，20为黑色，数字越大颜色最深，本试验将检测线显色及诊断膜片背景颜色分别与灰阶 卡比对，显色强毒为检测线显色及诊断膜片背景颜色的色差，即色差越大，显色强毒越强。 显色的强度在一定范围内与包被的抗原量成正比，但随着包被抗原浓度的增加，显色的强 度反而降低，以阴性血清对照不出现斑点、阳性血清抗体效价最高，显色强度14以上的最低 抗原包被浓度确定为抗原最佳工作浓度。其中，优化好的包被缓冲液为PBST(pH值7.4)，见 表1。
[0112] 表1 PBSI1 配方（1L)
[0113]
[0114] 1.2血清最适反应时间的优化
[0115] 加入血清后，在37°C作用10、20、30、40、50分钟，方阵试验，酶联试剂稀释度为1: 300,经孵育、显色、终止后采用柯达(Kodak)Q-14灰阶卡进行判断分析。显色的强度在一定 范围内与血清的反应时间成正比，但随着时间的增加，检测线的颜色不变，背景颜色变深， 以显色强度14以上、阴性血清对照不出现斑点确定为血清最适反应时间。
[0116] 1.3酶联试剂工作浓度的优化
[0117] 用样品稀释液稀释碱性磷酸酶标记的兔抗猪IgG至1:100、1:200、1:300、1:400、1: 500不同的工作浓度，分别与猪痕病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病 毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒、猪IgG等标准阳性血清进行方阵 检测，经孵育、显色、终止后采用柯达(Kodak)Q-14灰阶卡进行判断分析。显色强度在一定范 围内与酶联试剂工作浓度成正比，但酶联试剂工作浓度增加，检测线的颜色不变，背景颜色 变深，以显色强度14以上、阴性血清对照不出现斑点确定为血清最适反应时间。
[0118] 1.4酶联试剂的最佳工作时间的优化
[0119] 用样品稀释液稀释碱性磷酸酶标记的兔抗猪IgG至1:300的工作浓度，在37°C作用 10、20、30、40、50分钟，分别与猪痕病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、