专利名称：一种枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌及其菌剂的应用，属于一种广谱生防、促 生菌剂。
背景技术：
半个多世纪以来，化学农药防治病虫害对农业生产起了十分重要的作用。 但是，随着化学农药的长期和大量使用带来的农药残留、环境污染、病虫的 抗药性等问题的出现，化学农药的安全性引起了社会的普遍关注，生物防治 越来越受到人们的重视。生物防治具有对人畜安全，无毒害，不污染环境等 优点，逐渐成为植物病虫害防治的重要措施之一。在植物病虫害生物防治中，
尤以苏云金芽孢杆菌(Bt)防治鳞翅目害虫最为成功。目前，开发利用生物 杀菌剂防治农作物病害已成为生防领域的研究热点。在该领域，具有防病效 果的微生物包括芽孢杆菌、木霉、放线菌等，其中以枯草芽孢杆菌的研究 开发最为活跃，在微生物杀菌剂市场中备受瞩目。枯草芽孢杆菌是一种在自 然界广泛存在的微生物，革兰氏阳性，产生耐热、抗逆的芽孢，在芽孢形成 初期分泌各种抗菌物质，对病原真菌有特异性的防治作用，具有显著的生防 潜力。枯草芽孢杆菌具生长快、营养简单，有利于生防菌剂的生产、剂型加 工及在环境中的存活、定殖与繁殖，而且批量生产工艺简单，成本也较低， 施用方便，储存期长，是一种理想的生防微生物。目前已明确的枯草芽孢杆 菌作为生物杀菌剂的抑菌机制有以下几个方面 一是营养和空间位点的竞争; 二是分泌抗菌物质。目前已确定来自枯草芽孢杆菌的抗菌物质有低分子抗菌 肽，有环状肽或环状脂肽，也有些为线状肽等，这些物质能使病原真菌菌丝 发生断裂、解体、细胞质消解等现象；三是促进植物生长，增强植物的诱导 抗病性。尽管很多枯草芽孢杆菌生防制剂已被证实具有防治作用，但仅有少 数几种应用于生产，大部分仍处于研究和探索阶段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌菌株以及该菌株的干粉菌剂在 农业病害防治、水果保鲜等领域中的应用。 本发明的目的是通过以下方式实现的
本发明人从田间玉米病叶片上分离到一株对玉米小斑病菌C小种有拮抗 作用的细菌菌株，经鉴定属于典型的枯草芽孢杆菌(J5 "7/m s"^/fc)，但与
其它枯草芽孢杆菌相比其具有广谱抗病原真菌活性，同时其干粉菌剂对鲜桃、 葡萄等水果保鲜效果较好，用于黄瓜、番茄、等大棚蔬菜的生产不仅有抗病 效果，而且又有促生作用。为了证明该菌株的广谱抗病原真菌活性，发明人
做了以下工作
一、枯草芽孢杆菌CGMCCNo.l982菌株的鉴定、诱变及拮抗机理
1、 菌株的形态
显微镜下观察发现，该菌株菌体杆状，产生芽孢，革兰氏反应为阳性。 在TSA培养基上菌落呈浅黄色，近圆形，表面干燥、有褶皱，不透明。
2、 菌株的生理生化特征
生理生化实验鉴定表明，该菌株为好氧菌，接触酶阳性，V-P实验阳性， 能产生淀粉酶，对盐有一定的耐受性；不能利用丙二酸盐；不产生卵磷脂酶。
3、 菌株16SrDNA序列的测定
利用PCR技术扩增该菌株的16S rDNA序列，获1514 bp全长片段。将 测序结果与GeneBank中已知的16S rDNA进行同源性比较，发现与fi"d〃附 s"M//5 (登录号AY887082)的同源性最高，为99%。
根据菌体革兰氏染色、菌落形态特征的观察、生理生化测试及16SrDNA
序列分析结果，该菌株和枯草芽孢杆菌相吻合，因此将其鉴定为枯草芽孢杆 菌(5fl"7/ws )。
4、 菌株的复合诱变及抗菌活性提高
采用紫外线和氯化锂对菌株进行复合诱变处理，获得了遗传性状稳定的 诱变菌株，其对致病真菌玉米小斑病菌的拮抗活性比出发菌株提高了66.2%。
5、 菌株拮抗物质的理化特性分析
将菌株接种于LB液体培养基，3(TC振荡培养48h，用高速离心机12， 000 r/min离心5 min去菌体，上清液加入30 %饱和度的硫酸铵，4 'C静置过
夜后，12， 000 r/min离心25 min，取上清液，加入硫酸铵使达到60 %饱和度， 4 T:静置过夜后，12， 000 r/min离心25 min，得到具拮抗活性的蛋白性质粗提 物。
对拮抗物的理化特性分析表明，菌株产生的拮抗物质能耐高温(100'C， lOmiii)，抑菌活性pH值范围为5.0 9.0，对紫外线、胰蛋白酶部分敏感， 对蛋白酶K、氯仿敏感，说明该拮抗蛋白稳定性较好。
6、菌株拮抗物质的拮抗机理
以玉米小斑病菌(说>>/ /^ m^^W作为指示菌，对菌株产生的拮抗物质的 作用机制进行了初步研究，结果表明拮抗物质可使玉米小斑病菌孢子不萌 发或萌发异常；菌丝畸形，顶端及中部膨大、扭曲，细胞质分布不均匀。 二、枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No.1982干粉菌剂的制备
1、 液体发酵培养
(1) 菌种活化采用的培养基含胰蛋白胨，大豆蛋白胨，NaCI ，水。 将保存的甘油菌种接到活化培养基固体斜面后，34'C培养48h。
(2) 种子培养采用的培养基含酵母膏，葡萄糖，CaC03，水。 将活化的斜面菌种用无菌水冲洗，制成菌悬液，按下列条件接到种子培
养基中培养，培养温度35'C，摇瓶装量12%,接种量3%，初始pH值7.2。
(3) 菌株补料分批发酵工艺 发酵培养基含葡萄糖，酵母膏，CaC03。 流加培养基含葡萄糖，酵母膏，制成混合液一起流加； 流加时间发酵8h后开始；发酵时间34±2 h; 发酵液芽孢浓度(3.41±0.151) xl09cfu/mL。
2、 菌体的制备
发酵得到的发酵液12000 r/min离心20min，弃上清，菌体加入无菌水悬 浮混匀，再12000 r/min离心15 min，弃上清得菌体。
3、 干粉菌剂的制备
菌体称重后，称等重量的无水CaC03， CaC03缓慢加入湿菌体中，边加 边搅拌，直至均匀。于真空干燥箱中5(TC烘干30min至粉末状。干粉菌剂 中活芽孢数为2.109士(U66)xl011 cfu/g。
三、枯草芽孢杆菌CGMCC No.l982干粉菌剂在农业病害防治、水果保 鲜等领域的应用
本发明用于农业病害防治、水果保鲜的枯草芽孢杆菌< "7//附s"Z^7W 菌株CGMCC No.l982干粉菌剂的组成为湿菌体与无水碳酸钙的质量比为 1: 1,菌剂中的活芽孢数含量为200 500亿/克。
上述干粉菌剂还可以制备成干粉水溶液(菌悬液)，制备方法是称取0.1 g 干粉菌剂溶于100mL水中，或干粉菌剂与水的质量体积比为l: 1000，搅拌 均匀得菌悬液，菌悬液活芽孢数为1.0xi()Scfu/mL。 (1.0 xl08cfu/mL)o
本发明取得的积极效果是本发明的菌株CGMCC No. 1982可用于防治 由小麦赤霉病菌、水稻稻瘟病菌、玉米小斑病菌、黄瓜炭疽病菌、大蒜菌核 病菌、辣椒炭疽病菌桃等引起的农作物、蔬菜等病害；还可应用于桃、苹果、 葡萄、梨等水果保鲜领域。经干粉水溶液处理后的水稻、玉米叶片，均不能 出现相应的病斑；用粉剂拌种、粉剂根埋或菌悬液喷洒方式处理的黄瓜种子 或幼苗叶片，不仅可防止黄瓜炭疽病的发生，而且表现出良好的促生作用， 有利于绿色、无公害蔬菜的生产。经菌悬液处理后的鲜桃，烂果率明显降低， 贮存期延长。本发明的干粉菌剂在农业病害防治、水果保鲜等领域展现出较 好的应用前景。本发明的枯草芽孢杆菌粉剂中芽孢含量明显高于市场上现有 的产品，而且其制备工艺简单，适合工业化生产。
该菌株于2007年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心(CGMCC)，菌种保藏编号为CGMCCNo. 1982。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明。 实施例1枯草芽孢杆菌CGMCC No. 1982对农业生产主要病原菌的拮抗作 用
(1)拮抗菌的培养把菌株CGMCC No. 1982试管菌种从4 "C冰箱中 取出，放置2h后，在LB平板上划线接种，并于3(TC培养2d。
(2)病原真菌的培养供试病原真菌的保存种接于PDA平板上，28 °C 培养使其长满平皿。供试病原真菌包括玉米小斑病菌OB,j^/"〃's附"j;^s)、水
稻稻瘟病菌(Af"g"fl/ w幼e gr/sefl)、小麦赤霉病菌CFMS"n'M附gm附,Vie"rwwi)、 棉花枯萎病菌(jp"s"f/m附，s/w"附f.sp.Kw/"/e"w附)、辣椒炭疽病菌
(CW/"幽'c/w附cfl拜'".)、辣椒疫霉病菌考s/c/)、黄瓜炭疽病 菌/fltge"a""附)、大蒜菌核病菌(5^/"< //'"/" 棉花黄萎病 菌(P^W/"7//m/w d/i緒fle)、 烟草赤星病菌(J/te/TiwVi "/te/7i她)、杉t灰霉
(jfiTw附/co/fl 7>做柳)等。
(3) 拮抗谱的测定待病原真菌菌丝长满PDA平皿时，用灭菌的打孔器 (①-6 mm)在平板上打孔，然后用接种针把菌丝块放入冷却的PDA平板中央， 同时在距菌落边缘lcm处用接种环点接菌株A，然后观察生长情况，记录拮 抗菌落半径(R0，抑菌带宽度(R2)，以R2/Ri表示抑菌活性强弱。
(4) 结果采用平板对峙法测定了菌株CGMCC No. 1982对农业生产 主要致病真菌的拮抗作用，结果表明，该菌株对上述病原真菌均有拮抗作用， 说明该菌株具有广谱抗病原真菌特性。其中以对黄瓜炭疽病菌、大蒜菌核病 菌、小麦赤霉病菌、烟草赤星病菌、水稻稻瘟病菌、玉米小斑病菌、黄瓜炭 疽病菌拮抗活性较强，展现出其在农业生产病害生物防治方面具很好的应用 前景。
实施例2枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No. 1982的菌悬液对稻瘟病的防效
(1) 菌种活化TSA培养基胰蛋白胨15g,大豆蛋白胨5g, NaC15g， 水1000 mL;
将保存的甘油菌种CGMCC No. 1982接种到TSA固体斜面培养基后， 34。C培养48 h;
(2) 种子培养将活化的斜面菌种用无菌水冲洗后，接种到装有40mL TSA液体培养基的三角瓶中，接种量1%。 160r/min， 34X:振荡培养20h;
(3) 发酵培养
发酵培养基葡萄糖1%，酵母膏1%， CaC03l%, pH7.5; 流加培养基葡萄糖1.5%，酵母膏0.5%，葡萄糖和酵母膏制成混合液 800mL;
将种子液以3%的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养，采用20L 搅拌式发酵罐进行补料分批发酵，装量为12 L，发酵过程中通过流加Na2C03
调节pH值，选用食用豆油作为消泡剂，从8.5h后开始流加葡萄糖和酵母膏 的混合液，发酵时间为36土2h;
发酵完成活菌数达1.5xl09cfu/mL，芽孢数达1.29xl09cfu/mL。
(4) 湿菌体的制备
将用发酵罐发酵培养所得的发酵液12000 r/min离心20min,弃上清，菌 体加入无菌水悬浮混匀，再12000 r/min离心15 min,弃上清得湿菌体。
(5) 干粉菌剂的制备
菌体称重后，称等重量的无水CaC03。 CaC03缓慢加入湿菌体中，边加 边搅拌，直至均匀。于真空干燥箱中5(TC烘干30min至粉末状，干粉菌剂 中活芽孢数为2.109土(U66)xl011 cfu/g。
(6) 干粉水溶液(菌悬液)制备
制备方法是称取0.1 g干粉菌剂溶于100 mL水中，搅拌均匀得菌悬液(1.0 xl08cfu/mL)。
(7) 试验方法
分别取水稻(丽江新团黑谷)叶片10片，分成两组。 一组做对照，以清 水处理后，滴加稻瘟病菌孢子悬液(浓度为3xl04 cfu/mL) —滴，每个叶片 接种3处；另一组用菌悬液处理，同样条件下接种稻瘟病菌孢子悬液。随后 培养皿26'C保湿培养(光照12h，黑暗12h)， 48h后去除孢子悬液，72h后 观察统计叶片的发病情况。
(8) 试验结果
结果表明，经菌悬液处理后的水稻叶片多不发病或只是轻微发病，病斑 直径《lmm2，而清水处理后的叶片均发病，病斑直径平均为5X2 mm2，且 病斑具有坏死中心。
实施例3枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No. 1982的菌悬液对玉米小斑病的防 效
采用与实施例1基本相同的方法检测了该菌株菌悬液对玉米小斑病菌的 防治效果。结果表明，经菌悬液处理后的玉米(B73C)叶片均未发病；而清 水处理后的玉米叶片均发病，病斑直径平均为2X2mm2。 实施例4枯草芽孢杆菌菌株干粉水溶液(菌悬液)对黄瓜种子促芽及生长试 验
(1) 菌悬液的制备同实施例l。
(2) 黄瓜种子处理
用菌悬液浸泡黄瓜种子，25'C浸泡24h。然后将种子转移至铺有含菌悬 液的滤纸培养皿中，25'C催芽保湿24h。以清水浸泡种子和清水催芽保湿为 对照。每皿20颗种子，每个处理三次重复。观察菌悬液对黄瓜出芽和芽生 长的影响。
将菌悬液浸泡催芽后的种子播种于装有无菌的营养土和蛭石的花盆中。 以清水浸泡处理种子做对照。每处理6盆，重复3次。每盆播种5粒，置于 培养室中，光暗时间12h/12h条件下培养。出苗后每盆留苗4株。待苗的第 一片真叶展开后，统计苗成活率、株高、株重，对结果进行统计分析。 (3)结果
菌悬液对黄瓜种子的发芽无抑制作用，处理组出芽率为97.91%,对照为 97.82%,处理和对照没有显著差异；出芽后菌悬液对芽表现出促生长作用， 催芽2d后生菌悬液处理种子平均芽长为1.66 cm,比对照高出0.27 cm，促芽 生长率达19.42%。
经浸种处理的黄瓜苗的平均株高、株重和苗成活率都显著高于清水处理 (对照)，说明菌悬液处理对黄瓜苗的生长具有促生作用；浸种处理的黄瓜苗 长势良好，苗整齐粗壮，而对照组同等条件下黄瓜苗细弱，整体长势较差。 实施例5枯草芽孢杆菌菌株干粉菌剂拌种对盆栽黄瓜苗的促生作用
(1) 干粉菌剂的制备同实施例l。
(2) 拌种处理及播种 将清水浸泡和催芽的种子与干粉菌剂按照重量比100:1拌种后，播种于
装有无菌的营养土和蛭石的花盆中。以清水浸泡未拌种处理种子做对照。每 处理6盆，重复3次。每盆播种5粒，置于培养室中，光暗时间12h/12h条 件下培养。出苗后每盆留苗4株。待苗的第一片真叶展幵后，统计苗成活率、 株高、株重，对结果进行统计分析。
(3) 结果
经拌种处理的黄瓜苗的平均株高、株重和苗成活率都显著高于清水处
理(对照)，说明菌剂拌种对黄瓜苗的生长具有促生作用；经拌种处理的黄瓜 苗长势良好，苗整齐粗壮，而对照组同等条件下黄瓜苗矮小，整体长势较差。 实施例6枯草芽孢杆菌菌悬液对离体黄瓜叶片黄瓜炭疽病发病的影响
(1) 浸种与催芽处理；拌种处理及播种同上。
(2) 叶面喷洒处理待黄瓜叶苗第一片真叶完全展开后，对清水浸种的 苗进行菌悬液叶面喷洒处理，每棵喷洒菌悬液10mL。
(3) 接种实验
分别剪取经菌悬液浸种、干粉菌剂拌种、菌悬液叶面喷洒处理苗的第三 片真叶，以清水未处理叶片做对照，置于滤纸保湿的培养皿中。每种叶片中 央各滴加黄瓜炭疽病菌孢子悬液20 jtL (浓度为2xl05 cfu/mL)，盖上皿盖置 于光照培养箱中25 'C保湿培养(光照12h，黑暗12h)， 6 d后统计发病情况 和病斑的大小。每皿放置一片叶子，每处理30个重复。
(4) 黄瓜炭疽病调查分级标准 0级叶片无病斑
l级病斑占整个叶片面积的5%以下 3级病斑占整个叶片面积的6% 10% 5级病斑占整个叶片面积的11% 25% 7级病斑占整个叶片面积的26% 50% 9级病斑占整个叶片面积的50%以上
病情指数-i:(各级发病数X该级代表数)/ (总数X最高级代表数) 防效％=[(对照病情指数一处理病情指数)/对照病情指数1 X 100%
(5) 结果
统计比较离体黄瓜叶片病斑直径，发现拌种处理的黄瓜苗的离体叶片对 黄瓜炭疽病的防效较高，与清水处理相比，防效可达77.92%。清水处理离体 叶片保湿培养6 d后，病菌在叶片上生长形成明显的水浸斑；而拌种处理叶 片、喷洒处理叶片、浸种处理叶片经保湿培养6 d后，未见水浸斑，或只在 叶片中央有很小面积的水浸斑，防病效果较好。 实施例7枯草芽孢杆菌菌悬液对盆栽黄瓜苗黄瓜炭疽病的防治 (1)菌悬液的制备同实施例l。(2) 浸种与催芽处理、拌种处理及播种同上。
(3) 黄瓜炭疽病菌孢子悬液制备同上。
(4) 黄瓜苗处理
待黄瓜苗第一片真叶完全展开，菌悬液浸种和干粉拌种的苗直接接种黄 瓜炭疽病菌孢子；对清水浸种的苗分别进行菌悬液浇苗处理和叶面喷洒理， 每盆浇菌悬剂40mL,每棵喷洒菌悬剂10mL。浇苗或喷洒72 h后接种病菌 孢子。每株喷洒接种黄瓜炭疽孢子悬液5mL， 25'C保湿培养(光照12h，黑 暗12h)。每处理6盆，重复3次。以清水处理接种和不接种病菌为对照，分 别于接种后7d、 14d调查发病率及发病程度。
(5) 黄瓜炭疽病调查分级标准同上
(6) 结果
三种处理方式在接种病菌7d和14d后有较好的防效。浸种处理7d后的 防效为84.86%,浇灌处理14d的防效达49.69%。对照组中大部分黄瓜苗发 病，黄瓜叶片因发病干枯；而经生防菌处理过的黄瓜苗只有少部分叶片有发 病症状。
实施例8枯草芽孢杆菌干粉水溶液(菌悬液)对鲜桃果实灰霉病的防治
(1) 菌悬液的制备 同实施例l。
(2) 病菌孢子悬液的制备
将长满桃灰霉的PDA平板中加入含0.01%吐温-80的无菌水，将孢子洗 下，经四层纱布过滤得孢子悬液，血球计数板计数，孢子浓度为lxK)4 cfu/mL。
(3) 剌伤接种
选择健壮、无机械损伤、新鲜、大小一致的桃子，先用2"/。的NaC10消 毒，然后用无菌水冲洗干净，晾干后在每个桃子上用灭菌的接种针剌一个大 小为5x3 mm，深度为3 mm的孔，孔中加入菌悬液20 ^L， 2 h后，每孔中 再加入桃灰霉孢子20nL。以剌伤后接种无菌水，2h后再接种桃灰霉孢子处 理为对照。每处理9个果，各三次重复。每9个果放入一个塑料筐中，25 °C 储藏。每天统计桃发病情况。
发病率％=(发病水果数一该处理的总水果数)X100%
防效％=[(对照发病率一处理发病率)/对照发病率IX100。/0 (4)结果
接种病菌4 d后菌悬液仍能显著抑制病菌在刺伤处的蔓延生长；而清水 处理的对照，所有桃子在剌伤接种的部位已经长出一个较大的病斑，且随时 间的延长病斑直径继续增大。处理组6 d后生防菌株的菌悬液仍能抑制病菌 生长，没有灰霉病斑长出。菌悬液能显著降低灰霉病发病率，病菌接种4 d 后防效达卯％以上，6d后的防效达到40。/。。 实施例9枯草芽孢杆菌菌悬液对小批量鲜桃贮藏保鲜效果试验
(1) 菌悬液的制备 制备方法同实施例l。
(2) 喷洒接种
选择健壮、无机械损伤、新鲜、大小一致的桃子，分别喷洒菌悬液，晾 干后，单果用纸包裹放入纸箱中25'C储藏。每处理9个果实，三次重复。以 不做任何处理为对照。随时观察发病情况，待有一部分果实发病时，统计发 病情况，计算发病指数。
(3) 病果分级标准
0级无病斑 l级病斑直径Sl.0cm
2级病斑直径1.1—2.0 cm 3级病斑直径2.1—3.0 cm 4级病斑直径3.1—4.0cm 5级病斑直径^4.1 cm 病情指数-i:(各级腐烂数X该级代表数)/ (总数X最高级代表数) 防效％=[(对照病情指数一处理病情指数)/对照病情指数]X 100%
(4) 结果
菌悬液对桃储藏有明显的保鲜、防病效果。3 3后的防效为92.8%， 6 d 后防效为40.74%。
权利要求
1、 一种枯草芽孢杆菌(5""7""s s^说/s)菌株，其特征在于在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.1982。
2、 如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No.1982的应用，其 特征在于由该菌体制备的菌剂作为抗农作物病害、蔬菜病害的生防、促生剂 及水果保鲜剂。
3、 按权利要求2所述的枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No.1982的应用，其 特征在于所述菌剂为干粉菌剂，其组成为湿菌体与碳酸钙的质量比为1: 1， 菌剂的活芽孢数含量为200 500亿/克。
4、 按权利要求2所述的枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No.1982的应用，其 特征在于所说的菌剂为干粉水溶液，其组成为干粉菌剂与水的质量体积比为 1: 1000,菌悬液活芽孢数为1.0xi()8cfu/mL。
全文摘要
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌(Bacillius subtilis)菌株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的菌种保藏编号为CGMCCNo.1982。该菌株制成的干粉菌剂可用于防治由小麦赤霉病菌、水稻稻瘟病菌、玉米小斑病菌、黄瓜炭疽病菌、大蒜菌核病菌、黄瓜炭疽病菌等引起的农作物、蔬菜等病害；还可应用于桃、苹果、葡萄、梨等水果保鲜领域。经菌悬液处理后的水稻、玉米叶片，均不能出现相应的病斑；用粉剂拌种、粉剂根埋或菌悬液喷洒方式处理后的黄瓜种子或幼苗叶片，不仅可防止黄瓜炭疽病的发生，而且表现出良好的促生作用，有利于绿色、无公害蔬菜的生产。经菌悬液处理后的鲜桃，烂果率明显降低，贮存期延长。该菌剂制备工艺简单，适合工业化生产。
文档编号A01N63/02GK101121924SQ20071006250
公开日2008年2月13日 申请日期2007年8月2日 优先权日2007年8月2日
发明者兵 彭, 成丽霞, 李小俊, 王立安, 宇 贾 申请人:河北师范大学