专利名称：一种植物抗病毒基因的特异核苷酸序列及其应用的制作方法
技术领域：
抗病毒基因是植物细胞中的一种重要的病毒免疫成分，其重要作用就是拮抗 植物病毒的侵染，从植物组织和细胞中分离的抗病毒基因对于研究和利用植物资源具 有重要作用。本发明通过改进的DNA克隆技术和基因重组技术，将一种番茄(Solanum IycopersicumL)的抗病毒基因的特异核苷酸序列从叶片中分离出来，并在大肠杆菌中克隆 和表达了该基因的特异核苷酸序列。该发明属于植物分子生物技术和基因工程领域。
背景技术：
栽培植物及其农作物具有完备的防卫系统，能够抵御来自于微生物的侵染和危 害。植物个体自身的生化反应过程产生了许多拮抗病原菌的化合物——各种蛋白、多肽、酯 类、酚类的生化小分子，这些生化物质构成了植物的防卫反应系统，并从基因组的核苷酸序 列中表现出来。因此，从植物基因组中提取的核苷酸序列可以通过分子生物学技术和生物 工程的方法加以改造获得新的重组基因来改良农作物品种和品质。来自于植物自身的合成 产物通常对人类和植物本身是没有危害的，也不会对人体产生负面的影响，是环境友好型 的环保产品。植物的病害防治需要分子病理学方法进行大量深入而细致的研究。这些研究包括 病毒致病过程、化学防治技术、植物抗病机制及抗病品种培育等。随着植物分子生物技术和 分子病理学研究的深入，建立在现代分子生物学和植物基因工程技术之上的抗病基因工程 研究丰富了植物抗病研究的理论基础，推动了植物病害防治和生物农药的发展。自从1986年诞生第一株抗病毒工程植株以来，植物抗病毒基因工程研究不论在 深度上还是广度上都取得了很大的发展。来自于番茄的病毒抗性基因Tm-2能够在植物组 织内获得植物免疫系统的启动和抗性形状的表达，有助于植物自身免疫系统的激发和有到 对病毒的抗病性。那么，基因工程的方法获得的基因产物及其表达的抗病毒蛋白，无论在理 论和实践上都具有及其重要的应用价值。番茄通常拥有三个抗番茄花叶病毒(ToMV)的基因Tm-I，Tm-2, Tm_22，其中Tm_2， Tm-22 基因同位于 9 号染色体的长臂上(Meshi T et al 1989，Motoyoshi F, et al 1996) 靠近着丝点处。含有Tm-2基因的材料H. E. 是1958-1963年由Soost从Frazier 提供的材料中筛选出来的，它具有抗iToMV-O和ToMV-1病毒的特性，被称为Tm_2基因。 Laterrot和Pecaut于1963年分离了另一个Tm-2基因的突变体，被称为Perou 2，是一 个不含有ην基因的材料，被广泛用做亲本材料。McRitchie和Alexander于1963年从 Lycopersiconperuianum (Hal 1,1980)中筛选了 一个突变体，能够抗病毒株系iToMVj和 其它毒株，同年Alexander将该基因转移到栽培番茄(Lycopersicon esculentum L)中。 Pelham(1966)研究指出该突变体对ToMV的5个毒株均免疫，并将其定名为Tm_22。随后 的研究发现，Tm-2和Tm-22基因互为等位基因，前者抗除了 ToMV_2以外的所有感染番茄的 ToMV株系，后者对所有感染番茄的ToMV免疫，对ToMV-加感病。两个基因的抗病反应均呈 两种反应症状，一是坏死斑，二是系统坏死，不同的条件下反应不同。研究还发现，Tm-2和Tm-22基因是一对温度敏感型的抗病基因，温度在25-35°C的条件下，比在低于21°C的条件 下更易产生系统坏死症状。Tm-22纯合基因型和杂合基因型的植株对不同病毒株系的抗病 反应也有所不同。Schroeder (1967)研究指出，接种ToMV-O的Tm_22纯合基因型植株在任 何温度下均能诱导形成坏死斑，而Tm-22杂合基因型植株只在30°C下诱导形成坏死斑；诱 导系统坏死的Tm-22纯合基因型只发生在35°C条件下，而Tm-22杂合基因型植株系统坏死 的发生要求在25°C下(Hall. J 1980 ；余诞年等2001)。上述研究表明，抗病毒基因的表达与否并不完全取决于抗病毒基因本身，重要的 是抗病毒基因所受到的自身或环境因素的调控，也就是说，基因调控序列或者调控因子起 了决定性的作用。
发明内容
本发明采用植物中存在的抗病毒基因进行基因克隆。这种抗病毒基因对番茄 的Tm-2基因产生的抗病毒蛋白的表达和应答反应起着关键的作用。本发明将一种番茄 (Lycopersicon esculentum L)的抗病毒基因的特异核苷酸序列从叶片中分离出来，并在 大肠杆菌中克隆和表达了该基因的特异核苷酸序列-Tm-56。来源于基因组DNA的Tm_E56， 其核苷酸序列与病毒抗性的抗病毒基因Tm-2密切相关。研究证实，该特异核苷酸序列与番 茄的抗病性状同步表达，Tm-56特异性核苷酸序列是一段与番茄的抗病基因和性状相关的 分子标记，可用于品种选育的分子标记。通过基因克隆和基因工程实施抗病毒基因及其特 异核苷酸序列分离和合成，对于植物的分子育种和抗病品种选育具有广阔的应用前景。本发明的目的是通过基因克隆技术和基因重组技术，从番茄叶片中分离和克隆抗 病毒基因的特异核苷酸序列-Tm-E56，在原核中生物体中克隆和表达具有功能的编码基因， 获有利于环境和人类健康的抗病毒基因，应用于新品种的培育。所述的长度为622bp的抗病毒基因的特异核苷酸序列-Tm-56，由PCR技术从番茄 的基因组DNA中扩增获得。从琼脂糖凝胶电泳中回收后，回收片段插入到克隆载体PUCm-T 中，获得了含有特异核苷酸序列-Tm-56扩增片断的重组质粒pUCm/Tm-56。重组质粒pUCm/ Tm-56包含有长度为622bp的特异核苷酸序列-Tm_56。该质粒经转化大肠杆菌(E. coli) DH5a获得克隆菌株pUCm/Tm-E56，其菌种已经保藏，菌种保藏日期2009年12月21日，保 藏号为CCTCC M 209308。对抗病毒病的番茄品种和亲本进行琼脂糖凝胶电泳的测试表明， 所有的7个抗病毒病品种(系)——包括3个杂交品种和4个杂种一代品系——中的DNA 样品都具有622bp的特异核苷酸序列。这7个抗病毒病品种(系)中的9个亲本有5个是 具有622bp的特异核苷酸序列的抗病毒病品系，4个是不具有622bp的特异核苷酸序列的感 病毒病品系。在抗病毒病亲本与感病毒病亲本的杂种一代或者品种中，抗病毒病亲本的抗 病性状对感病毒病亲本具有显性效应，即622bp的特异核苷酸序列在分子标记中具有显性 性状分子标记特征。利用DNAMAN 5. O进行这些番茄品种(系)同源基因的核苷酸序列序列比对和验 证，表明这些番茄品种(系)的622bp的DNA扩增片断具有高度的同源性。该序列片段位于 第九号染色体的长臂上，位于Tm-2基因的上游，与Tm-2基因连锁，分子标记与抗ToMV病毒 病基因共分离。感病品种同源序列的扩增长度短于622bp。测序结果表明，抗病品种(系) 与感病品种(系)二者的同源性只有80%。其中，感病品种的该片段长度缺失了 51bp。利用NCBI网站的⑶-Search服务来分析和检测这段622bp核苷酸序列，没有相似的片段在 GenBank上发表，表明这段622bp的核苷酸序列具有特异性，这段特异性片段的获得具有创 新性。本发明的技术特点1、从番茄叶片中分离抗病毒基因的特异核苷酸序列；2、通过 大肠杆菌克隆了这段核苷酸序列；3、该段核苷酸序列具有特异性，只有抗病毒病品种(系) 表达这一序列；4、可用于番茄的抗病毒病分子育种和种质鉴定。因此，以该特异核苷酸序列为模版合成的或分离的其它植物基因，如果其基因结 构与SEQ NO. 1的所述的核苷酸序列相似，则在具有专业知识的工程技术人员的操作下，经 过一定的和部分的核苷酸序列的修饰(突变、缺失、替代、剪贴、重复、倒位、易位、转座、重 组和拼接)以及一个或数个碱基(氨基酸)的改变，可以获得同类基因，并不能够显著地影 响抗病毒蛋白的功能。使用经过核苷酸序列的修饰以及一个或数个碱基改变的抗病毒基因 及其特异核苷酸序列，并且具有与SEQ NO. 1的核苷酸序列70%以上相似序列都属于本专 利的发明内容和保护范围。
附图1 :7个抗病毒病品种(系)及其9个亲本的特异核苷酸序列(622bp)的琼 脂糖凝胶电泳图片。附图1显示，抗病品种(系)及其9个亲本的这个特异核苷酸片段 长度为622bp，这是一个抗ToMV基因的特异分子标记。该序列片段位于第九号染色体的 长臂上，位于Tm-2基因的上游，与抗病毒基因Tm-2共分离。图中，感病样品标注-S ；抗病 样品标注-R。品种(系)名称从左到右为S1粉(R)，粉莎1号㈨，S93粉⑶，Marker， 72-69 (S)，F2-69x2 (R)，S 以 2-4 (R)，美丽莎(R)，S70 (S)，02-2-2-1 (R)，F2x02-2 (R)，S 以 2-4 (R)，F2x98 (R)，S98 (R)，S21 (R)，F2x21 (R)，S 以 2-4 (R)，莎龙(R)，P 清 3 ⑶。
具体实施例方式本发明以几种重要的茄科病毒抗性基因的DNA序列设计扩增引物，对辣椒 (Capsicumfrutescens var)基因组DNA进行扩增，获得了一个抗病毒相关的基因。具体实 施方式如下1)采用I^rimer Premier 5. 0软件设计一对特异引物。引物序列为 5E15~-ATACTTAATAATTTTTAAAT-3，6E1 -TACAGATTTATTGATTACT-32)番茄DNA的提取采用CTAB法提取，实施PCR基因扩增技术获得目标序列。PCR 程序为 95°C IOmin ；95°C 30S，53°C 30S，72°C 2. 5min，42 个循环；72°C延伸 lOmin。3) PCR扩增产物回收后克隆至载体PUCm-T中，获得重组质粒pUCm/Tm_56，该质粒 经转化大肠杆菌DH5ci获得克隆菌株pUCm/Tm-E56。双向测序验证并获得了长度为622bp 的DNA扩增片断——SEQ NO. 1所示序列从75_696bp。4)用同样的引物实施PCR扩增抗病毒病的三个番茄品种粉莎1号(Si粉X S93 粉)、美丽莎(S以2-4 X S70)、莎龙(S以2-4 X P清幻以及四个杂种一代F2_69x2 (72-69 X S 以 2-4)、F2x02-2 (02-2-2-1 X S 以 2-4)、F2x98 (S 以 2-4 X S98)、F2x21 (S21 X S 以 2-4)，这7个品种(系)在琼脂糖凝胶电泳上均具有622bp的DNA扩增片断——抗病毒基因 特有的核苷酸序列或称分子标记，它们的亲本至少一个为具有622bp的DNA扩增片断，表明它们均为拥有特异核苷酸序列的抗病毒基因。这些抗病毒病的5个亲本是Sl粉、S以2—4、02—2—2一l、$98、$21；而感病的4个亲本是$93粉、72—69、$70、P清3。详见说明书附图l。[OOl 9] 5)将这622bp的DNA序列用NCBI网站的CD—Search服务来检测这段核苷酸序列的特异性，搜索显示没有相似的片段在GenBank上发表，因此，这段622bp的核苷酸序列具有特异性。
SEQ NO．1番茄抗病毒基因的特异核苷酸序列
序列表SEQ NO．1
<110>姜国勇
<14l>2009一12—25
<170>Patent In Version 2．1
<210>l
<2l l>622
<2 l 2>DNA
<220>
<22 l>mi SC feature
<220>
<222>(75)．．．(696)
ACCGTAATAC GACTCACTATAGGGCGACAT ATGATCGATG ATATCCCATG GGCGGCCGCC60
TGCAGACCAG GTCT从TGATACTT从T从TTTTTA从TCTGTAGAGAT从TAGT从CTCA1 20
从T从TTAGTTGTAGTATCA CATCTTTACTATTTTAT从C从TGTAAAGA TGATTATATA1 80
TTTCTTGGTTTTGTCATTTGTGTC九仙人CT ATCCTATTTT ATTTAACTAT TTGAAAATAA300
TTTTAGGGGGTAAAAATTTTGACATCGATA GGGCGCTCAA AGCTTACGCCTTGTACTTAA420
TTTCATT从TGTGCAGCTGC CCCACGTTGTCACTCCCCTTCTTCTTTATC ATTTCCTTCT540
TGACATTATTAGGAGACTTG GCCGTGGACT CCATCTACCA CTAAAAAGCTAAAGCCATCA600
GTATACTCATTTTTTGGTAG CTACTGAAAA AGAGAGAAAA AAAAATGGCTGAAATTCTTC660
TTACATCAGT从TC从TA从TCTGTAGA从TAGCTGAAGA CTGGAGATCTGGATCCCTCG720[00523 AGTCTAGAGT CGACCTGCAG GCATGCAAGCTTGGCGTAAT760
权利要求
1.一种从番茄叶片中分离出来的抗病毒基因的特异核苷酸序列，并在大肠杆菌中克隆 和表达了该基因的特异核苷酸序列-Tm-56。其核苷酸序列为SEQ NO. 1所示的622bp与病 毒抗性的抗病毒基因Tm-2密切相关。
2.一种含有抗病毒基因的重组质粒，并在大肠杆菌(E.Coli)DH5a获得克隆菌株 pUCm/Tm-E56,该菌株含有克隆获得的抗病毒基因的特异核苷酸序列-Tm_56。该菌株保藏号 为CCTCC M 209308，保藏日期2009年12月21日。
3.—种622bp的特异核苷酸序列是抗病毒病番茄品种(系)的重要特征一一分子标 记。该序列片段位于第九号染色体的长臂、Tm-2基因的上游，与Tm-2基因连锁。该特意核 苷酸序列与抗ToMV病毒病基因共分离。以此为标记的抗病性状对感病性状具有显性效应， 即622bp的特异核苷酸序列在分子标记中具有显性性状分子标记特征。其功能可用于番茄 的分子育种和抗病毒病品种(系)选育及其鉴定。
4.一种植物的抗病毒蛋白基因的克隆技术和方法，其技术特征1)设计的引物；2)DNA 提取后的核苷酸序列PCR扩增技术；幻载体克隆技术；4)抗病品种(系)的DNA鉴定和分 子标记；5)同源基因的核苷酸序列序列比对和验证方法。
5.使用经过核苷酸序列的修饰以及一个或数个碱基改变的特异核苷酸序列，并且具有 与SEQ NO. 170%以上同源性的核苷酸序列都属于本专利的发明内容和保护范围。
全文摘要
本发明涉及一种植物抗病毒基因的特异核苷酸序列及其应用，通过DNA克隆技术和基因重组技术，将一种番茄(Solanum lycopersicum L)的抗病毒基因的特异核苷酸序列从叶片中分离出来，并在大肠杆菌中克隆和表达了该基因序列。该发明属于植物分子生物技术和基因工程领域。本发明克隆的核苷酸序列为SEQ NO.1所示，长度为622bp。该序列经过重组、克隆和转化大肠杆菌(E.coli)DH5α获得了克隆菌株pMD/Tm-E56，保藏日期为2009年12月21日，保藏号为CCTCC M 209308。本发明的技术特点1、从番茄叶片中分离抗病毒基因的特异核苷酸序列；2、通过大肠杆菌克隆了这段序列；3、该段核苷酸序列可用于番茄的分子育种和种质鉴定。
文档编号A01P1/00GK102108358SQ20091025645
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月25日 优先权日2009年12月25日
发明者姜国勇 申请人:姜国勇