专利名称：利用巴西橡胶树胚性细胞悬浮系建立高效植株再生体系的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用巴西橡胶树胚性细胞悬浮系建立高效植株再生体系的方法， 属于植物组织和细胞工程领域。
背景技术：
巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell. Arg)是大戟科橡胶树属的一种多年生异花授粉乔木，作为天然橡胶的主要来源，在热带地区广泛种植，并在世界经济发展中一直占有重要的地位。巴西橡胶树的品种选育主要是依靠常规育种，但育种周期长加上用于常规育种的材料均来源于魏克汉系统的品系及其衍生的无性系，遗传基础狭窄。为了拓宽巴西橡胶树育种途径，改良其品质，不少国家投入大量的人力物力财力进行广泛的研究并取得了一定的进展。目前，巴西橡胶树组织培养中仍存在很多困难，其主要的有外植体取材受橡胶树花期和果期等客观条件的限制；脱分化愈伤组织易褐化死亡，难以长期继代保存；出胚率较低，因而植株再生率极低；生产成本过高，无法满足生产中对组培苗的大量需求和建立高效遗传转化体系的需要。为此，人们希望通过建立巴西橡胶树胚性细胞悬浮系，并建立高效植株再生体系来满足生产和实验的需要。然而，由于多种因素的限制，利用巴西橡胶树胚性细胞悬浮系建立高效植株再生体系仍面临诸多困难，如何解决这些困难，最终建立起稳定、高效的再生体系成为目前最迫切的任务。为此，本发明在巴西橡胶树胚性细胞悬浮系的基础上，通过对相关技术进行研究，最终建立了巴西橡胶树高效植株再生体系，为巴西橡胶树自根幼态无性系大规模推广和进一步建立巴西橡胶树高效遗传转化体系提供重要基础。
发明内容
本发明目的是提供一种生产成本低、胚状体诱导率高、植株再生率高的利用巴西橡胶树胚性细胞悬浮系建立高效植株再生体系的方法。本发明提供的利用巴西橡胶树胚性细胞悬浮系建立高效植株再生体系的方法，该方法包括如下步骤a、胚性悬浮细胞诱导易碎胚性愈伤组织用移液枪将巴西橡胶树胚性细胞悬浮系中的培养液吸干，选取小细胞团接种到胚性细胞悬浮系诱导易碎胚性愈伤组织的培养基上，暗培养15 30天，培养温度在25°C 之间，所述诱导易碎胚性愈伤组织的培养基为MS培养基和附加成份，MS培养基中的的含量为磷酸二氢钾400 550mg/L、无水氯化钙 200 450mg/L、四水硫酸锰20 45mg/L和七水硫酸镁450 650mg/L，附加成分为2，4-D 0. 5 3. 0mg/L、6-BA 0. 1 2. 0mg/L、NAA 0. 5 3. Omg/L、Phytagel 2 3g/L、蔗糖 50 90g/L和椰子水30 80ml/L ；b、易碎胚性愈伤组织继代将易碎胚性愈伤组织转入诱导易碎胚性愈伤组织的培养基上继代培养，15 30天继代一次，暗培养，培养温度在25°C 之间；C、体细胞胚状体的分化将易碎胚性愈伤组织接种于分化培养基，暗培养20 50天，以促进体细胞胚状体的分化、成熟，培养温度在25°C 之间，所述分化培养基为 MS培养基和附加成份，MS培养基中的含量调整为磷酸二氢钾400 550mg/L、无水氯化钙 200 450mg/L、四水硫酸锰20 45mg/L和七水硫酸镁450 650mg/L，附加成份为6-BA
0.5 3. Omg/L、KT 0. 5 3. Omg/L、NAA 0. 01 1. Omg/L、GA3 0. 01 1. Omg/L、Phytagel 2 3g/L、蔗糖50 90g/L、活性碳1 2g/L和椰子水30 80ml/L ；d、植株再生将成熟胚状体接种到出苗培养基，光照培养，以促其再生出完整植株，培养温度在25°c 30°C之间，所述出苗培养基的有效成分为MS培养基和附加成份，MS 培养基中的含量调整为磷酸二氢钾400 550mg/L、无水氯化钙200 450mg/L、四水硫酸锰20 45mg/L和七水硫酸镁450 650mg/L,附加成分为KT 0. 5 3. 0mg/L、NAA0. 01
1.Omg/L、GA3 0. 1 3. 0mg/L、Phytagel 2 3g/L、蔗糖 50 90g/L、活性碳 1 2g/L 和椰子水30 80ml/L。步骤a的巴西橡胶树胚性细胞悬浮系可采用常规技术制备，也可采用下述方法获得a、外植体的准备选取巴西橡胶树单核靠边期的花蕾作为外植体，进行消毒；b、胚性愈伤组织诱导剥出消毒好的花蕾中的雄蕊接种到胚性愈伤组织诱导培养基中，暗培养30 50天，培养温度在 30°C之间；所述胚性愈伤组织诱导培养基为MS 培养基和附加成份，MS培养基中的含量为磷酸二氢钾400 550mg/L、无水氯化钙200 450mg/L、四水硫酸锰20 45mg/L和七水硫酸镁450 650mg/L，附加成分为2，4-D 0. 5 3. 0mg/L,KT 0. 5 3. 0mg/L,NAA 0. 5 3. 0mg/L,Phytagel 2 3g/L、蔗糖 50 90g/L 和椰子水30 80ml/L ；C、胚性愈伤组织的继代将胚性愈伤组织转入新鲜的胚性愈伤组织诱导培养基继代培养3 5次，7 10天继代一次，暗培养，培养温度在25°C 之间；d、胚性愈伤组织悬浮培养将继代后状态良好的胚性愈伤组织破碎成0. 1 0. 5cm颗粒，取2 5g胚性愈伤组织颗粒接种到含20 50mL悬浮培养液的三角瓶中，置于 80 120r/分钟的摇床上，暗培养，培养温度在25°C 之间，7 9天继代一次，每次换培养液时将1 2g新形成的分散的小细胞团转入新的三角瓶中培养，继代4 6次后， 即获得巴西橡胶树胚性细胞悬浮系；所述悬浮培养液为MS培养基和附加成份，MS培养基中的含量为磷酸二氢钾400 550mg/L、无水氯化钙200 450mg/L、四水硫酸锰20 45mg/L 和七水硫酸镁 450 650mg/L,附加成分为 2，4-D 0. 5 3. 0mg/L、KT 0. 5 3. 0mg/L、NAA 0. 5 3. 0mg/L、蔗糖30 60g/L和椰子水30 80ml/L ；上述在步骤a中，先用75 80%酒精表面消毒30 60秒，再用lg/L HgCl消毒 10 15分钟，最后用无菌水冲洗3 6次，每次3 5分钟。本发明的有益效果在于本发明为橡胶树单倍体育种、多倍体育种，充分利用杂种优势，培育产量高、抗性强而生长快的优良品种，并为研究各种经济性状的遗传规律提供了优良材料。可以获得自根幼态无性系，排除不良砧木的影响，提高产量；可以获得抗寒性强而一致的优良砧木，减少寒害；也可获得均一的材料，供科研使用，并为巴西橡胶树的良种繁育提供一条值得考虑的途径。本发明工艺流程简单，生产成本低，胚状体诱导率高，植株再生率高，具有很大的应用价值。
具体实施例方式实施例一胚性悬浮细胞诱导易碎胚性愈伤组织用移液枪将将巴西橡胶树胚性细胞悬浮系中的培养液吸干，选取小细胞团接种到胚性细胞悬浮系诱导易碎胚性愈伤组织的培养基上，暗培养20天，培养温度为^°C。诱导易碎胚性愈伤组织的培养基为MS培养基和附加成份，MS培养基的的含量为七水硫酸镁500mg/L、磷酸二氢钾400mg/L、无水氯化钙250mg/ L 和四水硫酸锰 35mg/L(下同)，附加成分为 2,4-D 1. 5mg/L、6_BA 0. 5mg/L、NAA 1. Omg/L、 Phytagel 2. Og/L、蔗糖 70g/L 和椰子水 50ml/L。易碎胚性愈伤组织继代将易碎胚性愈伤组织转入诱导易碎胚性愈伤组织的培养基上继代培养，20天继代一次，暗培养，培养温度为。体细胞胚状体的分化将愈伤组织接种于分化培养基暗培养40天，以促进体细胞胚状体的分化、成熟，培养温度为28V。40天后，易碎胚性愈伤组织分化出长势旺盛的胚状体(其中大部分为子叶形胚，少部分为畸形胚)，一小团易碎胚性愈伤组织可分化出数十个胚状体。分化培养基为MS培养基和附加成份，附加成份为6-BA 0.5mg/L、KT 3. Omg/L、 NAAO. 02mg/L、GA3 0. 5mg/L、Phytagel 2. Og/L、蔗糖 70g/L、活性碳 1. Og/L 和椰子水 50ml/ L0植株再生将成熟的子叶形胚接种到出苗培养基，每天光照16小时，以促其再生出完整植株，培养温度为30°C。培养10天后，叶形胚开始抽芽，20天后，长成完整健壮的小植株。出苗培养基的有效成分为MS培养基和附加成份，附加成份为KT 1.5mg/L、IAA
0.02mg/L、GA3 2. 0mg/L、Phytagel 2. 0g/L、蔗糖 50g/L、活性碳 1. Og/L 和椰子水 50ml/L。上述中的巴西橡胶树胚性细胞悬浮系是利用传统方法制备的。实施例二 外植体的准备选取热研7-33-97单核靠边期的花蕾作为外植体，用75%酒精表面消毒60秒，再用lg/L HgCl2消毒10分钟，最后用无菌水冲洗3次，每次5分钟。胚性愈伤组织诱导剥出消毒好的花蕾中的雄蕊接种到胚性愈伤组织诱导培养基上于暗培养40天。所述胚性愈伤组织诱导培养基的有效成份为改良的MS培养基和附加成份，MS培养基修改的成份为七水硫酸镁500mg/L，磷酸二氢钾400mg/L，无水氯化钙 250mg/L，四水硫酸锰35mg/L(以下步骤同)，附加成份为2,4-D 2. 0mg/L、KTl. 0mg/L、NAA
1.0mg/L、Phytagel 2. 0g/L、蔗糖 70g/L 和椰子水 50ml/L。胚性愈伤组织的继代将诱导的胚性愈伤组织转入新鲜的胚性愈伤组织诱导培养基继代培养4次，7天继代一次。胚性愈伤组织悬浮培养将继代后状态良好的胚性愈伤组织破碎成0. 3cm颗粒， 取3g胚性愈伤组织颗粒接种到含20mL悬浮培养液的三角瓶中，置于IOOr/分钟的摇床上， 暗培养，培养温度为。7天继代一次，每次换培养液时将2g新形成的分散的小细胞团转入新的三角瓶中培养。继代5次后，即获得胚性细胞悬浮系。所述悬浮培养液为改良的MS培养基和附加成份，附加成份为2,4-D 2. Omg/L、KT 1. Omg/L、NAA 1. Omg/L、蔗糖40g/L
和椰子水50ml/L。 其余与实施例一相同。
权利要求
1.一种利用巴西橡胶树胚性细胞悬浮系建立高效植株再生体系的方法，其特征在于， 它包括如下步骤a、胚性悬浮细胞诱导易碎胚性愈伤组织用移液枪将巴西橡胶树胚性细胞悬浮系中的培养液吸干，选取小细胞团接种到胚性细胞悬浮系诱导易碎胚性愈伤组织的培养基上，暗培养15 30天，培养温度在25°C 之间，所述诱导易碎胚性愈伤组织的培养基为MS 培养基和附加成份，MS培养基中的的含量为磷酸二氢钾400 550mg/L、无水氯化钙200 450mg/L、四水硫酸锰20 45mg/L和七水硫酸镁450 650mg/L，附加成分为2，4-D 0. 5 3. 0mg/L、6-BA 0. 1 2. 0mg/L、NAA 0. 5 3. Omg/L,Phytagel 2 3g/L、蔗糖 50 90g/L 和椰子水30 80ml/L ；b、易碎胚性愈伤组织继代将易碎胚性愈伤组织转入诱导易碎胚性愈伤组织的培养基上继代培养，15 30天继代一次，暗培养，培养温度在25°C 之间；c、体细胞胚状体的分化将易碎胚性愈伤组织接种于分化培养基，暗培养20 50天， 以促进体细胞胚状体的分化、成熟，培养温度在25°C 之间，所述分化培养基为MS培养基和附加成份，MS培养基中的含量调整为磷酸二氢钾400 550mg/L、无水氯化钙200 450mg/L、四水硫酸锰20 45mg/L和七水硫酸镁450 650mg/L，附加成份为6-BA 0. 5 3. Omg/L、KT 0. 5 3. Omg/L、NAA 0. 01 1. Omg/L、GA3 0. 01 1. Omg/L、Phytagel 2 3g/L、蔗糖50 90g/L、活性碳1 2g/L和椰子水30 80ml/L ；d、植株再生将成熟胚状体接种到出苗培养基，光照培养，以促其再生出完整植株，培养温度在25°C 30°C之间，所述出苗培养基的有效成分为MS培养基和附加成份，MS培养基中的含量调整为磷酸二氢钾400 550mg/L、无水氯化钙200 450mg/L、四水硫酸锰20 45mg/L 和七水硫酸镁 450 650mg/L,附加成分为 KT 0. 5 3. 0mg/L、ΝΑΑ0. 01 1. Omg/ L、GA3 0. 1 3. 0mg/L、Phytagel 2 3g/L、蔗糖 50 90g/L、活性碳 1 2g/L 和椰子水 30 80ml/L。
2.根据权利要求1所述的利用巴西橡胶树胚性细胞悬浮系建立高效植株再生体系的方法，其特征在于，步骤a的巴西橡胶树胚性细胞悬浮系采用下述方法获得a、外植体的准备选取巴西橡胶树单核靠边期的花蕾作为外植体，进行消毒；b、胚性愈伤组织诱导剥出消毒好的花蕾中的雄蕊接种到胚性愈伤组织诱导培养基中，暗培养30 50天，培养温度在 30°C之间；所述胚性愈伤组织诱导培养基为MS 培养基和附加成份，MS培养基中的含量为磷酸二氢钾400 550mg/L、无水氯化钙200 450mg/L、四水硫酸锰20 45mg/L和七水硫酸镁450 650mg/L，附加成分为2，4-D 0. 5 3. 0mg/L,KT 0. 5 3. 0mg/L,NAA 0. 5 3. 0mg/L,Phytagel 2 3g/L、蔗糖 50 90g/L 和椰子水30 80ml/L ；c、胚性愈伤组织的继代将胚性愈伤组织转入新鲜的胚性愈伤组织诱导培养基继代培养3 5次，7 10天继代一次，暗培养，培养温度在25°C 之间；d、胚性愈伤组织悬浮培养将继代后状态良好的胚性愈伤组织破碎成0.1 0. 5cm颗粒，取2 5g胚性愈伤组织颗粒接种到含20 50mL悬浮培养液的三角瓶中，置于80 120r/分钟的摇床上，暗培养，培养温度在25°C 之间，7 9天继代一次，每次换培养液时将1 2g新形成的分散的小细胞团转入新的三角瓶中培养，继代4 6次后，即获得巴西橡胶树胚性细胞悬浮系；所述悬浮培养液为MS培养基和附加成份，MS培养基中的含量为磷酸二氢钾400 550mg/L、无水氯化钙200 450mg/L、四水硫酸锰20 45mg/L和七水硫酸镁 450 650mg/L,附加成分为 2，4_D 0. 5 3. 0mg/L、KT 0. 5 3. 0mg/L、NAA 0. 5 3. Omg/L、蔗糖30 60g/L和椰子水30 80ml/L ；
3.根据权利要求2所述的利用巴西橡胶树胚性细胞悬浮系高效植株再生体系的方法， 其特征在于，在步骤a中，先用75 80%酒精表面消毒30 60秒，再用lg/L HgC12消毒 10 15分钟，最后用无菌水冲洗3 6次，每次3 5分钟。
全文摘要
一种利用巴西橡胶树胚性细胞悬浮系建立高效植株再生体系的方法，它包括胚性悬浮细胞诱导易碎胚性愈伤组织、易碎胚性愈伤组织继代、体细胞胚状体的分化和植株再生等步骤。本发明工艺流程简单，生产成本低，胚状体诱导率高，植株再生率高，具有很大的应用价值。
文档编号A01H4/00GK102187812SQ201110071799
公开日2011年9月21日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者倪燕妹, 叶青, 张全琪, 张能, 彭远明, 李孝云, 王力前, 黄志 , 黄春华 申请人:广东农垦热带作物科学研究所