专利名称：核型多角体病毒p13基因在杀棉铃虫中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于分子病毒基因工程领域，具体地说，本发明涉及一种核型多角体病毒HaSNPV p13基因在杀棉铃虫幼虫的新用途。
背景技术：
生物农药具有安全、无毒副作用、不污染环境等优点。大力发展生物农药已成为必然的趋势。生物农药是绿色食品生产的重要保证。未来生物农药发展潜力巨大。核型多角体病毒NPV作为生物杀虫剂的突出优点是对人体安全，不杀伤天敌，不污染环境；但其过高的宿主特异性及缓慢的发病致死过程也影响了病毒杀虫剂的商品化进程。目前，国内外科学家正致力于研究杀虫效果提高的重组杆状病毒。基因工程病毒杀虫剂的研制，不仅可以克服NPV的固有缺点，而且还为扩大病毒杀虫谱提供了可能。当前，利用杆状表达载体系统构建的重组病毒在杀虫效果上有了很大改善，如通过同时表达两种蝎毒LqhIT2和LqhIT，使AcMNPV的杀虫时间缩短了35％，显示了良好的应用前景(InceogluA等，2001)。另外，通过缺失昆虫杆状病毒egt基因和在杆状病毒基因组中整合各种增效蛋白基因如苏云金毒素(Martens等，1990)、蝎子毒素(McCutchen等，1991)、植物蛋白酶抑制剂(季平等，1996)和病毒增效蛋白基因enhancin(付月君等，2003；张建军等，2004)等外源基因，以提高杀虫效果的研究也取得了相当大的进展，这为杆状病毒的进一步推广应用奠定了坚实的基础。但是要对病毒进行基因工程改造，就必须对病毒的基因组尤其是特定基因有深入的了解。目前已报道的杆状病毒有600多种，但已知全基因组序列的不到20种，在这些已知种中，仍存在大量未知功能基因有待研究。因此对杆状病毒基因组及后基因组的研究仍是一项艰巨而漫长的道路。
申请人实验室1995年首次发现了只在II类NPV和颗粒体病毒GV中具有的p13基因(Wang等，1995)，在近年测序的22种II类NPV和GV基因组中Ls-p13基因的同源体已相继被报道(Luque等，2001；IJkel等，1999；Li等，2002)。软件分析显示，P13蛋白具有许多真核蛋白具有的重要调控结构亮氨酸拉链，高度磷酸化结构和所预测的第8类糖基转移酶功能。这些关键的结构及预测的功能赋予p13独特的生物学意义。棉铃虫核型多角体病毒全基因组测序已于2001年完成(Chen et al，2001)，结果发现HaSNPV基因组中的ORF97与LsNPV的p13基因同源，它也具有两个保守的类亮氨酸拉链结构。
RNAi(RNA interference)，即RNA干扰，是近两年来产生的一项新兴生物技术。RNAi广泛的定义为RNA引起的同源依赖性基因沉默现象(homology-dependent gene silencing，HDGS)，狭义的定义为外源dsRNA介导的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。RNAi广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物各种生物中。RNAi技术已经在抑制病毒复制、传播，功能基因组的高通量分析，肿瘤的治疗，以及各种基因表达异常增高引起的疾病等多个研究领域取得了瞩目的成果。RNAi的机制是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，可形成一22bp大小的小干扰RNA(smallinterfering RNAs，siRNAs)，siRNA，与Dicer形成复合物即RNA诱导基因表达沉默复合物(RISC)，继而RISC激活。该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起PuNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达(Bernstein E，et al，2001)。RNA介导的基因沉默为抑制病毒复制提供了一个潜在的有力工具，通过设计合成针对病毒复制所必需的基因的dsRNA或siRNA，使靶基因发生基因沉默，理论上可以有效的抑制病毒的复制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种核型多角体病毒(HaSNPV)p13基因在杀棉铃虫幼虫中的应用。该p13基因主要是可用来作为生物农药，安全无毒，环保，效率高，见效快。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施，其具体步骤是1、dsRNA-p13的合成；从HaSNPV病毒(《中国病毒学》1998年第01期，孙修炼等，中国科学院武汉病毒研究所)中提取HaSNPV病毒基因组DNA，利用引物P1和P2，(P1CGGAATTCATGTCTCTTTCCATTAGC，P2AAGCTTGTACGTGACACTGGTCATGC)，PCR扩增得到全长p13基因(GenBankAB000383)，831个碱基，编码30KD的蛋白。以Ha-p13基因开放阅读框(ORF)46-718位的核苷酸序列为靶序列，分别设计带有正向和反向T7启动子序列两条特异性引物P3和P4，P3TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACGAAGGCGCATTGGTATTAGCT，P4TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACTGATCACACTGGGTTCGAGA，用T7聚合酶体外合成dsRNA-p13。dsRNA-p13可以在体内抑制正常p13基因的表达。HaSNPV病毒基因是HaSNPV的全基因组，本身这是个基因组DNA，没什么功能，主要研究其中的p13基因。
2、HaSNPV P13杀虫活性的生物测定；a)细胞水平检测干扰效果，在HaSNPV-G病毒感染Hz-AM1细胞前，先用5ugdsRNA-p13转染Hz-AM1细胞。将HaSNPV-G病毒感染后48h的细胞收集，用Ha-P13蛋白的多克隆抗体免疫杂交检测dsRNA-p13在天然系统中对病毒表达的Ha-P13蛋白的抑制作用。
b)检测p13基因的杀虫活性，选择1ug dsRNA-p13和5ug dsRNA-p13不同量的dsRNA-Hap13与HaSNPV-G病毒共注射棉铃虫三龄幼虫的血淋巴，同时以相同剂量HaSNPV-G病毒单独注射同一批次的棉铃虫三龄幼虫作为对照，以此检测dsRNA-Hap13对HaSNPV-G杀虫效果的影响。对照组为单独dsRNA-Hap13单独注射，检测dsRNA的毒性，以上各组实验中注射HaSNPV-G病毒(1×106)均是10ul，死亡的幼虫可用绿色荧光观察。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果1、可以增加杆状病毒杀虫剂的杀虫谱；一般的杆状病毒杀虫剂的病毒对宿主具有高度的专一性，而p13基因不仅对本身同源系统有作用，对异源系统的幼虫也有作用。
2、提早杆状病毒杀虫剂的作用时间。一般的杆状病毒杀虫剂，由于病毒进入虫体的潜伏期长，田间致死时间一般需7～14d，而p13基因在病毒感染第3天就能起到明显的作用。
图1HaSNPV p13蛋白的原核表达载体的构建；首先从HaSNPV Bacmid中PCR扩增得到全长p13基因，并用EcoRI和HindIII双酶切，回收目的片断。同时pMAL-p2X载体质粒也用EcoRI和HindIII双酶切，并回收载体片断。然后用T4连接酶连接载体片断和目的片断(1∶2)，转化TB1宿主菌，筛选得到阳性克窿pMAL-p2X-hap13。
图2Ha-p13克隆到pMal-p2表达载体后的酶切，1为pMal-Ha p13表达表达质粒的HindIII单酶切鉴定，单酶切后带的大小为7.5kbp左右。2为EcoRI与HindIII双酶切鉴定，双酶切后看到两条带分别为6.7kbp和800bp。证明连接正确。
图3Ha-P13麦芽糖融合蛋白的表达纯化，1和2都是纯化的融合蛋白。融合蛋白质的分子量是70KD(Ha-P13蛋白的分子量是30KD，而麦芽糖融合标签的分子量为40KD)。
图4Western blot检测dsRNA-Hap13对rHaSNPV-G感染细胞后Ha-P13表达的影响，1为Hz-AM1空细胞对照；2为rHaSNPV-G感染后48h Ha-P13的表达(在rHaSNPV-G感染前16h已转染dsRNA-Hap13)；3为rHaSNPV-G单独感染48h后的Ha-P13的表达；图5dsRNA-Hap13检测Ha-P13的杀虫活性；分别用不同量的dsRNA-Hap13和同样量的HaSNPV-G病毒共注射感染100只棉铃虫幼虫，三天后，对死亡幼虫计数，并计算死亡率。随着dsRNA-Hap13量的增加，HaSNPV-G病毒造成的幼虫的死亡率降低。
图6HaSNPV-G病毒感染致死的棉铃虫；感染HaSNPV-G病毒死亡的幼虫为绿色。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当说明的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求的保护范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，昆虫病毒与昆虫病毒病等书中所述的条件，或按照制造厂商的操作指南所建议的方法。
实施例1HaSNPV p13基因的克隆提取HaSNPV的Bacmid，用引物P1，P2(上海生工生物公司合成)PCR扩增得到全长p13基因，(P1CGGAATTCATGTCTCTTTCCATTAGC，P2AAGCTTGTACGTGACACTGGTCATGC)。经EcoRI与HindIII(购自晶美公司)双酶切，采用3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒回收(购自上海申能博采生物公司)。用T4连接酶(华美生物技术公司)。载体质粒pMal-p2X(购自NEWENGLAND LAB公司)用EcoRI与HindIII双酶切，试剂盒回收。用T4连接酶(华美生物技术公司)，16℃连接8小时，转化大肠杆菌TB1(购自NEWENGLAND LAB公司)，挑取单菌落，在试管中振荡培养，提取质粒，质粒经EcoRI与HindIII双酶切鉴定、PCR鉴定，测序(联合基因公司完成)。经测序和p13基因一致的菌株即为阳性菌株，也就要克隆的pMal-p2X-Hap13菌。
实施例2dsRNA-p13的合成按照ScriptMAXTMThermo T7 Transcription Kit试剂盒(购自Toyobo公司)提供的方法，体外合成双链RNA。过程简单如下以Ha-p13基因开放阅读框(ORF)46-718位的核苷酸序列为靶序列，分别设计带有正向和反向T7启动子序列两条特异性引物(P3，P4)。以引物P3，P4从实施例1得到的质粒pMal-p2X-Hap13中扩增约730bp的PCR产物。纯化后的PCR产物通过T7聚合酶体外合成dsRNA。
P3TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACGAAGGCGCATTGGTATTAGCTP4TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACTGATCACACTGGGTTCGAGA(下划线区为T7启动子的识别序列)具体操作如下1.从实施例1得到的pMal-p2X-Hap13菌中提取质粒。
2.以引物P3，P4中从步骤1的到的质粒为模版，扩增约730bp的PCR产物。
3.按ScriptMAXTMThermo T7 Transcription Kit试剂盒提供的操作说明书中的说明书要求的体积加入[10×反应缓冲液2μl，5×加速缓冲液4μl，25mMrNTPs混合物4.5μl，RNase抑制剂0.5μl，模板DNA(步骤2中的PCR产物)100ng-1μg，T7RNA聚合酶1μl，加无核酶的水至20μl]。
4.在37-42℃下保温2小时，便得到上清液。
5.乙醇沉淀法纯化dsRNA。在转录反应液中加入无核酶的水至100μl，再加入100μl的TE饱和苯酚(pH 8.0)，室温(20℃-25℃，以下相同)混合5分钟。4℃，12,000rpm离心5分钟。小心地将上清液转移到另一个微量离心管，不要吸到中间的变性蛋白质层。在上清液中添加100μl的氯仿，混合均匀。4℃，12,000rpm离心5分钟。
6.小心地将步骤4离心后的得到的上清液转移到另一个微量离心管，加入250μl无核酶的水和55μl 7.5M醋酸铵。加入875μl的酒精，充分混匀。在室温下静置2-3分钟。4℃，12,000rpm离心5分钟。
7.倒去上清液，离心管中加入70-80％的乙醇(室温)1ml，轻轻倒转2-3次。4℃，12,000rpm离心5分钟，沉淀RNA，用移液器完全吸掉乙醇溶液。加入30μl的无核酶的水，用移液器上下吹吸溶解沉淀，即得到dsRNA-p13。
实施例3Ha-P13蛋白的表达纯化1.将实施例1中得到的pMal-p2X-Hap13菌接种于含5ml含氨苄青霉素(100μg/ml，凌飞生物公司)LB培养基的试管中，37℃培养过夜以获得饱和培养物。
2.接种步骤1得到的饱和培养物2ml至含有200ml含氨苄青霉素(100μg/ml)LB培养基的三角瓶，37℃，250rpm培养。2小时后，测定菌液OD值(日本SHIMADZU公司生产的UVPC2401PC分光光度仪)，OD达到0.6时，加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，凌飞生物公司)至终浓度为1mmol/L，对培养物进行诱导。
3.诱导8小时后，停止培养，将培养物5000rpm离心，弃上清，沉淀溶于10ml上柱缓冲液(20mMTris-Cl(pH7.4)，0.2MNaCl，1mMEDTA)，置于-80℃低温冰箱冷冻，2小时后取出融化，反复冻融三次。
4.冻融三次后，进行超声波破碎处理(宁波新芝生物技术公司，JY92-2D超声波细胞粉碎机)，400w，超声时间2秒，间隔时间3秒，共超声4分钟。处理后，10000g离心30分钟，取上清，备过柱纯化，得到提取物。
5.Ha-P13蛋白的纯化。将步骤4得到的蛋白提取物，4℃条件下，上样流经2ml多糖树脂柱(Amylose Resin，购自NEWENGLAND BIOLab公司)，用10倍柱体积的洗涤液缓冲液洗涤柱子(与上柱缓冲液相同)。最后用洗脱液(上柱缓冲液中加入10mM麦芽糖)洗脱目的蛋白并收集到Eppendorf离心管中。
6.纯化蛋白的鉴定将步骤5得到的蛋白，每Eppendorf离心管取20ul装于另外的离心管中，并加入20ul2×SDS凝胶加样缓冲液(50m mol/LTris·Cl(pH 6.8)；100m mol/L二硫苏糖醇(DTT)；2％SDS(电泳级)；0.1％溴酚蓝；10％甘油)，混合后，100℃加热3-5分钟。
7.聚丙烯酰胺凝胶电泳制备12％聚丙烯酰胺凝胶，将步骤6制备的样品加入上样孔中，首先60V电泳，在样品进入下层胶时，改为100V电压，直到样品达到凝胶底部，停止电泳，取下胶，并染色处理(45％甲醇，45％去离子水，10％冰醋酸，0.25％考马斯亮蓝固体)，染色8小时后，弃染色液，加脱色液(45％甲醇，45％去离子水，10％冰醋酸)，观察结果。与蛋白质分子量标准比较，在70KD附近的带就是要表达的Ha-P13融合蛋白。
实施例4Ha-P13蛋白的多克隆抗体的制备选择雄性家兔，体重约2.5Kg。背部多点皮内注射，每点注射0.1ml实施例3中纯化得到的蛋白加完全弗氏佐剂(购自SIGMA公司)的混合液。隔周加强再用同样的方法注射一次。共进行4次加强免疫，即四周后放血制备抗血清将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。放血过程中要严格按无菌要求进行。收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜(切勿冰冻)析出血清，离心，4000rpm，10min。在无菌条件，吸出血清即为制备的抗体，Ependorf离心管分装，每管500ul，贮于-40℃以下冰箱。
实施例5dsRNA-p13和病毒HaSNPV-G共感染HzAM1细胞在HaSNPV-G病毒感染Hz-AM1细胞前，先用5μg dsRNA-Hap13转染Hz-AM1细胞。转染具体过程如下转染前一天在6孔细胞培养板中接种细胞，当细胞丰度到80％，进行转染。将5ug(4-5ul)dsRNA-Hap13用250ul无血清、无抗生素的Grace细胞培养基(购自GIBCO公司)稀释，室温静置15分钟。将10ulLipofectin2000(购自Invitrogen公司)同样用250ul无血清、无抗生素的Grace细胞培养基稀释，室温静置5分钟，再与上述步骤稀释的dsRNA-Hap13溶液混合，室温静置20分钟，用无血清、无抗生素的Grace细胞培养基轻轻洗涤细胞两次，将得到的dsRNA/Lipofectin2000复合物全部加入细胞，轻轻摇动培养板使其混匀，置于28℃温育4-6小时。6小时后加入2ml含有10％胎牛血清(购自GIBCO公司)的Grace培养基，置于28℃培养箱培养，48小时后对细胞进行产物的分析。可以观察到，加入dsRNA-p13后，病毒HaSNPV-G共感染细胞后的p13蛋白表达量明显降低。说明dsRNA-p13是能抑制p13基因的表达。
实施例6Westerblot检测P13的表达1.收集感染48h后的的细胞，1000g，离心10min，弃上清，沉淀溶于40μl PBS缓冲液(0.2g KCl，0.2g KH2PO4，8.0g NaCl，1.56g Na2HPO4.7H20，溶解在1L双蒸水中)对细胞进行处理，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，每个上样孔加入约20μl样品，100V电泳。
2.转移法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，50V电泳3小时；取下硝酸纤维素膜，蛋白质面朝上，以50mL封闭缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0，150mMNaCl，5％脱脂奶粉，0.05％Tween-20)覆盖硝酸纤维素膜，封闭至少20分钟；3.取实施例4中制备的多克隆抗体稀释在2mL(1∶500)封闭缓冲液中，与硝酸纤维素膜一起封于杂交袋中室温杂交1小时；洗涤缓冲液TBST(10mMTris-HCl pH8.0，150mM NaCl，0.05％Tween-20)洗涤2次，每次10分钟；4.再取2μL碱性磷酸酶偶联的二级抗体IgG(购自武汉凌飞生物公司)稀释在5mL封闭缓冲液中，与硝酸纤维素膜一起封于杂交袋中室温杂交40分钟；洗涤缓冲液TBST洗涤3次，每次5分钟；TBS(10mM Tris-HCl pH8.0，150mMNaCl)洗涤2次，每次5分钟。
5.10ml碱性磷酸酶缓冲液(1MTris-HCl，100mMNaCl，5mMMgCl2)加入底物33ulNBT/66ulBCIP(购自长沙欧迈公司)显色，显色后迅速弃去显色液，加入10ml去离子水中止显色。
实施例7dsRNA-p13干扰p13杀虫活性的生物测定选取健康的三龄棉铃虫幼虫，幼虫由申请人实验室的试验员提供。在养虫盘中培养，每个小格内一只幼虫，每个盘子100只。用保鲜膜封好，在每个小格上留3-4个小孔，供通气。并列进行四组实验
第一组，将10ul(1ug dsRNA-Hap13)和10ulHaSNPV-G病毒液(1×106)在1.5mleppendorf离心管中混匀，再用20ul微量注射器将上述混合液注射到幼虫的位于倒数第二对尾足的血淋巴内，共注射100只幼虫。第一、第二天继续添加食物，第三后停止添加食物并进行死亡幼虫的计数，直到第五天，共计数三天。
第二组，50ul(5ug dsRNA-Hap13)和10ulHaSNPV-G病毒液(1×106)在离心管中混匀，采用与第一组实验同样的方法注射100只幼虫，三天后对死亡的幼虫计数。
第三组，10ulHaSNPV-G病毒液(1×106)单独注射，用同样的方法注射100只幼虫，三天后对死亡的幼虫计数。
第四组，50ul(5ug dsRNA-Hap13)单独注射100只幼虫，三天后对死亡的幼虫计数。
下表是四组试验的结果。
以上四组实验的结果为，5μg的dsRNA-Hap13和HaSNPV-G病毒共注射幼虫后，相比只注射HaSNPV-G病毒，虫体的死亡率虫由70％降到了10％。在单独注射5μg of dsRNA-Hap13的对照组中只有极少的虫子死亡，因此dsRNA-Hap13本身对宿主没有毒性。而Hap13基因被dsRNA干扰后，HaSNPV-G病毒的杀虫活性明显降低，Hap13在天然系统中是一个杀虫相关基因，有作为杀棉铃虫幼虫的生物农药的巨大潜力。
权利要求
1.一种核型多角体病毒p13基因在杀棉铃虫幼虫中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种核型多角体病毒p13基因在杀棉铃虫中的用途，本发明公开了HaNPV p13基因能提高HaNPV病毒对同源宿主棉铃虫的致死率。Ha－p13在天然系统是一个杀虫相关基因。dsRNA－Hap13与HaSNPV－G病毒一起注射棉铃虫幼虫，HaSNPV对棉铃虫幼虫的致死率明显降低，达到60％，安全无毒，环保、效率高、见效快。
文档编号A01P7/04GK101057592SQ20071005184
公开日2007年10月24日 申请日期2007年4月12日 优先权日2007年4月12日
发明者齐义鹏, 吕颂雅, 肖化忠, 杜恩岐, 闫锋, 金唯信 申请人:武汉大学