专利名称：菹草种苗快速繁殖的方法
技术领域：
本发明涉及菹草种苗的快速繁殖技术，也涉及菹草茎节组织培养的方法。适用于水生植被恢复工程的大量种苗需求，也可为水生园林景观、观赏水草培植提供种苗，以及为菹草研究提供无菌苗。
背景技术：
近年来，随着国家可持续发展战略的推行，以及社会发展水平和人们生活质量的提高，水污染治理和水环境质量的改善已引起全社会的强烈关注。国家和地方都已制订了相关的计划，或已经开展相关的科研和工程项目。如“十五”期间，国家科技部将“水污染控制技术与治理工程”作为国家12个重大科技专项之一，在无锡太湖、昆明滇池、深圳、上海、镇江等地已进行水生态修复工程；国家环保总局会同国家发展与改革委员会等部门和相关省、自治区、直辖市政府编制了“三河”“三湖”水污染防治“十五”计划，并已经国务院批复实施。“计划”共确定了1590个项目，总投资1234亿元。
在水污染和水环境质量的改善的措施中，在截污的前提下，重建水体生态系统，恢复健康水生态系统的自净能力被认为是长期稳定地解决水污染的根本措施。作为水生态系统的关键成员，沉水植物不仅在水体食物网、水体溶氧供应、营养循环、水生动物栖息方面起到重要作用，而且已证明沉水植被是维持水体清水状态的关键因素。然而水体的富营养化和过度养殖食草性鱼类已造成沉水植被的广泛退化，因此沉水植被的恢复是水体污染治理中的关键步骤。在滇池水污染治理环保工程，国家重大科技专项“武汉市汉阳地区水环境质量改善技术与综合示范”、“太湖水污染控制与水体修复技术及工程示范”等工程项目中，沉水植被的恢复都是其中的关键内容。
水生植被的恢复工程必然带来对水生植物种苗的大量需求。通常每平方米水面需要5-10株(蔸)水生植物种苗，而每平方公里水面则需要种苗上千万株(蔸)，即使每株种苗按0.2元计算，每平方公里水面所需种苗的费用也达二百万元。目前在水生植被的恢复工程中使用的种苗完全是从自然水体捞取，这种方法实质上是拆东墙补西墙的做法，不仅对种苗来源地的水生植物资源造成破坏，事实上也经常遇到种苗资源的缺乏，即无法获得某些植物的足够种苗量。除此之外，水生植物种苗的获得还常常受到季节的影响。因此，为了满足水生植物种苗的迫切需求，急需发展水生植物种苗新的来源方式。通过植物组织培养的方式快速繁殖水生植物的途径是一种完全可行的水生植物种苗的生产方法。植物组织培养是通过无菌操作分离植物体的一部分，接种到培养基，在人工控制条件下发展成为完整植株的过程。这类方式已经被广泛地应用于作物、药用植物、经济性林木和名优花卉的快速育苗中。这种方法可以在短时间内从数株植物生产出大量种苗，不仅占地面积小，而且不受季节影响，生产出的种苗去除了植物病毒，性状更为优良。在经济性植物的种苗方面，国内国外都有大量的公司从事商业性生产，如美国、欧洲及东南亚许多地区用组培方法进行兰花快繁，已成为著名的“兰花工业”。在生态恢复方面，美国已有三个商业性实验室利用这种方式生产湿生植物用于湿地生态系统的恢复工程。
菹草是我国浅水湖泊常见的沉水植物，有较好的耐污能力，常作为水生植被重建工程首选的先锋植物。由于沉水植物的表皮对杀菌剂的通透性强，因此以根、茎、叶为外植体的组织培养比陆生植物更为困难。目前国外报道沉水植物狐尾藻和蓖齿眼子菜组培已经建立。以菹草茎作为外植体的组培快繁还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种菹草种苗快速繁殖的方法，有效解决菹草种苗的大量供需问题，材料易于获得、过程快捷、不受季节影响、成本低廉。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案1、采集自然水体中或温室中培养的生长健壮的菹草苗；2、用自来水冲洗1-2小时，去叶和根，取顶端的粗壮茎，用蒸馏水冲洗2-3遍，洗净菹草茎；3、灭菌和芽的诱导采用灭菌剂PPM(Plant preserve Mixture)、乙醇、次氯酸钠和双氧水等对茎外植体除菌。其除菌方式为用50％乙醇灭菌1分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗三遍，再用1.05％NaClO+吐温-20 1滴/100毫升灭菌10-20分钟，最后用无菌蒸馏水冲洗三遍；或5％H2O2灭菌15分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗三遍，再用4-10％PPM15-20分钟，最后用无菌蒸馏水冲洗三遍。灭过菌的茎用无菌蒸馏水浸泡4-6分钟，用解剖刀切取5-8毫米带节间的茎作为组培发芽外植体，接种到诱导生芽的培养基中培养，其成分为MS或1/5MS或1/10MS+15-30g/L蔗糖+0.8％琼脂+激素，具体如下(1)MS(Murashige和Skoog)成分大量元素KNO3为1900mg/L，NH4NO3为1650mg/L，MgSO4.7H2O为370mg/L，KH2PO4为170mg/L，CaCl2.2H2O为440mg/L；微量元素MnSO4.4H2O为22.3mg/L，ZnSO4.7H2O为8.6mg/L，H3BO3为6.2mg/L，KI为0.83mg/L，NaMoO4.2H2O为0.25mg/L，CuSO4.5H2O为0.025mg/L，CoCl2.6H2O为0.025mg/L；铁盐Na-EDTA为37.3mg/L，FeSO4.4H2O为27.8mg/L；维生素甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.1mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/L；(2)所含激素种类6-BA、2ip、IBA、NAA培养基中诱导腋芽萌动及不定芽分化的激素配比添加6-BA1.0-5.0mg·L-1+IBA0-0.5mg·L-1或NAA0-0.5mg·L-1；或添加2ip1.0-5.0mg·L-1+IBA0-0.5mg·L-1或NAA0-0.5mg·L-1；(3)培养基配比方式为MS+15-30g/L蔗糖+0.8％琼脂+激素或MS+0.8％琼脂+激素或MS/5+15-30g/L蔗糖+0.8％琼脂+激素或MS/5+0.8％琼脂+激素或MS/10+15-30g/L蔗糖+0.8％琼脂+激素或MS/10+0.8％琼脂+激素；培养基pH为5.8-6.0。
4、芽的增殖6或7或8天诱导出新芽，待芽长到1-2厘米，转接到诱导增殖的培养基中进行增殖，继代增殖的培养基为MS或1/5MS或1/10MS+15-30g/L蔗糖+0.8％琼脂+激素，激素配比为6-BA1.0-5.0mg·L-1或2ip1.0-5.0mg·L-1；5、根的诱导待长出芽时，转接到诱导生根的培养基中，诱导其生根，诱导生根的培养基为MS或1/5MS或1/10MS+15-30g/L蔗糖+0.8％琼脂+激素，激素配比为IBA或NAA0-3.0mg·L-1+6-BA或2ip0-0.5mg·L-1；6、待苗长出根时，打开封口膜，培养2-3天，转接到自然条件下培养。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果1，可以实现菹草大规模的繁殖，避免在水生植物的生态恢复工程中当需要大量种苗时通过从自然水体捞取，不仅对种苗来源地的水生植物资源造成破坏，同时也会经常遇到种苗资源的缺乏2，不受到季节的影响，从自然水体中捞取植物受季节的影响大，不同时间采集的种苗成活率也不同，通过工业生产可以控制种苗的生长期，便于在最佳时期进行种植3，材料来源简便，成本低廉
图1为菹草健壮幼苗，采集于温室或室外的自然水体中，作为外植体的来源图2为菹草茎节外植体在诱导生芽的组培培养基中诱导出的新芽，图3为菹草新芽在组培增殖培养基中增殖而萌发出的芽簇图4为菹草芽在诱导生根的组培培养基中诱导而生根图5为经过组织培养而获得的菹草完整幼苗具体实施方式
一种菹草种苗快速繁殖的方法，它包括下列步骤(A)在冬季或春季从自然水体中或温室里采集生长健壮的菹草苗；
(B)在实验室用自来水冲洗1-2小时，去除菹草表面的污染物，待菹草苗冲洗干净后，去除叶和根，切割靠顶端的粗壮茎，用蒸馏水冲洗2-3遍，彻底洗净菹草茎；(C)灭菌和芽的诱导在实验过程中需要使用的工具如平板、镊子和培养基等需经121℃ 0.1MPa高压蒸汽灭菌，在进行实验时实验工具要放置于生物安全柜或无菌操作台内灭菌30分钟，然后在无菌条件下采用灭菌剂除菌，灭菌剂分别为PPM-Plant preserve Mixture、乙醇、次氯酸钠和双氧水。其除菌方式为用50％乙醇灭菌1分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗三遍，再用1.05％NaClO+吐温-20 1滴/100毫升灭菌10-20分钟，最后用无菌蒸馏水冲洗三遍；或5％H2O2灭菌15分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗三遍，再用4-10％PPM15-20分钟，最后用无菌蒸馏水冲洗三遍。灭过菌的茎用无菌蒸馏水浸泡4-6分钟，用解剖刀切取5-8毫米带节间的茎作为组培发芽外植体，接种到诱导生芽的培养基中培养，其成份为MS或1/5MS或1/10MS+15-30g/L蔗糖+0.8％琼脂+激素，其具体比例如下培养基成分a、MS(Murashige和Skoog)成分大量元素KNO3为1900mg/L，NH4NO3为1650mg/L，MgSO4.7H2O为370mg/L，KH2PO4为170mg/L，CaCl2.2H2O为440mg/L微量元素MnSO4.4H2O为22.3mg/L，ZnSO4.7H2O为8.6mg/L，H3BO3为6.2mg/L，KI为0.83mg/L，NaMoO4.2H2O为0.25mg/L，CuSO4.5H2O为0.025mg/L，CoCl2.6H2O为0.025mg/L铁盐Na-EDTA为37.3mg/L，FeSO4.4H2O为27.8mg/L维生素甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.1mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/Lb、所含激素种类6-BA、2ip、IBA、NAA培养基中诱导腋芽萌动及不定芽分化的激素配比添加6-BA1.0-5.0mg·L-1+IBA0-0.5mg·L-1或NAA0-0.5mg·L-1；或添加2ip1.0-5.0mg·L-1+IBA0-0.5mg·L-1或NAA0-0.5mg·L-1c、培养基配比方式MS+15-30g/L蔗糖+0.8％琼脂+激素或MS+0.8％琼脂+激素或MS/5+15-30g/L蔗糖+0.8％琼脂+激素或MS/5+0.8％琼脂+激素或MS/10+15-30g/L蔗糖+0.8％琼脂+激素或MS/10+0.8％琼脂+激素培养基pH为5.8-6.0。
(D)芽的增殖把已接种的平板或培养瓶放置于光照培养箱或培养室中培养，培养温度为15-25℃，光照强度1000-5000Lux，光照时间为每天12-24小时光照。诱导其生芽，6或7或8天可萌发出新芽，待芽长到1-2厘米，转接到继代增殖培养基中，继代增殖培养基为MS或1/5MS或1/10MS+15-30g/L蔗糖+0.8％琼脂+激素，激素配比为6-BA1.0-5.0mg·L-1或2ip1.0-5.0mg·L-1；(E)根的诱导在9或10或11天待长出芽时，转接到诱导生根的培养基中诱导生根；诱导生根培养基MS或1/5MS或1/10MS+15-30g/L蔗糖+0.8％琼脂+激素，激素配比为IBA或NAA0-3.0mg·L-1+6-BA或2ip0-0.5mg·L-1；(F)待苗长出较多根时，打开封口膜，培养2-3天，然后移栽到室外在自然条件下培养。
权利要求
1.一种菹草种苗快速繁殖的方法，它包括下列步骤A、采集自然水体中或温室中培养的菹草苗；B、用自来水冲洗1-2小时，去叶和根，取靠顶端的茎，用蒸馏水冲洗2-3遍，洗净菹草茎；C、灭菌和芽的诱导灭菌剂为PPM、乙醇、次氯酸钠和双氧水对茎外植体除菌，然后用无菌蒸馏水冲洗2-4遍，浸泡4-6分钟，切取5-8毫米带节间的茎作为外植体，接种到诱导生芽的培养基中培养，诱导生芽的培养基为MS或1/5MS或1/10MS+15-30g/L蔗糖+0.8％琼脂+激素，激素配比为6-BA或2ip1.0-5.0mg·L-1+IBA0-0.5mg·L-1或NAA0-0.5mg·L-1；D、芽的增殖把已接种的平板式培养瓶放置于光照培养箱或培养室中培养，培养温度为15-25℃，光照强度1000-5000Lux，光照时间为每天12-24小时，6-8天诱导出芽，待芽长到1-2厘米，转接到继代增殖培养基中，继代增殖培养基为MS或1/5MS或1/10MS+15-30g/L蔗糖+0.8％琼脂+激素，激素配比为6-BA1.0-5.0mg·L-1或2ip1.0-5.0mg·L-1；E、待长出芽时，转接到诱导生根的培养基中，诱导其生根，诱导生根的培养基为MS或1/5MS或1/10MS+15-30g/L蔗糖+0.8％琼脂+激素，激素配比为IBA或IBA0-3.0mg·L-1+6-BA或2ip0-0.5mg·L-1；F、待苗长出根时，打开封口膜，培养2-3天，然后移栽到室外在自然条件下培养。
2.根据权利要求1所述的一种菹草种苗快速繁殖的方法，其特征是芽的诱导或芽的增殖或诱导生根的培养基的配比方式为MS+15-30g/L蔗糖+0.8％琼脂+激素或MS+0.8％琼脂+激素或MS/5+15-30g/L蔗糖+0.8％琼脂+激素或MS/5+0.8％琼脂+激素或MS/10+15-30g/L蔗糖+0.8％琼脂+激素或MS/10+0.8％琼脂+激素。
3.根据权利要求1所述的一种菹草种苗快速繁殖的方法，其特征是灭菌用50％乙醇灭菌1分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗三遍，再用1.05％NaClO+吐温-20 1滴/100毫升灭菌10-20分钟，最后用无菌蒸馏水冲洗三遍；或用5％H2O2灭菌15分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗三遍，再用4-10％PPM15-20分钟，最后用无菌蒸馏水冲洗三遍。
全文摘要
本发明公开了一种菹草种苗快速繁殖的方法，首先是从自然水体或温室中采集菹草植株；其次是对采集的植株进行预处理，去除植物表面吸附物质；第三去除植物叶和根，取靠顶端的部位，在无菌条件下对其灭菌。灭菌要彻底，同时要减少对植物组织的损伤。第四对灭菌处理过的茎段进行切割，然后转接到含激素的固体培养基上进行诱导生芽。第五待芽长到一定长度时转接到增殖培养基扩增培养。第六把扩增培养的苗转接到诱导生根的培养基中诱导生根。第七当苗长出较多根后，对幼苗驯化，然后种植到自然水体中。本技术解决了菹草种苗大量供需问题，材料易于获得、过程快捷、无季节影响、成本低廉。
文档编号A01G31/00GK1742563SQ200510019580
公开日2006年3月8日 申请日期2005年10月13日 优先权日2005年10月13日
发明者杨劭, 高健, 刘治华 申请人:华中师范大学