专利名称：Ob基因用作为鹅脂肪性状遗传标记的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及鹅的分子生物学技术及育种领域，具体是涉及测定与腹脂重和腹脂率等相关特征的遗传标记的存在，更具体地说，是涉及测定显示该些特征的OB基因的差异，再进一步具体地说，是测定OB基因中的多态性，即与腹脂重和腹脂率相关的鹅OB(Obese)基因的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,缩写为SNP)的存在。
背景技术：
现代家禽遗传育种理论和应用的发展，使肉用家禽特别是肉鸡、肉鸭的生长速度和饲料效率大幅度提高，生产效率与工厂化生产逐相适应。但同时也容易带来胴体腹部脂肪和皮下脂肪的大量沉积，导致饲料能量的浪费和胴体品质不佳。OB(obese)基因编码一种瘦蛋白质(Leptin)的肽类激素，可抑制脂肪蓄积和维持 脂肪细胞大小正常。目前有许多关于人、鼠OB基因以及少量关于猪OB基因的研究报道，但家禽OB基因的研究报道还鲜见。OB (obese receptor)基因在Lepein的信号转导起极重要作用，它与机体脂肪沉积有关，故OB基因可作为脂肪沉积候选基因。鸡OB基因的cDNA于1998年Taouis等克隆和测序，编码长度492bp，编码163个氨基酸，含18个氨基酸信号肽，成鸡Leptin由146氨基酸组成。Ashwell等用Northern检测发现,鸡的Leptin在脂肪组织和肝脏中都有表达。鸡OB的cDNA于2000年Guy Horev等和Takeshi等被克隆，与其他哺乳动物OB核苷酸序列的同源性平均为60%，Dunn等将鸡的OB基因定位于8号染色体上。顾志良等报道了对鸡的OB基因的外显子9的部分序列进行克隆和测序，发现一个碱基有突变，产生了多态性，但氨基酸序列没有改变(沉默突变)。顾志良等进一步用PCR-SSCP方法研究不同品种鸡的OB基因表明北京油鸡AA基因型频率与其它鸡种存在差异，高脂系A基因频率比低脂系高，并推测基因A可能与沉积较多腹脂有关。李志辉等研究结果表明，鸡OB基因外显子9的SNPs基因型对肉鸡腹脂重和腹脂率有显著影响，可以用于鸡脂肪性状的标记辅助选择。目前，有关鹅的DNA遗传标记、遗传多样性和相关功能基因的研究相对鸡来说还很少，且没有关于鹅OB基因的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种OB基因及其作为鹅脂肪性状遗传标记的用途；同时筛选与鹅脂肪沉积相关的SNP，以期应用于标记辅助选择或标记辅助渗入，并提供上述遗传标记在鹅标记辅助选择中的应用。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是一种OB基因，是与表示鹅脂肪性状的腹脂重和腹脂率和相关的基因。上述OB基因序列的第151bp处有一个A —G的突变，导致多态性的存在。克隆OB基因和检测151A-151G碱基处突变所用引物的序列如下正向引物5'-TGCCAGATCTTCCAGGATGA-3'，
反向引物5'-GAGATTCTGAGGTCATTGGC-3'。上述OB基因在鹅遗传标记辅助选择中的应用。一种鉴定鹅脂肪性状的遗传标记的方法，该鹅具有与表示鹅脂肪性状的腹脂重和腹脂率相关的基因，该方法包括测定从鹅获得的核酸样品中OB基因中多态性的存在，该多态性是与表示鹅脂肪性状指标的腹脂重和腹脂率相关的多态性，该多态性在OB基因序列的58bp处有一个T — G的突变。上述方法包含克隆得到一个如权利要求I所述OB基因的DNA序列，扩增目的片断长度226bp，第58碱基处有一个碱基突变T58-G58。克隆OB基因和检测T58-G58碱基处突变所用引物的序列为正向引物5'-TGCCAGATCTTCCAGGATGA-3'， 反向引物5'-GAGATTCTGAGGTCATTGGC-3'。上述方法在鹅育种中的应用。现代家禽遗传育种理论和应用的发展，使肉用家禽特别是肉鸡、肉鸭的生长速度和饲料效率大幅度提高，生产效率与工厂化生产逐相适应。但同时也容易带来胴体腹部脂肪和皮下脂肪的大量沉积，导致饲料能量的浪费和胴体品质的不佳。针对这个问题，本发明人选择鹅作为研究对象，采用分子生物学的方法筛选鹅脂肪性状相关基因，其步骤如下(I)选择健康初生雏苗溆浦鹅150只和四川白鹅150只进行饲养试验。所有供试鹅于84日龄进行屠宰测定，测定和计算按照《畜禽遗传资源调查技术手册》中的“家禽生产性能名词术语和度量统计方法”进行。用电子秤测定屠体重、全净膛重、腹脂重和用卡尺测量皮脂厚等。计算胴体脂肪性状比率指标。(2)根据OB基因的序列设计引物，对样品进行扩增、测序；(3)筛选与腹脂率高低相关的SNP。本发明采用PCR与DNA测序结合的方法首先筛选出OB基因为鹅脂肪沉积的相关基因，继而从鹅OB基因上筛选到与脂肪性状相关的SNP，并且通过生产实践验证确定OB基因为脂肪沉积相关基因，筛选的SNP为与之相关的SNP。本发明筛选的鹅OB基因的SNP可作为鹅辅助选择的遗传标记，从而培育出腹脂更少的鹅，具有极其重大的应用价值和经济效益。
图I是本发明的鹅OB基因部分序列的PCR-SSCP电泳图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明的鹅OB基因根据自己设计的引物得到的部分DNA序列，58bp处T/G多态位点以圆括号()标出表示。本发明的鹅OB基因得到的序列翻译为氨基酸序列图，第20个氨基酸位置处L(V)多态位点以圆括号()标出表示。
实施例I鹅相关基因SNP筛选选择相同日龄的健康雏苗溆浦鹅150只，四川白鹅150只进行饲养试验。所有供试鹅于84日龄进行屠宰测定，测定和计算按照《畜禽遗传资源调查技术手册》中的“家禽生产性能名词术语和度量统计方法”进行。用电子秤测定屠体重、全净膛重、腹脂重和用卡尺测量皮脂厚等。计算胴体脂肪性状比率指标。对即将进行屠宰测定的溆浦鹅和四川白鹅空腹12小时后，用一次性医用注射器(2. 5ml)翅下静脉采血Iml/只于5ml离心管中，用75%乙醇抗凝，冰箱4°C冷藏备用。对在屠宰测定中已经鉴定的高腹脂型和低腹脂型样本中分别选择6个共12个样品，并分别提取基因组DNA。根据GenBank中红原鸡的OB基因序列，用Primer 5. O程序来设计，覆盖该基因外显子 9 编码序列，引物序列为 5 ' -CGGTATGCAGTGAACAAGGA-3 ' (SEQ ID NO 2),5' -CATATTCTGACCACGAGGTG-3' (SEQ ID NO 3),扩增目的片断长度 424bp，由上海英韦创 津公司合成，用上述引物分别对提取的鹅基因组DNA进行扩增。PCR反应总体积为10 μ I,成分如下
IOx bufferI μ I
dNTPs (2. 5mM)O. 6 μ I
DNA 模板IOOng
前引物(20μΜ) O. Ιμ
后引物(20μΜ) O. Ιμ Taq DNA 酶2U
加 ddH20 至IO μ I反应条件94°C 5分钟预变性后30个PCR循环参数为95°C 30秒，50°C 30秒，72 0C 30秒，最后72 0C 7分钟。取扩增产物5 μ 1，加入变性剂(95%甲硝铵)10μ 1，95°C变性10分钟，再冰浴5分钟后，点样于15%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳(丙烯酰胺/N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺为29 I)，电压保持在80 100V，常温下电泳约16 18小时，直至兰色溴酚蓝染料至凝胶最底端为止。凝胶用硝酸银染色，根据显影结果判定基因型。如图I所示，SSCP分析结果表现为鹅OB基因部分DNA片段有三种不同条带类型，说明该DNA片段存在SNP。三种不同条带类型分别定义为GG型和TT型，杂合型定义为GT型。取PCR扩增产物50 μ 1，经纯化，克隆后经测序，确证了 PCR产物是OB基因，PCR产物的长度为226bp，序列图为TGCCAGATCTTCCAGGATGACACCAAACCCTCATCAAGACCATTGTCACCAGATCAAT(G) TACATTCACACACGTCGGTATCGCCAAGCAGAGGGTCACTGGCTTGGACTTATTCTGGCTTCACCCCTCTGAGTTTGTCCAAGATGACAGACTCTGCAGTCTATCACAGGTCCTCACCAGCCTGCCTTCCCAAAATGTGCTGCAGATTGCCAATGACCTCAGAATCTC
并从PCR产物测序结果，显示了鹅OB基因的变异位点。结果表明，在该基因片段序列的58bp处有一个T — G的突变。将上述产物进行氨基酸序列分析，结果如下CQIFQDDTKPSSRPLSPDQL(V)HSHTSVSPSRGSLAWTYSGFTPLSLSKMTDSAVYHRSSPACLPKMCCRLPMTSES上述氨基酸序列分析表明，鹅OB基因的一个碱基突变导致该基因在表达时所转录的蛋白质中氨基酸序列也发生一个变异，即第20个氨基酸天门冬缬氨酸变为亮氨酸。即所有高腹脂的在58碱基为G，低腹脂的碱基为T，导致所编码的氨基酸高腹脂的为天门冬缬氨酸(V)，低腹脂的为亮氨酸(L)。上述实验结果表明，从鹅腹部脂肪提取的鹅脂肪性状相关基因为OB基因，并且在该基因序列中筛选到与腹脂沉积有关的SNP，并且该碱基突变导致了蛋白质氨基酸也发生一个变异，很可能这就是影响腹脂沉积的原因。
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实施例2与腹脂率有关的SNP在生产实践中的验证选择健康初生雏苗溆浦鹅150只和四川白鹅150只进行饲养试验。两品种鹅在相同饲养管理条件下，试验结束时对试鹅进行屠宰测定，宰前测定体重并采集血样2ml/只。屠宰采用颈部放血，机器和人工相结合拔除毛绒及细毛，浙干后冷却屠体再进行称重和胴体脂肪性状测定。胴体脂肪性状测定和计算按照《畜禽遗传资源调查技术手册》中的“家禽生产性能名词术语和度量统计方法”进行。其中腹脂重指腹部脂肪和肌胃周围脂肪之和；腹脂率(%)=腹脂重/(全净膛重+腹脂重)χιοο%。用提取的二个品种各120只鹅血样基因组DNA，利用实施例I中的引物扩增，并按照实施例I的方法检测其SNP。I、PCRPCR反应体系,如表I所示表I PCR反应体系中各组成成分
权利要求
1.一种OB基因，其特征在于，所述OB基因为与表示鹅脂肪性状的腹脂重和腹脂率相关的基因。
2.如权利要求I所述的OB基因，其特征在于，所述OB基因序列的第58bp处有一个T-G的突变，导致多态性的存在。
3.如权利要求I所述的OB基因，其特征在于，克隆OB基因和检测58T-58G碱基处突变所用引物的序列如下 正向引物5' -TGCCAGATCTTCCAGGATGA-3'， 反向引物5' -GAGATTCTGAGGTCATTGGC-3'。
4.如权利要求I至3中任一项所述的OB基因在鹅遗传标记辅助选择中的应用。
5.一种鉴定鹅脂肪性状的遗传标记的方法，该鹅具有与表示鹅脂肪性状的腹脂重和腹脂率相关的基因，其特征在于，该方法包括测定从鹅获得的核酸样品中OB基因中多态性的存在，该多态性是与表示鹅脂肪性状指标的腹脂重和腹脂率相关的多态性，该多态性在OB基因序列的58bp处有一个T — G的突变。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于该方法包含克隆得到一个如权利要求I所述OB基因的DNA序列，扩增目的片断长度226bp，第58碱基处有一个碱基突变T58-G58 ；即所有高腹脂的在58碱基为G，低腹脂的碱基为T，导致所编码的氨基酸高腹脂的为天门冬缬氨酸，低腹脂的为亮氨酸。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，克隆OB基因和检测T58-G58碱基处突变所用引物的序列为 正向引物5' -TGCCAGATCTTCCAGGATGA-3'， 反向引物5' -GAGATTCTGAGGTCATTGGC-3'。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，本发明人所述方法选择鹅作为研究对象，采用分子生物学的方法筛选鹅脂肪性状相关基因，其步骤如下 (1)选择健康初生雏苗溆浦鹅150只和四川白鹅150只进行饲养试验； (2)根据OB基因的序列设计引物，对样品进行扩增、测序； (3)筛选与腹脂率高低相关的SNP。
9.权利要求5至8中任一项所述的方法在鹅育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种OB(obese receptor)基因及其作为鹅脂肪性状遗传标记的用途，测定出OB基因中与鹅腹脂重、腹脂率相关的遗传标记，并测定从鹅获得的核酸样品中OB基因中多态性的存在，该多态性导致所编码的氨基酸发生改变，并且与腹脂重、腹脂率存在相关。根据该基因的单核苷酸多态性可对基因组DNA中含有OB基因的动物进行脂肪性状选育，筛选出降低鹅腹脂重、腹脂率的优势基因型，具有极其重大的应用价值和经济效益。
文档编号A01K67/027GK102911942SQ201210306638
公开日2013年2月6日 申请日期2012年8月27日 优先权日2012年8月27日
发明者曲湘勇, 蒋隽, 何俊, 贺长青 申请人:湖南农业大学, 曲湘勇