专利名称：一种小麦成熟胚培养及再生的方法
技术领域：
本发明涉及一种适合小麦成熟胚愈伤组织诱导及再生的方法。
背景技术：
小麦组织培养为小麦无性系变异、胚挽救、外源基因的转化等工作提供了必要的基础，而高频再生则是小麦组织培养的关键。目前小麦组织培养获得成功的外植体有根、幼穗、幼胚、花药、成熟胚等。在这之中，幼胚培养的再生效率最高，而成熟胚培养再生最为困难。然而，幼胚的取材受季节、时间以及单株之间不同生理状态的限制极大，在自然条件下无法全年持续供应，利用温室栽培技术进行整年持续种植则对条件要求严格且耗资巨大。成熟胚作为外植体源具有易储藏、 取材方便、一次收获可大量持续稳定供应等特点，且具有成本低、个体间生理状态一致、方便实用等诸多优点，因此成为目前研究者进行突破的热点。小麦成熟胚培养及再生的体系主要受基因型限制极大，不同的体系对不同的基因型培养效果差异较大。植物愈伤组织的分化是依赖于细胞分裂素和生长素的比值，该比值高则利于芽的分化，该比值低则利于根的分化。通常小麦成熟胚愈伤组织分化率的平均水
23%0zgenM，Turet Μ, Altinok S et al. Efficient callus induction and plant regeneration from mature embryo culture of winter wheat (Triticum aestivum L.) genotypes. Plant Cell R印，1998，18 (3 4) :P. 331 335，如何提高小麦成熟胚愈伤组织分化效率一直是人们关注的焦点。小麦成熟胚培养及再生离不开诱导培养基和再生培养基。小麦成熟胚愈伤组织分化率取决于再生培养基，而再生培养基一般是以MS基本培养基为基础，添加适量的激素， 所述的激素一般包括细胞分裂素(如ZT，KT等)和生长素(如2，4-D，IAA, NAA等)，据报道，现有的再生培养基中，细胞分裂素的添加量一般为0. 1 ang/L，生长素的添加量一般为0. 1 lmg/L。例如激素浓度配比中采用ZT比IAA为2. 0mg/L比0. 5mg/L陈俊男， 高润红，邓志英，田纪春.小麦成熟胚组织培养体系优化及优良转化受体基因型的筛选.山东农业科学.2010，11 :P. 1-5、或采用KT比2，4-D为0. lmg/L比0. 5mg/L毕瑞明，王洪刚.小麦成熟胚的组织培养.中国农学通报.2007，23卷，2期P. 53-57或采用1. 0 1. 5mg/L比0. 2 0. 5mg/L刘香利，刘缙，郭蔼光，赵惠贤.小麦不同外植体离体培养与再生研究.麦类作物学报.2008, ) :P. 568-572;刘芳、周翠红、李丽雅，侯文卓，王强，郭蔼光，刘香利.不同遗传背景小麦成熟胚再生体系的初步研究.麦类作物学报.2010，30(1) P. 39-42、或采用KT比NAA为0. 6mg/L比0. 4mg/L曹新有，李春莲，余玲，任慧莉，陈耀锋.小麦成熟胚愈伤组织诱导及分化研究.西北植物学报.2006，沈(11) :P. 2276-2观0 ；李根英，黄承彦，隋新霞，何中虎，孙其信，夏先春.小麦不同外植体的组织培养效果研究.麦类作物学报.2006，洸(1) :P. 21-25，也有人提出单独使用ΚΤ0. 5 2. 0mg/L贵梦园，魏琦超，何男男，欧行奇，赵俊杰，张胜利，周岩.不同基因型小麦成熟胚愈伤组织的诱导与分化.湖北农业科学.2009 (9)，48 (9) :P. 2049-2051 等。
在本领域，有人认为再生培养基中如果KT浓度过高易导致愈伤组织褐化死亡曹新有，李春莲，余玲，任慧莉，陈耀锋.小麦成熟胚愈伤组织诱导及分化研究.西北植物学报.2006，沈(11) :P. 2276-2280，因此较少有人在分化过程中使用超常规高浓度KT唐宗祥，张怀琼，张怀渝，晏本菊，任正隆.2，4-D、KT对小麦成熟胚愈伤组织形成、分化的影响.四川农业大学学报.2004，22卷，3期P. 203-205。
发明内容
本发明的目的在于，针对目前小麦成熟胚愈伤组织分化率的平均水平较低的实际问题，提供一种新的小麦成熟胚培养及再生的方法。本发明的目的是这样实现的一种小麦成熟胚培养及再生的方法，其特征在于，再生培养基以MS基本培养基为基础，添加麦芽糖，MES, KT, NAA，再生培养基中麦芽糖的浓度为 40g/L, MES 浓度为 1. 95g/L，KT 为 5mg/L, NAA 为 0. lmg/L, pH = 5. 8 ；小麦成熟胚培养及再生的具体方法为a)挑选成熟饱满的小麦种子，用70%酒精浸泡5min，0. 1% HgCl2灭菌20min，至少用无菌水冲洗4次后，再用无菌水中浸泡19 Mh，获得种子的成熟胚；b)将种子的成熟胚去掉胚芽胚根后纵切，接入诱导培养基中，23 25°C暗培养， 10 14天继代一次，共诱导培养20 观天，获得小麦成熟胚愈伤组织；c)将小麦成熟胚愈伤组织转入上述配制好的再生培养基中，23 25°C光照培养， 25 30天，诱导小麦成熟胚愈伤组织分化，形成再生植株苗。在本发明中，所述的诱导培养基使用MS基本培养基的大量元素、微量元素和铁盐，与B5基本培养基的维生素成分进行复合，再添加麦芽糖，MgCl2,水解酪蛋白，谷氨酰胺， MES，其中，麦芽糖的浓度为40g/L，MgCl2的浓度为0. 75g/L，水解酪蛋白的浓度为500mg/L， 谷氨酰胺浓度为300mg/L，所述培养基中MES浓度为1. 95g/L，pH = 5. 8。在本发明中，所述的23 25°C光照培养是指在培育期期内，以环境温度23 25°C，光照和黑暗每1 相间交替，光照强度20001UX。在本发明中，小麦成熟胚愈伤组织诱导率至少为98%，小麦成熟胚愈伤组织分化率为23 50%。在本发明中，将分化出的再生植株苗接入1/2MS培养基中，按照传统方法进行壮
苗培养。本发明的优点在于，由于再生培养基中采用细胞分裂素KT和生长素NAA并克服传统观念，提高了细胞分裂素KT的浓度，以及细胞分裂素KT与生长素NAA的比值，较大幅度的提高了小麦成熟胚愈伤组织分化率；同时KT价格较低，与ZT相比，可以降低培养基的成本；由于诱导培养基和再生培养基中的碳源均为麦芽糖，与砂糖或蔗糖相比，可以始终保持较高的渗透压，提高小麦成熟胚愈伤组织的分化率。
具体实施例方式实施例11)诱导培养基诱导培养基为含有MS基本培养基的大量元素、微量元素、铁盐，以及B5基本培养基的维生素，添加麦芽糖40g/L、氯化镁0. 75g/L、水解酪蛋白500mg/L、谷氨酰胺300mg/L、 MES 1. 95g/L的固体培养基，pH = 5. 8。配制后用121°C高压湿热灭菌20min。2)再生培养基(简称KT 5. ONAA 0. 1再生培养基)再生培养基为含有MS基本培养基、麦芽糖40g/L、MES 1. 95g/L、KT 5mg/L、NAA 0. lmg/L的固体培养基，pH = 5. 8。配制后用121°C高压湿热灭菌20min。3)对照用再生培养基(简称KT 5. 0再生培养基)对照用再生培养基为含有MS基本培养基、麦芽糖40g/L、MES 1. 95g/L、KT5mg/L, pH = 5. 8。配制后用121°C高压湿热灭菌20min。实施例2小麦品种“花培1号”。挑选成熟饱满的“花培1号”小麦种子，用70%酒精浸泡5min，0. 1 % HgCl2灭菌 20min，无菌水冲洗4次后，无菌水中浸泡19h，获得种子的成熟胚。将小麦种子成熟胚去掉胚芽胚根后纵切接入上述配制好的诱导培养基(实施例1 提供，下同)中，23°C暗培养，10天继代一次，共诱导培养20天，获得小麦愈伤组织。将小麦愈伤组织分别转入KT 5. 0 NAA 0. 1再生培养基和KT 5. 0再生培养基(均由实施例1提供，下同)，诱导再生苗的分化。培养期为30天，在培养期内，以环境温度23 25°C，光照和黑暗每1 相间交替，光照强度20001UX，小麦成熟胚愈伤组织分化为再生植株苗。花培1号的愈伤组织诱导率为100%，采用KT 5. 0 NAA 0. 1再生培养基的小麦成熟胚愈伤组织分化率平均为47. 8士 1. 6% ；采用KT 5. 0再生培养基的小麦成熟胚愈伤组织分化率平均为15士3. 5%，前者是后者的3倍。经过方差分析，每个品种在两种不同激素配比的培养基上的分化率在P = 0. 05水平上差异显著。实施例3小麦品种“宁麦13”挑选成熟饱满的“宁麦13”小麦种子，用70%酒精浸泡5min,0. 1% HgCl2灭菌 20min，无菌水冲洗5次后，无菌水中浸泡Mh，获得种子的成熟胚。将小麦种子成熟胚去掉胚芽胚根后纵切接入上述配制好的诱导培养基中，25°C暗培养，14天继代一次，共诱导培养观天，获得小麦愈伤组织。将小麦愈伤组织分别转入KT 5. 0 NAA 0. 1再生培养基和KT 5. 0再生培养基，诱导再生苗的分化。培养期为洲天，在培养期内，以环境温度23 25°C，光照和黑暗每1 相间交替诱导，光照强度20001UX，小麦成熟胚愈伤组织分化为再生植株苗。宁麦13的愈伤组织诱导率为100%，采用KT 5. 0 NAA 0. 1再生培养基的小麦成熟胚愈伤组织分化率平均为23. 3士3. 8% ；采用KT 5. 0再生培养基的小麦成熟胚愈伤组织分化率平均为7. 5士 1. 6%，前者是后者的3倍。经过方差分析，每个品种在两种不同激素配比的培养基上的分化率在P = 0. 05水平上差异显著。实施例4小麦品种“扬麦158”挑选成熟饱满的“扬麦158”小麦种子，用70%酒精浸泡5min，0. 1% HgCl2灭菌 20min，无菌水冲洗5次后，无菌水中浸泡22h，获得种子的成熟胚。将小麦种子成熟胚去掉胚芽胚根后纵切接入上述配制好的诱导培养基中，25°C暗培养，12天继代一次，共诱导培养M天，获得小麦愈伤组织。将小麦愈伤组织分别转入KT 5. 0 NAA 0. 1再生培养基和KT 5. 0再生培养基，诱导再生苗的分化。培养期为洲天，在培养期内，以环境温度23 25°C，光照和黑暗每1 相间交替，光照强度20001UX，小麦成熟胚愈伤组织分化为再生植株苗。扬麦158的愈伤组织诱导率平均为100%，采用KT 5. 0 NAA 0. 1再生培养基的小麦成熟胚愈伤组织分化率平均为25. 0士2. 9% ；采用KT 5. 0再生培养基的小麦成熟胚愈伤组织分化率平均为8. 3士2. 9%，前者是后者的3倍。经过方差分析，每个品种在两种不同激素配比的培养基上的分化率在P = 0. 05水
平上差异显著。以上各实施例不是对本发明的限制，具体实施时，对小麦成熟胚进行诱导愈伤组织培养时，可以采用传统的诱导培养基，对各实施例中获得的再生植株苗还应该接入1/2MS 培养基中，按照传统方法进行壮苗培养。
权利要求
1.一种小麦成熟胚培养及再生的方法，其特征在于，再生培养基以MS基本培养基为基础，添加麦芽糖，MES, KT, NAA，再生培养基中麦芽糖的浓度为40g/L，MES浓度为1. 95g/L， KT为5mg/L，NAA为0. lmg/L, pH = 5. 8 ；小麦成熟胚培养及再生的具体方法为a)挑选成熟饱满的小麦种子，用70%酒精浸泡5min，0.1 % HgCl2灭菌20min，至少用无菌水冲洗4次后，再用无菌水浸泡19 Mh，剥取种子的成熟胚；b)将浸泡后种子的成熟胚去掉胚芽胚根后纵切，接入诱导培养基中，23 25°C暗培养，10 14天继代一次，共诱导培养20 观天，获得小麦成熟胚愈伤组织；c)将小麦成熟胚愈伤组织转入上述配制好的再生培养基中，23 25°C光照培养，25 30天，诱导小麦成熟胚愈伤组织分化，形成再生植株苗。
2.根据权利要求1所述的一种小麦成熟胚培养及再生的方法，其特征在于，所述的诱导培养基使用MS基本培养基的大量元素、微量元素和铁盐，与B5基本培养基的维生素成分进行复合，再添加麦芽糖，MgCl2,水解酪蛋白，谷氨酰胺，MES，其中，麦芽糖的浓度为40g/L， MgCl2的浓度为0. 75g/L，水解酪蛋白的浓度为500mg/L，谷氨酰胺浓度为300mg/L，所述培养基中MES浓度为1. 95g/L, pH = 5. 8。
3.根据权利要求1所述的一种小麦成熟胚培养及再生的方法，其特征在于，所述的 23 25°C光照培养是指在培育期期内，以环境温度23 25°C，光照和黑暗每1 相间交替，光照强度20001UX。
4.根据权利要求1或2所述的一种小麦成熟胚培养及再生的方法，其特征在于，小麦成熟胚愈伤组织诱导率至少为98%，小麦成熟胚愈伤组织分化率为23 50%。
5.根据权利要求3所述的一种小麦成熟胚培养及再生的方法，其特征在于，将分化出的再生植株苗接入1/2MS培养基中，按照传统方法进行壮苗培养。
全文摘要
本发明涉及一种小麦成熟胚培养及再生的方法，其再生培养基以MS基本培养基为基础，再生培养基中麦芽糖为40g/L，MES为1.95g/L，KT为5mg/L，NAA为0.1mg/L，pH＝5.8；具体方法为挑选成熟饱满的小麦种子，用70％酒精浸泡5min，0.1％HgCl2灭菌20min，至少用无菌水冲洗4次，再用无菌水中浸泡19～24h；再将种子的成熟胚去掉胚芽胚根后纵切，接入诱导培养基中，23～25℃暗培养，10～14天继代一次，共诱导培养20～28天，获得小麦成熟胚愈伤组织；然后转入上述配制好的再生培养基中，23～25℃光照培养，25～30天，诱导小麦成熟胚愈伤组织分化，形成再生植株苗。
文档编号A01H4/00GK102283123SQ20111019669
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月14日 优先权日2011年7月14日
发明者余桂红, 孙晓波, 张旭, 蒋苏, 马鸿翔, 魏芳 申请人:江苏省农业科学院