专利名称：一种富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料制备 方法。
背景技术：
高度不饱和脂肪酸(Highly unsaturated fatty acids, HUFAs)在维持机体的正 常机能、促进生长、发育、繁殖和提高成活率等方面发挥重要的生理作用。特别是二十二碳 六火希酸(Docosahexaenoic acid，DHA)、二十碳五火希酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)还會邑 防止动脉粥样化，具有抗血栓、降血脂、防止血小板聚结、舒张血管等功能。由于人和一些动 物不能合成这些必需脂肪酸或合成不能满足其需要，必须从食物中摄取。海水鱼是人类获 取EPA和DHA等HUFAs的最重要来源。但是，随着资源匮乏和捕渔业的衰退，鱼和鱼油的供 应越来越有限，加之迅速发展的水产养殖也需要大量鱼粉用于传统饲料的配制，加剧了这 个供求矛盾。海洋鱼类必需摄入HUFAs，尤其是DHA和EPA。HUFAs的数量和种类会直接影 响海水仔稚鱼的神经发育、生长速度、成活率、应激能力和体内相关成分的组成。由于大多 数海水鱼类缺乏合成HUFAs的关键酶——Δ 6-脂肪酸去饱和酶，只能从鱼粉饲料中摄取。目前研究已表明，Δ6-脂肪酸去饱和酶是合成HUFAs的关键酶，如果缺乏Δ6脂肪 酸去饱和酶或该酶活性受到抑制，就会妨碍EPA和DHA合成。而海水鱼类由于缺乏△ 6-脂 肪酸去饱和酶就不能将亚油酸和α “亚麻酸分别去饱和及延长生成EPA和DHA。做为食物 链基础的海洋微藻是EPA和DHA的最初生产者，动物体内的这些EPA、DHA也是从微藻中转 化而来，随着海洋渔业资源的日益衰减，海洋微藻将成为人类获得这些产物的主要资源。微藻是多不饱和脂肪酸的初级生产者，但不同种属间差异很大譬如三角褐指藻 和微绿球藻，EPA含量很高但生物量很低，不能大规模生产；而象小球藻生物量很大已能大 规模养殖，但DHA或EPA含量很低。通过分子生物学的方法改造微藻，有望解决这一矛盾， 真正使微藻培养生产PUFAs工业化。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料制备 方法。本发明方法的具体步骤为步骤⑴采用PCR扩增获得斑马鱼(Danio rerio) Δ 6_脂肪酸脱饱和酶基因全长 cDNA，具体是根据GENEBANK中已发表的斑马鱼Δ 6_脂肪酸脱饱和酶基因编码序列，设计特异 引物Pl和Ρ2，上游引入EcoRI位点，下游引入XhoI位点。所述的特异引物Pl和Ρ2由上海 生物工程有限公司合成；(Pl :5，-TAGGCTATGGGTGGCGGAGGACAGCAG-3，；Ρ2 :5’ -AACTGCTTATTTGTTGAGATACGCATC-3’ )
以斑马鱼第一链CDNA为模板，用PCR方法(反应体系cDNA模板1 μ 1，10 XPCR缓 冲液 5 μ 1,10mmol/L dNTP 1 μ l，20pmol/L Pl 弓丨物 1μ l，20pmol/LP2 弓丨物 1μ 1，高保真的 Taq Plus DNA聚合酶1 μ 1，重蒸水31 μ 1，反应体系总体积50 μ 1 ；反应条件94°C 1分钟， 550C 1分钟，720C 2分钟，35个循环)扩增出1335bp斑马鱼Δ 6-脂肪酸脱饱和酶基因编 码序列，该序列标记为Dr-FAD6，测序表明该序列与GENEBANK中已发表的编码序列完全 相同。步骤(2)构建表达载体pBI121/DrFAD6，具体是首先制备大肠杆菌感受态细胞，然后纯化PCR产物，PCR产物经双酶切和割胶回收 后与同样经双酶切且含有CaMV35S启动子和npt II选择标志基因的空表达载体pBI 121 载体连接、热击转化、摇菌、抽提表达质粒pBI121/DrFAD6和酶切鉴定。上述的技术均按常 规方法进行。步骤(3)转基因小球藻的筛选和检测。a、小球藻的电击转化，具体是取培养至第3 5d的小球藻培养液，在4000 6000r/min，离心IOmin条件下收 集小球藻细胞；用高渗缓冲液(0. 4mol/L甘露醇，0. 4mol/L山梨醇)处理lh，4000 6000r/ min离心5 lOmin，收集小球藻细胞；加电击缓冲液调细胞数至IO8个/mL，加入终浓度为 6 μ g/mL的质粒DNApBI 12l/DrFAD6与150mL的鲑精DNA混合均勻，冰上放置5 IOmin后 进行电击处理。电击条件脉冲次数为211次，脉冲电压为5kV，循环次数为90次，脉冲持续 时间为 0. 05s ；电击缓冲液0. 4mol/L甘露醇，0. 4mol/L 山梨醇，0. 08mol/L KCl, 0. 005mol/ L CaCl2 和 0.01 mol/L HEPES。b、转基因小球藻的培养筛选，具体是转化后的小球藻采用G418抗性平板筛选法初筛，即将电击转化后的小球藻液直 接涂布于含100 150 μ g/mL G418固体培养基的平板上，置于光照培养箱中培养(温度 25士0. 5°C，光照强度 3. OxlOlx，光暗周期 14h/10h)。C、转基因小球藻的PCR检测，具体是挑取初筛呈阳性的小球藻，转入液体培养基中进行扩增培养(培养温度 25士0. 5°C，转速lOOr/min，光强3. 0 X 101x，持续光照；用离心法收集小球藻细胞，以CTAB 法提取小球藻基因组DNA，并用引物Pl和P2对小球藻基因组DNA进行PCR检测。与对照组 相比较，被检测的样品中出现了 1335bp的条带，则说明Δ 6-脂肪酸脱饱和酶基因已转入小 球藻细胞中。d、转基因小球藻的Southern杂交分析，具体是选取5 10株有代表性的PCR检测为阳性的小球藻藻株，扩大培养并提取总 DNA，，进行Xba I.Sac I双酶切，以Pl和P2为引物扩增的PCR片段杂交；结果显示，5个样 品均出现大小为1. 335kb的杂交带，而作为阴性对照的小球藻样品无任何杂交带，进一步 确认所获得的小球藻藻株已经被成功转入/ Δ 6-脂肪酸脱饱和酶基因。步骤(4)转基因小球藻表达产物的样品测定，包括测定前的预处理和测定过程， 具体是测定前的预处理小球藻经去离子水洗涤三次，50°C烘干、研碎后，加入5% (重量 比)的KOH-CH3OH溶液，70°C反应3h，再加入14% (体积比)BF3-CH3OH, 70°C反应1. 5h，形成脂肪酸甲酯。用氯仿和己烷的混合液(氯仿己烷=1 4)抽提两次，合并提取液。加人 适量无水Na2SO4干燥提取液，静置lh，去掉Na2SO4,用氮气吹干。用少许正己烷回溶，备用。测定过程以Sigma公司生产的GLA甲酯为标准品，正己烷为溶剂测定样品。仪 器岛津 GC-7A，柱子=DEGS 0. 25hamX 25m，分流比100 1，柱温180°C，尾吹:50ml/min， 气化室温度250°C，检测器氢火焰离子化检测器。通过GC-7A对3个小球藻株所含的全部脂肪酸进行色谱分析，结果表明，EPA和 DHA的平均含量占总脂肪酸的40. 5%，比未处理的小球藻高出5倍。步骤(5)将小球藻液脱水、浓缩、干燥后即为富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料。本发明与背景技术相比，具有的有益的效果是1、小球藻是集环保、安全、节能和便于食用为一体的理想的转基因宿主；转基因藻 一般可供人们直接口服，免去了繁杂昂贵的下游产物的提纯工艺，大大降低了生产成本，将 具有很好的社会和经济效益。2、小球藻是自然界少数具有从头合成PUFAs能力的生物，我们选用饵料单胞藻小 球藻为受体，通过基因工程将Δ 6-脂肪酸脱饱和酶基因转入小球藻，筛选获得高含量EPA 和DHA的藻株，使藻体DHA或EPA成分增加，实现小球藻的高效产出和产品的高值化。
具体实施例方式步骤(1)采用PCR扩增获得斑马鱼(Danio rerio) Δ 6_脂肪酸脱饱和酶基因全长 cDNA，具体是根据GENEBANK中已发表的斑马鱼Δ 6_脂肪酸脱饱和酶基因编码序列，设计特异 引物Pl和Ρ2，上游引入EcoRI位点，下游引入XhoI位点。所述的特异引物Pl和Ρ2由上海 生物工程有限公司合成；(Pl :5，-TAGGCTATGGGTGGCGGAGGACAGCAG-3，；Ρ2 :5’ -AACTGCTTATTTGTTGAGATACGCATC-3’ )以斑马鱼第一链cDNA为模板，用PCR方法(反应体系cDNA模板1 μ 1，10 XPCR缓 冲液 5 μ 1,10mmol/L dNTP 1 μ l，20pmol/L Pl 弓丨物 1μ l，20pmol/LP2 弓丨物 1μ 1，高保真的 Taq Plus DNA聚合酶1 μ 1，重蒸水31 μ 1，反应体系总体积50 μ 1 ；反应条件94°C 1分钟， 550C 1分钟，720C 2分钟，35个循环)扩增出1335bp斑马鱼Δ 6-脂肪酸脱饱和酶基因编 码序列，该序列标记为Dr-FAD6，测序表明该序列与GENEBANK中已发表的编码序列完全 相同。步骤⑵构建表达载体pBI121/DrFAD6，具体是首先制备大肠杆菌感受态细胞，然后纯化PCR产物，PCR产物经双酶切和割胶回收 后与同样经双酶切且含有CaMV35S启动子和npt II选择标志基因的空表达载体pBI 121 载体连接、热击转化、摇菌、抽提表达质粒pBI121/DrFAD6和酶切鉴定。上述的技术均按常 规方法进行。步骤(3)转基因小球藻的筛选和检测。a、小球藻的电击转化，具体是取培养至第3 5d的小球藻培养液，在4000 6000r/min，离心5 IOmin条件 下收集小球藻细胞.用高渗缓冲液(0. 4mol/L甘露醇，0. 4mol/L山梨醇)处理lh，4000 6000r/min离心5 lOmin，收集小球藻细胞；加电击缓冲液调细胞数至IO8个/mL，加入终 浓度为6 μ g/mL的质粒DNApBI 12l/DrFAD6与150mL的鲑精DNA混合均勻，冰上放置5 IOmin后进行电击处理。电击条件脉冲次数为211次，脉冲电压为5kV，循环次数为90次， 脉冲持续时间为0. 05s ；电击缓冲液0. 4mol/L甘露醇，0. 4mol/L山梨醇，0. 08mol/L KCl, 0. 005mol/L CaCl2 和 0. Olmol/L HEPES0b、转基因小球藻的培养筛选，具体是转化后的小球藻采用G418抗性平板筛选法初筛，即将电击转化后的小球藻液直 接涂布于含100 150 μ g/mL G418固体培养基的平板上，置于光照培养箱中培养(温度 25士0. 5°C，光照强度 3. OxlOlx，光暗周期 14h/10h)。C、转基因小球藻的PCR检测，具体是挑取初筛呈阳性的小球藻，转入液体培养基中进行扩增培养(培养温度 25士0. 5°C，转速lOOr/min，光强强度3. OX ΙΟΙχ，持续光照；用离心法收集小球藻细胞，以 CTAB法提取小球藻基因组DNA，并用引物Pl和P2对小球藻基因组DNA进行PCR检测。与 对照组相比较，被检测的样品中出现了 1335bp的条带，则说明Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因已 转入小球藻细胞中。d、转基因小球藻的Southern杂交分析，具体是选取5 10株有代表性的PCR检测为阳性的小球藻藻株，扩大培养并提取总 DNA，，进行Xba I.Sac I双酶切，以Pl和P2为引物扩增的PCR片段杂交；结果显示，5个样 品均出现大小为1. 335kb的杂交带，而作为阴性对照的小球藻样品无任何杂交带，进一步 确认所获得的小球藻藻株已经被成功转入Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因。步骤(4)转基因小球藻表达产物的样品测定，包括测定前的预处理和测定过程， 具体是测定前的预处理小球藻经去离子水洗涤三次，50°C烘干、研碎后，加入5% (重量 比)的KOH-CH3OH溶液，70°C反应3h，再加入14% (体积比)BF3-CH3OH, 70°C反应1. 5h，形成 脂肪酸甲酯。用氯仿和己烷的混合液(氯仿己烷=1 4)抽提两次，合并提取液。加人 适量无水Na2SO4干燥提取液，静置lh，去掉Na2SO4,用氮气吹干。用少许正己烷回溶，备用。测定过程以Sigma公司生产的GLA甲酯为标准品，正己烷为溶剂测定样品。仪 器岛津 GC-7A，柱子=DEGS 0. 25hamX 25m，分流比100 1，柱温180°C，尾吹:50ml/min， 气化室温度250°C，检测器氢火焰离子化检测器。通过GC-7A对3个小球藻株所含的全部脂肪酸进行色谱分析，结果表明，EPA和 DHA的平均含量占总脂肪酸的40. 5%，比未处理的小球藻高出5倍。步骤(5)将小球藻液脱水、浓缩、干燥后即为富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料。
权利要求
一种富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤步骤(1)采用PCR扩增获得斑马鱼Δ6 脂肪酸脱饱和酶基因全长cDNA；步骤(2)构建表达载体pBI121/DrFAD6，具体是首先制备大肠杆菌感受态细胞，然后纯化PCR产物；PCR产物经双酶切和割胶回收后与同样经双酶切且含有CaMV35S启动子和npt II选择标志基因的空表达载体pBI121载体连接、热击转化、摇菌、抽提表达质粒pBI121/DrFAD6和酶切鉴定；步骤(3)转基因小球藻的筛选和检测；首先电击转化小球藻，其次培养筛选转基因小球藻，然后进行转基因小球藻的PCR检测，最后进行转基因小球藻的Southern杂交分析；步骤(4)将小球藻液脱水、浓缩、干燥后即为富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的小球藻的电击转化为取培养 至第3 5天的小球藻培养液，在4000 6000r/min，离心5 IOmin条件下收集小球藻细 胞；用高渗缓冲液处理lh，4000 6000r/min离心5 lOmin，收集小球藻细胞；加电击缓 冲液调细胞数至IO8个/mL，加入终浓度为6 μ g/mL的质粒DNA pBI 121/DrFAD6与150mL 的鲑精DNA混合均勻，冰上放置5 IOmin后进行电击处理；所述的电击缓冲液由0. 4mol/L甘露醇，0. 4mol/L山梨醇，0. 08mol/L KCl,0. 005mol/L CaCl2 和 0. 01mol/L HEPES 组成；所述的电击条件为脉冲次数为211次，脉冲电压为5kV，电击循环次数为90次，脉冲持 续时间为0. 05s ；所述的高渗缓冲液由0. 4mol/L甘露醇和0. 4mol/L山梨醇组成。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的转基因小球藻的培养筛选为 转化后的小球藻采用G418抗性平板筛选法初筛，即将电击转化后的小球藻液直接涂布于 含100 150 μ g/mL G418固体培养基的平板上，置于光照培养箱中培养。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的转基因小球藻的PCR检测为 挑取初筛呈阳性的小球藻，转入液体培养基中进行扩增培养；用离心法收集小球藻细胞，以 CTAB法提取小球藻基因组DNA，并用引物Pl和P2对小球藻基因组DNA进行PCR检测。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的转基因小球藻的Southern 杂交分析为选取5 10株有代表性的PCR检测为阳性的小球藻藻株，扩大培养并提取总 DNA，，进行Xba I.Sac I双酶切，以Pl和P2为引物扩增的PCR片段杂交。
全文摘要
本发明涉及一种富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料制备方法。本发明步骤首先采用PCR扩增获得斑马鱼Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因全长cDNA；然后构建表达载体pBI121/DrFAD6，具体是制备大肠杆菌感受态细胞，纯化PCR产物；载体连接、热击转化、摇菌、抽提表达质粒pBI121/DrFAD6和酶切鉴定；再次转基因小球藻的筛选和检测；最后将小球藻液脱水、浓缩、干燥后即为富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料。本发明降低了生产成本，使得产品的附加值得以实现。
文档编号A23K1/14GK101889630SQ20101021006
公开日2010年11月24日 申请日期2010年6月28日 优先权日2010年6月28日
发明者王首锋 申请人:浙江大学