专利名称：短短小芽孢杆菌tw及防治水稻稻瘟病的活菌制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种短短小芽孢杆菌TW及用该菌种制备的防治水稻稻瘟病的活菌制剂。
背景技术：
水稻稻瘟病(Blast Fungus)，是全世界稻区危害最严重的水稻病害之一。该病一年四季均可对水稻造成危害，其危害遍及水稻的各个部位，有苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、枝梗瘟和谷粒瘟等。一般造成水稻减产10％～20％。该病在我国年发生面积均在380万hm2以上，年损失稻谷达数亿kg。目前，水稻抗瘟性品种的利用和化学农药的使用仍是防治稻瘟病行之有效的措施，但因抗瘟品种的单一化、稻瘟病菌生理小种遗传的复杂性和致病性的多样性，以及化学农药的毒性和病原菌的抗药性，水稻抗瘟性品种和化学农药使用在生产上都受到一定的限制。为此，水稻稻瘟病的生物防治特别是生物农药的研究与开发是水稻生产可持续发展的需要。微生物农药对环境的选择压力较小，且不易使靶标病原菌产生抗药性，因此，生物源农药的研究将会为人们提供更安全更高效的防治水稻稻瘟病的途径。
近年来，对农药的要求除了安全无毒外，还应对环境有较小的选择压力。生物农药最能体现上述防治的特点，它的作用靶标或对病原菌的作用一般都是多因子的，或称多效的，故不易使靶标菌产生抗药性。在保证水稻产量的前提下，生物农药的使用是不可缺少的。目前，对稻瘟病生物防治手段有(1)直接施用抗生素，如春雷霉素、春日霉素、灭瘟素-S、Blasticidin、庆丰霉素(其微生物来源春日链霉菌、Streptomyces kasugensis Umezawa、灰色产色链霉菌、GriseochromogenesFukunaga、庆丰链霉菌、放线菌)；(2)生防细菌和真菌制剂，如芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、Bacillus amyloliquef aciens RC-2、蜡状芽孢杆菌、假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa PR3(NRRL B-18602)和木霉属真菌。但到目前为止，尚没有用短短小芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)防治水稻稻瘟病的报道和相关专利申请。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，公开一种短短小芽孢杆菌TW，并提供一种包含短短小芽孢杆菌TW并对水稻稻瘟病有较好防治效果的防治水稻稻瘟病的活菌制剂。
本发明的微生物是一种在野生细菌中筛选获得的对水稻稻瘟病有强烈拮抗作用的短短小芽孢杆菌TW(拉丁文属名为Brevibacillus brevis)，该菌种已于2006年2月9日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NOM207014。
上述菌种具有如下特征1、形态特征细菌呈直杆状，具圆端或方端，菌落形态圆型，隆起，边缘光滑，黄白色至乳白色菌落；2、生理生化特征革兰氏阳性，好氧，周生鞭毛，能产芽孢，芽孢椭圆形或柱状；3、发酵液能产生多种抗菌肽；4、发酵液能拮抗水稻稻瘟病菌，水稻纹枯病菌，小麦纹枯病菌和油菜菌核病菌等多种植物病真菌。
本发明的防治水稻稻瘟病的活菌制剂的一种形式为固体制剂，其成份中包含短短小芽孢杆菌菌种1.0×1010cfu/g～2.0×1010cfu/g，还包含有的添加剂，添加剂的成份及重量比为防紫外辐射剂0.05％～0.10％，湿润剂0.5％～1.5％，保护剂1.0％～5.0％，防腐剂0.5％-1.5％，其余为固体填充物。
本发明的防治水稻稻瘟病的活菌制剂的另一种形式为液体制剂，其成份中包含短短小芽孢杆菌菌种1.0×1010cfu/ml～2.0×1010cfu/ml，还包含有添加剂，添加剂的成份及重量体积比为防腐剂0.5％～1.5％，防冻剂0.5％～1.5％，粘稠防渗剂5.0％～10.0％，湿润剂0.5％～1.5％，其余为缓冲液。
本发明其优点和积极效果如下1、室内拮抗活性测定结果表明，本发明短短小芽孢杆菌TW对稻瘟病菌菌丝生长有极强的抑菌活性，EC50值为6.1008mg/L(95％置信限为0.2801～20.3491mg/L)，而具有广谱性拮抗活性的对照药剂腊质芽孢杆菌的EC50值为92.6835mg/L(95％置信限为65.8516～129.7483mg/L)。两种药剂EC50值的95％置信限不重叠，说明药剂间差异显著；2、本发明的活菌制剂的大田示范防效果表明，该菌剂对稻瘟病防治效果达83％以上；3、由于本发明的活菌制剂是生物制剂，没有因化学农药的使用所带来的一系列环境和安全问题，因而保证水稻稻瘟病这种恶性病害的无公害防治，同时可以减少其他化学农药的用量，为农民节省开支。
具体实施例方式
本发明的短短小芽孢杆菌TW(Brevibacillus brevis)菌株由镇江市农业科学研究所独家保存。
本发明的防治水稻稻瘟病的活菌制剂可采用液体制剂和固体制剂，其制备过程的具体实施例如下
实施例一，液体制剂的制备包括以下步骤(1)一级种子培养液的培养挑取一个生长于R2A培养基上的短短小芽孢杆菌TW单菌落斑，于装有50mlR2A培养液(即R2A培养基中不加琼脂)的250ml三角瓶中，置30℃，200rpm摇床上振荡培养16h。
(2)二级种子培养液的培养将一级种子培养液按1∶50放大接种于R2A培养液中，置相同条件培养24h。
(3)上罐发酵将二级种子培养液按1∶200放大接种于发酵培养液(成份葡萄糖1.0％、黄豆饼粉2.50％、蛋白胨0.4％、NaCl 0.2％、(NH4)2SO40.6％、CaCO30.4％、MgSO40.4％)。发酵培养条件为pH7.2，溶氧为100％，搅拌转速为350rmp，30℃，24h出酵。
(4)离心收集菌体，用0.01M磷酸缓冲液重新悬浮菌体。
(5)液体制剂获得将上述重新悬浮液调成1.0×1010cfu/ml后，按一定比例加入添加剂，即0.1％(W/V)罗丹明B，1.0％(W/V)苯甲酸钠，0.5％丙二醇(W/V)，和5.0％(W/V)黄原胶，木质素磺酸钠0.5％～1.5％(W/V)，用0.01M磷酸缓冲液补足至100％，无菌瓶分装。
实施例二，固体制剂的制备步骤包括与实施例一相同的一级种子培养液的培养、二级种子培养液的培养、上罐发酵、离心收集菌体步骤，在离心后的悬浮液中加入保护剂蔗糖1.0％后冷冻干燥(或60℃干燥)成固体后气流粉碎得母菌粉。按比例加入添加剂，即0.1％(W/W)罗丹明B，1.0％(W/W)苯甲酸钠，和1.0％木质素磺酸钠(W/W)，用陶土调节菌浓度为1.0×1010cfu/g，无菌袋分装。
本发明活菌制剂的大田施用方式为800-1000倍稀释液，细喷雾。
本发明的实施效果如下一(一)室内实验结果如表1、表2所示。室内实验表明，短短小芽孢杆菌TW对稻瘟病菌菌丝生长有极强的抑菌活性，EC50值为6.1008mg/L(表2)，95％置信限为0.2801～20.3491mg/L，而具有广谱性拮抗活性的对照药剂腊质芽孢杆菌的EC50值为92.6835mg/L，95％置信限为65.8516～129.7483mg/L。两种药剂EC50值的95％置信限不重叠，说明药剂间差异显著。
表1 短短小芽孢杆菌TW对稻瘟病菌菌丝生长抑菌率测定(原始记录数据)
表2 短短小芽孢杆菌TW对稻瘟病菌室内抑菌活性测定的统计结果
(二)大田防治示范试验结果如表3所示。试验结果表明，该菌制剂固体制剂对稻穗颈瘟的防效，在两种水稻品种上的防效均在80％以上；液体制剂在两种水稻品种上防效均在90％以上。液体制剂与化学药剂(三环唑)间的防效差异不显著。
表3 2006年水稻穗颈瘟句容后白农场示范防治结果
注防治时间为水稻破口期，防治一次。TW指短短小芽孢杆菌TW
权利要求
1.一种短短小芽孢杆菌TW(拉丁文属名为Brevibacillus brevis)，保藏号为CCTCC NOM207014.
2.一种防治水稻稻瘟病的活菌制剂，其特征是它为固体制剂，其成份中包含短短小芽孢杆菌菌种1.0×1010cfu/g～2.0×1010cfu/g，还包含有的添加剂，添加剂的成份及重量比为防紫外辐射剂0.05％～0.10％，湿润剂0.5％～1.5％，保护剂1.0％～5.0％，防腐剂0.5％-1.5％，其余为固体填充物。
3.根据权利要求2所述的防治水稻稻瘟病的活菌制剂，其特征是是所述防紫外辐射剂RDB为罗丹明B，所述湿润剂为木质素磺酸钠，所述防腐剂为苯钾酸钠，所述保护剂为蔗糖。
4.一种防治水稻稻瘟病的活菌制剂，其特征是是它为液体制剂，其成份中包含短短小芽孢杆菌菌种1.0×1010cfu/ml～2.0×1010cfu/ml，还包含有添加剂，添加剂的成份及重量体积比为防腐剂0.5％～1.5％，防冻剂0.5％～1.5％，粘稠防渗剂5.0％～10.0％，湿润剂0.5％～1.5％，其余为缓冲液。
5.根据权利要求4所述的防治水稻稻瘟病的活菌制剂，其特征是是所述防腐剂为苯钾酸钠，所述防冻剂为丙二醇，所述粘稠防渗剂为黄原胶，所述湿润剂为木质素磺酸钠。
全文摘要
本发明涉及一种短短小芽孢杆菌TW及用该菌种制备的防治水稻稻瘟病的活菌制剂。其短短小芽孢杆菌TW的保藏号为CCTCC NOM207014。本发明活菌制剂的固体制剂的成份中包含短短小芽孢杆菌菌种1.0×10
文档编号A01N63/02GK101063094SQ200710021509
公开日2007年10月31日 申请日期2007年4月19日 优先权日2007年4月19日
发明者杨敬辉, 朱桂梅, 潘以楼 申请人:江苏丘陵地区镇江农业科学研究所