专利名称：稳定的液体harpin蛋白制剂的制备、制剂及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及稳定的液体harpin蛋白制剂的制备、制剂及用途。
背景技术：
植物已经进化出能辨别和响应包括病原体感染在内的环境信号的一系列复杂 的生物化学通路。在病原体和植物之间有两种主要的相互作用一相容和不相容。当病 原体和植物相容时，通常就发生疾病。如果病原体和植物不相容，则植物通常对该特定 的病原体有抵抗力。在不相容的相互作用中，植物通过引起感染部位周围一小范围的局 部坏死或组织死亡而限制病原体的繁殖。植物的这一反应被定义为过敏反应(“HR”) (Kiraly，“ Defenses Triggered by the Invader-Hypersensitivity，“ Plant Disease An Advanced Treatise 5 :201-224J. G. Horsfall and E.B.Cowling,eds. Academic Press， New York (1980) ；Klement， “ Hypersensitivity, "Phytopathogenic Prokaryotes 2 149-177，M. S. Mount and G. H. Lacy, eds. Academic Press，New York (1982))。局部细胞死 亡不仅能遏制感染病原体的进一步扩散，还会导致系统抗性，防止其它病原体的后续感染。 因此，HR是植物对由细菌、真菌、线虫和病毒引起的疾病的抗性的常见形式。一组命名为 hrp (Hypersensitive Response and Pathogenicity)的基 因是由包括欧文氏菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属和劳尔氏菌属在内的病原菌诱 导 HR 的原因(Willis 等“hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria, “ Mol. Plant-Microbe Interact· 4 132-138(1991) ；Bonas，〃 hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria， 〃 pp. 79-98 in :Current Topics in Microbiology and Immunology, Vol.192， Bacterial Pathogenesis of Plants and Animals :Molecular and Cellular Mechanisms. J. L. Dangl, ed. Springer-Verlag, Berlin(1994) ；Alfano 等， “Bacterial Pathogens in Plants :Life Up Against the Wall, “ Plant Cell 8:1683—98(1996))。 通常，有多个hrp基因聚集在30-401Λ的DNA片段中。hrp基因中的任何一个的突变将导致 宿主植物中细菌病原性的丧失和非宿主植物的HR。基于基因和生物化学表征，hrp基因的作用可以分为三组(1)编码位于细胞外的 如 harpin 的 HR 诱导子的结构基因(Wei 等〃 Harpin，Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora “ Science 257 85(1992) ；He 等“Pseudomonas syringae pv.Syringae harpinpss :A Protein that is Secreted Via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants, “ Cell 73 :1255(1993) ；Arlat 等“PopAl, a Protein which Induces a Hypersensitive-Like Response on Specific Petunia Genotypes, Is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum， “ EMBO J. 13 :543-53 (1994) ；Kim等"HrpW of Erwinia amylovora, a New Harpin that Contains a Domain Homologous to Pectate Lyases of a Distinct Class， “ J. Bacteriol. 180 :5203-10(1998))； ⑵编码用于将HR诱导子和其它蛋白质从细菌的细胞质输出至细胞表面或细胞外空 间的泪液分泌部的分泌基因(Van Gijsegem 等，“Evolutionary Conservation of Pathogenicity Determinants Among Plant and Animal Pathogenic Bacteria，“ Trends Microbiol.1 :175-180(1993) ；He 等，“Pseudomonas syringae pv.Syringae harpinpss AProtein that is Secreted Via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants，“ Cell 73:1255(1993) ；Wei 等，“HrpI of Erwinia amylovora Functions in Secretion of Harpin and is a Member of a New Protein Family,“ J. Bacteriol. 175 :7985-67(1993) ；Arlat 等“PopAl, a Protein which Induces a Hypersensitive-Like Response on Specific Petunia Genotypes, IsSecreted via the Hrp Pathway ofPseudomonas solanacearum “ EMBO J. 13 :543-53 (1994) ；Galan 等，“Cross-talk Between Bacterial Pathogens and Their Host Cells， “ Ann. Rev.Cell Dev. Biol. 12 :221-55(1996) ；Bogdanove 等，“Erwinia amylovora Secretes Harpin via a Type III Pathway and Contains a Homo log of yopN of Yersinia，“ J. Bacteriol. 178 :1720-30 (1996) ；Bogdanove 等，"Homology and Functional Similarity of a hrp-linked Pathogenicity Operon， dspEF， of Erwinia amylovora and the avrE Locus of Pseudomonas syringae Pathovar Tomato， “ Proc. Natl. Acad.Sci. USA 95 :1325-30(1998))；和(3)控制 hrp 基因表达的调节基因(Wei，“ Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora" Science 257:85(1992) ；Wei等，"hrpL Activates Erwinia amylovora hrp Genes in Response to Environmental Stimuli，“ J. Bacteriol. 174 :1875-82(1995)； Xiao等，"A Single Promoter Sequence Recognized by a Newly Identified Alternate Sigma Factor Directs Expression of Pathogenicity and Host Range Determinants in Pseudomonas syringae“ J. Bacteriol. 176 :3089-91(1994) ；Kim 等，“The hrpA and hrpC Operons of Erwinia amylovora Encode Components of a Type III Pathway that Secretes Harp in, “ J. Bacteriol. 179 :1690-97 (1997) ;Kim 等，“HrpW of Erwinia amylovora, a New Harpin that Contains a Domain Homologous to Pectate Lyases of a Distinct Class，“ J. Bacteriol. 180 :5203-10 (1998) ;Wengelnik 等，“HrpG，A Key hrp Regulatory Protein of Xanthomonas campestris pv.Vesicatoria is Homologous to Two Component Response Regulators， “ Mol. Plant-Microbe Interact.9 704-12 (1996)) ο由于在植物和微生物之间相互作用中所起的作用，hrp基因已经成为细菌 病原性和植物防御反应研究的焦点。 除局部防御反应外，HR还激活同一植物中未被感染部分的防御系统。这就产生 了对继发性感染的全面的系统抗性，命名为系统获得抗性(“SAR”)(Ross，“ Systemic Acquired Resistance Induced by Localized Virus Infections in Plants," Virology 14 :340-58(1961) ；Malamy等，"Salicylic Acidand Plant Disease Resistance," Plant J. 2 :643-654(1990)) 0 SAR赋予对广谱病原体长期的系统疾病抗性，并与某一套基因的表 达相关联(Ward 等，"Coordinate Gene Activity in Response to Agents that InduceSystemic Acquired Resistance，" Plant Cell 3 :1085-94 (1991))。由于诱导植物保护自 己的潜力能显著地减少或摆脱对化学杀虫剂的需求，所以SAR是植物抗病性的重要组成部 分，已经长期受到关注。SAR可以用生物试剂(微生物)或非生物(化学)试剂诱导(Gorlach et al. ， “ Benzothiadiazole, A Novel Class of Inducers of Systemic Acquired Resistance，Activates Gene Expression and Disease Resistance In Wheat, “ Plant Cell 8:629-43(1996)).历史上，弱毒性的病原体被用作SAR的生物诱导剂。也有报道指 无毒的植物生长促进细菌能诱导某些植物对于各种疾病的抗性。生物试剂诱导的SAR已成为很多研究的主题。随着分子生物学的发展，第一个具 有广宿主谱的蛋白质HR诱导子于1992年从引起苹果树和梨树火疫病的梨火疫病欧文氏菌 (Erwinia amylovora)(—种病原菌)中分离出来。该HR诱导子被命名为“harpin"，现被 称为harpinfe或HrpNsa。HarpinEa,由403个氨基酸组成，分子量约为40kDa。编码这一 蛋白质的基因，hrpN，包含在位于hrp基因簇中间的1. 3kb DNA片段中。Harpinfe被分泌 入细胞外的空间，对蛋白酶消化很敏感。自从梨火疫病欧文氏菌中分理出harpinEa以来，其它一些harpin或类harpin 的蛋白质也已经从其它主要的植物病原菌组中分离出来。除harpinEa外，以下的harpin 或类harpin的蛋白质已被分离并被表征菊欧氏杆菌的HrpN、软腐欧氏杆菌(Wei 等，“Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora, " Science 257 :85 (1992))和玉米枯萎欧氏杆菌、丁香假单 胞杆菌的HrpZ (He et al. , “ Pseudomonas syringae pv. Syringae harpinpss :A Protein that is Secreted Via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants, “ Cell 73 :1255(1993))、青枯雷尔氏菌的 PopA(Arlat 等，“PopAl，a Protein which Induces a Hypersensitive-Like Response on Specific Petunia Genotypes, Is Secreted viathe Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum, " EMBO J. 13 543-53(1994))和梨火疫病欧文氏菌的 HrpW(Kim 等，“Hrp W of Erwinia amylovora, a New Harpin that Contains a Domain Homologous to Pectate Lyases of a Distinct Class, “ J. Bacteriol. 180 :5203-10(1998))和丁香假单胞杆菌。类harpin的蛋白质有共同的特性。它们是热稳定的具有不多于一个半胱氨酸残 基(更典型地，没有半胱氨酸残基)的富含甘氨酸的蛋白质，对蛋白酶消化敏感，以及诱 发HR并诱导许多植物对多种疾病的抗性。基于它们共有的生物化学、生物物理学特性以 及生物学功能，这些来自不同病原菌的HR诱导子属于harpin蛋白系列。这些共有的特 性和它们在大范围的植物中诱导HR的能力使harpin蛋白系列区别于其它的宿主特异性 蛋白酶HR，如来自疫霉菌的激发素(Bonnet等，“Acquired Resistance Triggered by Elicitors in Tobacco and Other Plants, 〃 Eur.J. Plant Path 102 :181-92(1996)； Keller 等"Physiological and Molecular Characteristics of Elicitin-induced Systemic Acquired Resistance in Tobacco, " Plant Physiol. 110 :365-76 (1996))和来自黄枝孢菌的非病原性蛋白(如Avr9)，这些仅能激发特定种属植物中的HR。本质上，当发生某些细菌感染时，harpin蛋白被表达，然后被细菌分泌，给植物发 信号对感染发动抵抗。Harpin充当信号以激活植物的防御反应及其它生理系统，包括SAR、 生长增强和对某些虫害的抗性。
迄今为止，harpin产品及其在农业和园艺中的用途一直是作为涂在淀粉上的粉状 固体。由于粉状harpin蛋白在水中的悬浮液体在发生明显降解和失活前仅有48-72小时 的有效使用寿命，这就限制了 harpin蛋白的使用和多用性。本发明涉及克服现有技术中的这些以及其它的局限性。
发明内容
本发明的一个方面涉及制备含harpin蛋白或多肽的稳定液体组合物的方法。本 方法包括获得基本上没有细胞碎屑且包含harpin蛋白或多肽的液体提取物。将杀生剂和 任选蛋白酶抑制剂与非离子表面活性剂之一或这两者引入该液体提取物，由此得到包含 harp in蛋白或多肽的液体组合物，其保持harpin活性至少约72小时。本发明的另一方面涉及组合物，所述组合物包含水基载体、harpin蛋白或多肽、有 效量的杀生剂和任选有效量的蛋白酶抑制剂或非离子表面活性剂之一或这两者。该组合物 保持harpin活性至少约72小时。本发明的再一方面涉及诱导植物反应的方法。本方法包括对植物或植物种子施加 本发明的组合物。在能有效地诱导植物反应的条件下实施对植物或植物种子施加本发明的 组合物。本发明涉及制备harpin蛋白或多肽的稳定液体制剂的新方法。如在所附的实例 中所示，已经制备了在数月时间内能保持显著的过敏反应诱导活性的稳定制剂。因为不再 需要进行大量处理以制备粉状的含harpin制剂，在制造和销售含harpin的产品中，延长液 体harpin制剂的保存期限的能力非常重要。这导致了若干优点或好处，包括(i)通过排除 了粉末载体材料以及当前在生产粉末制剂中使用的干燥工艺而节约了成本；(ii)避免了 对使用者的粉尘危害；(iii)液体制剂更容易使用，因为它能容易地用水稀释和与其它液 体(待施用的其它农用化学品)混合，而粉末制剂需监视其溶解；(iv)因为与称量正确量 的粉末制剂相比，液体制剂更容易配制适量的体积，所以液体制剂能更精确地配制；和(ν) 液体制剂具有与其它农用化学品一起作为技术级材料用于制剂的潜力。
具体实施例方式本发明的一个方面涉及制备含harpin蛋白或多肽的稳定液体组合物的方法。本 方法包括获得基本上没有细胞碎屑且包含harpin蛋白或多肽的液体提取物。将杀生剂和 任选蛋白酶抑制剂与非离子表面活性剂之一或这两者引入该液体提取物，由此得到包含 harpin蛋白或多肽的液体组合物，其保持harpin活性至少约72小时。用在本文中的术语“harpin蛋白或多肽”是指现有技术中公认类别的蛋白质中的 任何一员，所述蛋白质由植物细菌产生，并共有结构特性及诱导植物过敏反应的能力。在生 物化学中，这些蛋白质或多肽具有若干共同的结构特性。这些共同的结构特性包括富含甘 氨酸、对热稳定、亲水、无N-末端信号序列和易发生蛋白水解。参见Bonas，“ Bacterial Home Goal by Harp ins, " Trends Microbiol. 2 :1-2(1994) ；Gopalan 等“ Bacterial Genes Involved in the Elicitation of Hypersensitive Response and Pathogenesis," Plant Disease 80 :604-10 (1996)；和 Alfano 等〃 The Type III Hrp) Secretion Pathway of Plant Pathogenic Bacteria !Trafficking Harpins,Avr Proteins,and Death," Journalof Bacteriology 179 :5655-5662 (1997)，据此将上述每个的内容均以引用的方式全文并 入。此外，harpin共有与其独特的生物活性相关的独特二级结构。该结构具有两种主要的 组分，α螺旋单元和具有片状或随机转角结构的松弛酸性单元。当缺乏上述一种或两种组 分时，过敏反应诱导不会发生。参见Fan等PCT Publ. No. WO 01/98501，该文以全文引用的 方式并入。harpin蛋白还共有能诱导特定植物反应的能力(即，在处理植物和生长出该植 物的植物种子之后)。诱导植物抗病性、植物生长、抗虫性、抗脱水性以及收获后抗病性 (在诸如水果和蔬菜的收获后的植物产品中)是其中的一些较重要的用途。harpin蛋白 的这些用途描述于以下专利中授予Qiu等的美国专利第6，277，814号、授予Wei等的美 国专利第5，776，889号、授予Zitter等的美国专利第5，977，060号、授予Qiu等的美国专 利第6，235，974号、Wei等的美国专利申请第2003/0104979号、Wei等的美国专利申请第 2002/0019337号以及美国专利申请第2004/(^6M42号，以上每项专利以全文引用的方式 并入。这些反应的诱导的原因是茉莉酸/乙烯和水杨酸防御途径的上调以及调节光和作用 和营养摄入的植物生长途径。一组harpin蛋白或多肽包括(但不限于)梨火疫病欧文氏菌HrpN的同源物，其 包括那些来自欧文菌属、泛菌属和果胶杆菌属的种属。这种同源物的例子包括在以下确定 的那些 harpin 蛋白Genbank Accession Nos. AAC31644 (梨火疫病欧文氏菌)；AAQ21220、 AAQ17045, CAE25423, CAE25424, CAE25425 和 CAFM88I (亚洲梨火疫病菌)；CAC20124、 Q47278、Q47279 和 AAY17519 (菊欧氏杆)；CAE25422 (欧文菌株 JP557) ；AAGO1466 (玉米细菌 性枯萎病菌)；AAF76;342(成团泛菌)；ABZ05760、ABI15988、ABI15989、ABI15990、ABI15991、 ABI15992、ABI15996、ABK80762、ABD04037、ABI15994、ABD04035、ABD04036、AAY17521、 AAX38231、ABI15995、AAQ73910 和 CAL69276 (细菌性软腐病菌)；YP_050198、AAS20361 和 CAE45180(Pseudomonas atrosepticum)；禾口 ABD22989(Pseudomonas betavasculorum)；上 述菌属以全部引用的方式并入本文。另一组harpin蛋白或多肽包括(但不限于)梨火疫病欧文氏菌HrpW和丁香 假单胞菌的同源物，其包括选自以下种属的那些菌属欧文菌属、假单胞菌属、黄单胞菌 属、噬酸菌属和果胶杆菌属。这种同源物的例子包括在以下确定的那些harpin蛋白 Genbank Accession Nos. U94513、CAA74158、AAC04849 和 AAF63402 (梨火疫病欧文氏 菌)；AAQ17046(亚洲梨火疫病菌)；ΥΡ_001906489 (欧文氏菌)；YP_050207 (细菌性软 腐病菌atros印ticum亚种)；AF037983 (菌性斑点病菌)；AA050075 (菜豆晕疫病菌)； AAL84244(十字花科蔬菜黑斑病假单胞菌)；AAX58537、AAX58557、AAX58525、AAX58531、 AAX58527、AAX58577、AAX58491、AAX58515、AAX58517、AAX58523、AAX58583、AAX58451、 AAX58561、AAX58453、AAX58541、AAX58589、AAT96311、AAX58497、AAX58579、AAX58449、 AAX58485, AAX58563, AAX5858U AAX58575, AAX58569, AAX58567, AAX58505, AAX5859U AAX58503、AAX58507、AAX58509、AAX58469、AAX58441、AAX58543、AAX58495、AAX58549、 AAX58593、AAX58511、AAX58519、AAT96270、AAX58447、AAX58571、AAX58465、AAX58489、 AAX58533、AAX58535、AAX58461、AAT96350、AAX58473、AAX58483、AAX58475、AAX58457、 AAX5246U AAX52457, AAT96222,(绿黄假单胞菌)；ABA472"和 BAGMll7 (菊假单胞 病菌)；CAH57O75 (Pseudomonas avel lanae) ；BAES0274 和 BAE8OM2 (燕麦噬酸菌)；和AAM37767(柑桔溃疡病菌)；上述菌属以全部引用的方式并入本文。再一组harpin蛋白或多肽包括(但不限于)丁香假单胞菌属HrpZ的同源 物，其包括假单胞菌属的其它种属中的那些。这种同源物的例子包括在以下中确定的 那些 harp in 蛋白Genbank Accession Nos. P35674、AAB00127、ABL01505、AAQ92359、 BAD20880、BAD20876、BAD20892、BAD20884、BAD20928、BAD20936、BAD20932、BAD20924、 BAD20856、BAD20864、BAD20860、BAD20848、BAD20844、BAD20836、BAD20840、BAD20824、 BAD20842、BAD20820、BAD20916、BAD20872、BAC81526、087653、BAA74798、BAD20904, AAB86735、BAD20912、BAD20908、ABLO1504, BAB40655、AB026225, AB026228 (细菌性叶斑病 菌)；BAD20868 (Pseudomonas f icuserectae) ；AAX52452、AAT96159、AAX52266、AAX52396、 AAT96322、AAT96281、AAX52272、AAX52306、AAX52270、AAX52402、AAX52276、AAX52318、 AAX52262 禾口 AAT9636l(Pseudomonas viridiflava) ；CAJ76697(Pseudomonas avellanae)； YP_001185537(门多萨假单胞菌)；以及ABA47309和BAGM128 (细菌性叶斑病菌)；上述菌 属以全部引用的方式并入本文。另外一组harpin蛋白或多肽包括(但不限于)野油菜黄单胞菌HreX的同源物 (参见Wei等，美国专利第6，960，705号，其全文以引用的方式并入本文)，其包括来自黄 单胞菌属的其它种属的那些菌属。这种同源物的例子包括在以下中确定的那些harpin蛋 白Genbank Accession Nos. NP_636614、YP_001904470、YP_362171 (野油菜黄单胞菌)； ΑΒΒ72197, ΑΒΚ51585, ABU48601, ΑΒΚ51584, ΥΡ_198734 和 ZP_02245223 (水稻黄单胞菌)；以 及ΑΒΚ51588和NP_640771 (柑橘溃疡病菌)；上述菌属以全部引用的方式并入本文。本发明还包括含有上列harpin蛋白或多肽的过敏反应诱导片段的稳定液体制 剂。优选的片段包括两种结构单元长度为12个或更多个氨基酸的稳定α螺旋单元和长 度为12个或更多个氨基酸的亲水酸性单元，该亲水酸性单元可以是β形式、β转角或无 序形式的。优选片段的特征还在于其优选为低于5的酸性pi值。优选的片段含有约观个 到约40个氨基酸，尽管可以存在更少或更多的氨基酸残基。合适片段的例子在以下专利中确认，授予Laby等的美国专利第6，583，107号和 Fan等的PCT公开第WO 01/098501号，上述每项专利均以全文引用的方式并入本文。Fan 等的PCT公开第WO 01/098501号还描述了获得可用于本发明的harpin蛋白或多肽的片段 的方法。合适的HR诱导多肽片段包括(但不限于)下表1中确认的那些。表1 :HR诱导片段列表
权利要求
1.一种制备含harpin蛋白或多肽的稳定液体组合物的方法，所述方法包括获得基本上不含细胞碎屑且包含harpin蛋白或多肽的液体提取物；和向所述液体提取物当中引入杀生剂和任选蛋白酶抑制剂与非离子表面活性剂中的 一个或这两者，从而获得含所述harpin蛋白或多肽的液体组合物，所述液体组合物保持 harpin活性至少约72小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述harpin蛋白或多肽选自梨火疫病欧文氏菌 HrpN的同源物、梨火疫病欧文氏菌HrpW的同源物、丁香假单胞菌HrpW的同源物、丁香假单 胞菌HrpZ的同源物、野油菜黄单胞菌HreX的同源物和包含两个或更多过敏反应诱导域的 融合蛋白中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得包括把发酵的细菌悬浮液加热到温度为约60至100°C ；冷却所述悬浮液；在所述细菌悬浮液中裂解细胞；和从所述悬浮液中除去细胞碎屑。
4.根据权利要求3所述的方法，进一步包括在所述加热之前把所述发酵细菌悬浮液的 pH调节到约5. 5至10的pH。
5.根据权利要求4所述的方法，其中使用磷酸钾缓冲液或Tris-EDTA缓冲液进行所述 调节。
6.根据权利要求3所述的方法，其中用浓度约Ippm至IOOppm的溶菌酶进行所述裂解。
7.根据权利要求1所述的方法，其中以约Ippm至IOOppm的浓度向所述液体提取物当 中引入所述杀生剂。
8.根据权利要求1所述的方法，其中向所述液体提取物当中引入蛋白酶抑制剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中以约Ippm至IOOppm的浓度向所述液体提取物当 中引入所述蛋白酶抑制剂。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂选自抑肽酶、贝他定、钙蛋 白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、胰凝乳蛋白酶抑制剂、E-64、亮肽素、α-2-巨球蛋白、 4- -氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、胃酶抑素、苯甲磺酰氟和甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮。
11.根据权利要求1所述的方法，其中将非离子表面活性剂引入所述液体提取物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中以约0.05%至约10%体积量将所述非离子表面 活性剂引入所述液体提取物。
13.根据权利要求1所述的方法，其中将蛋白酶抑制剂和非离子表面活性剂两者引入 所述液体提取物。
14.由权利要求1所述的方法得到的液体组合物。
15.一种组合物，包含水基载体、harpin蛋白或多肽、有效量的杀生剂和任选有效量的 蛋白酶抑制剂与非离子表面活性剂之一或这两者，由此所述组合物保持harpin活性至少 约72小时。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述harpin蛋白或多肽选自梨火疫病欧文氏 菌HrpN的同源物、梨火疫病欧文氏菌HrpW的同源物、丁香假单胞菌HrpW的同源物、丁香假 单胞菌HrpZ的同源物、野油菜黄单胞菌HreX的同源物和包含两个或更多过敏反应诱导域的融合蛋白中的一种或多种。
17.根据权利要求15所述的组合物，其中所述杀生剂的存在量为约Ippm至lOOppm。
18.根据权利要求15所述的组合物，其形式为溶液、乳液、可乳化的浓缩物、悬浮液、泡 沫、气溶胶、悬乳剂浓缩物、浆体或糊剂。
19.根据权利要求15所述的组合物，还包含有效量的除草剂、杀虫剂、引诱剂、消毒 剂、杀菌剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀真菌剂和/或生长调节剂。
20.根据权利要求15所述的组合物，其中所述组合物在聚合物物质中被微胶囊化。
21.根据权利要求15所述的组合物，其中所述组合物保持至少约50%的活性超过72 小时。
22.根据权利要求15所述的组合物，其中所述组合物保持至少约90%的活性超过3个月。
23.根据权利要求15所述的组合物，包含蛋白酶抑制剂。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述蛋白酶抑制剂的存在量为约Ippm至 IOOppm0
25.根据权利要求23所述的组合物，其中所述蛋白酶抑制剂选自抑肽酶、贝他定、钙蛋 白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、胰凝乳蛋白酶抑制剂、E-64、亮肽素、α _2_巨球蛋白、 4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、胃酶抑素、PMSF和TLCK。
26.根据权利要求15所述的组合物，包含非离子表面活性剂。
27.根据权利要求沈所述的组合物，其中所述非离子表面活性剂的存在体积量为约 0. 05%至约 10%。
28.根据权利要求15所述的组合物，包含蛋白酶抑制剂和非离子表面活性剂两者。
29.一种诱导植物反应的方法，包括对植物、植物种子或果实施加根据权利要求14所 述的组合物，所述施加是在能有效地诱导植物对所述施加做出反应的条件下进行的。
30.根据权利要求四所述的方法，其中所述植物反应是抗病性、植物生长、抗虫性和抗 脱水性中的一种或多种。
31.根据权利要求四所述的方法，其中所述施加是通过喷洒、雾化、形成泡沫、成雾、涂 抹和/或包外层的方式进行的。
32.根据权利要求四所述的方法，其中所述施加是以约0.1至10，000g/ha的harpin 蛋白或多肽的比率对植物进行的。
33.根据权利要求四所述的方法，其中所述施加是对植物种子进行的，对种子的施加 比率为约0. 001至50g/kg的harpin蛋白或多肽。
全文摘要
本发明公开了制备稳定液体组合物的方法，该液体组合物含有harpin蛋白或多肽、水基载体、有效量的杀生剂和任选有效量的蛋白酶抑制剂或非离子表面活性剂之一或这两者。该组合物保持harpin活性至少约72小时。还公开了通过对植物或植物种子施加该组合物而诱导植物反应的方法。
文档编号A01P19/00GK102149283SQ200980131314
公开日2011年8月10日 申请日期2009年8月6日 优先权日2008年8月12日
发明者Z·魏 申请人:植物保健公司