专利名称：人参PgPDR3基因及其编码蛋白在调控人参皂苷转运与积累中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，涉及改良植物性状，具体是促人参皂苷生物合成、转运与积累的相关基因及其蛋白和应用。本发明在提高人参等植物中人参皂苷含量方面有着重要的应用价值。
背景技术：
人参(P. ginseng C. A. Meyer)为五加科人参属多年生草本植物,是名贵中药材。人参中含有多种药用成分，其中人参皂苷是人参最主要的活性成分。目前已从人参根中分离出50余种人参皂苷，现代医学研究证明各皂苷单体具有重要的药用价值，且已广泛应用于临床。但是其中一些具有抗肿瘤、抗衰老、抑制细胞凋亡和增强免疫力等活性强的皂苷含量极低。近年来，国内外对利用人参细胞培养等技术生产人参皂苷进行了广泛和深入的研究，但其含量仍较低，远不能满足市场的需求。在植物次生代谢调控中，可以通过导入关键酶等基因调控合成途径中的多步限速反应，并促进次生代谢产物的合成；或通过诱导跨膜转运蛋白将合成的代谢产物转运到细胞外或细胞器中得以积累，利用转运系统使合成代谢向积累方向转变，从而提高次生代谢产物含量。通过人参皂苷的转运机制，进而促进人参皂苷合成与积累，有望成为人参皂苷高产调控的新策略。植物ABC (ATP-binding cassette transporter)转运蛋白是目前已知最大，功能最广泛的蛋白家族，ABC转运蛋白属于跨膜运输蛋白，利用水解ATP释放的能量转运有机酸、生物碱、细胞代谢产物和药物等。参与细菌耐药性、次生代谢产物积累、胁迫反应和肿瘤抗药性等。ABC转运蛋白家族包括多向耐药性蛋白(pleiotropic drug resistance,PDR),多药耐药性蛋白(multidrug resistance, MDR)等。PDR是其中最大的亚族,是植物和真菌中特有的一种ABC转运蛋白。但目前对植物PDR基因相关研究甚少，离体细胞培养中，香紫苏醇可诱导NpTORl基因上调表达，在细胞内NpTORl蛋白累积增强了细胞向胞外转运香紫苏醇以及其类似物的能力。拟南芥(A. thaliana)细胞内香紫苏醇的累积亦能诱导AtH)R12基因上调表达，同时在细胞外检测到AtH)R12蛋白向胞外转运的香紫苏醇，推测萜类物质可能是AtH)R12基因表达的上游调控物质。因此，PDR蛋白可能通过转运内源性抗真菌二萜类物质参与植物防御反应。此外，尚无植物PDR蛋白转运更复杂萜类分子的报道。
发明内容
本发明旨在提供一种能够调控人参皂苷转运与积累相关的基因、由该基因编码的蛋白及其应用，为今后开发基因工程产品奠定基础。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为本发明提供了一种人参PgPDR3基因，基因序列如SEQ ID NO. I所示。本发明还提供了一种用于扩增PgPDR3基因的简并引物对，所述引物对如SEQ IDNO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示。本发明还提供了含有PgPDR3基因重组载体，具体包括植物表达载体PBI121，gp，将PgPDR3基因克隆到空载体PBI121中，获得重组载体pBI121_PgPDR3 ;原核表达载体pET28a，即，将PgPDR3基因克隆到空载体pET28a中，获得重组载体pET28a-PgPDR3。PgPDR3基因亦可克隆到其他空载体中，或制备成转基因细胞及重组菌。本发明还提供了 PgPDR3基因在调控人参皂苷转运与积累中的应用；PgPDR3基因在人参育种中的应用。本发明还提供了一种由SEQ ID NO. I所不PgPDR3基因编码的蛋白，该蛋白的序列如 SEQ IDN0. 2 所示。
本发明还提供了 SEQ ID NO. 2所示蛋白在调控人参皂苷转运与积累中的应用，以及该蛋白在人参育种中的应用。本发明利用现有的植物基因工程技术，利用植物PDR基因同源性设计简并引物，利用cDNA-AFLP及RACE技术，分离与鉴定人参皂苷转运与积累相关的基因序列，并通过根癌农杆菌介导法将基因转入烟草，经过异源表达鉴定证明PgPDR3基因对人参皂苷的转运功能。本发明人参ABC转运蛋白基因PgPDR3序列如SEQ ID NO. I所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO. 2所示。研究发现PgPDR3基因表达具有组织特异性且与人参皂苷的积累有关。初步表明所述PgPDR3基因具有促进人参皂苷合成、转运和积累方面的功能。可以通过该基因或其衍生物筛选或改良人参甚至其它植物，获得人参皂苷含量高的优良植物品种。亦可以采用人参组织培养或转基因植物生产Rb、Re和Rg等人参皂苷单体。
图I是本发明的PCR扩增PgPDR3基因图示；图中，I表示简并引物PCR扩增产物，M 表不 Marker ；图2是本发明的PgPDR3蛋白跨膜结构域预测图；图3是本发明的PgPDR3基因编码氨基酸序列及其与其它植物PDR基因同源性比较图；图4是本发明的PgPDR3基因编码氨基酸序列进化树分析图；图5是本发明的PgPDR3基因在人参不同组织中的表达水平图；图6是本发明的PgPDR3基因在ΙΟΟμΜ MeJA诱导条件下的人参细胞中表达水平图。
具体实施例方式实施实例I PgPDR3基因的获得I、人参悬浮细胞培养(I)取吉林长白山人参产区四年生人参根，自来水浸泡45min后冲洗2次，先用75%乙醇浸泡30秒(sec)，无菌水冲洗2次，无菌室超净工作台上用O. l%HgCl2消毒，不断搅动，无菌蒸馏水冲洗4-5次。(2)在无菌条件下，将消毒过的外植体接种到含有2，4_D (2. Omg/L)和KT (O. 5mg/L)的MS培养基中。经3次继代培养后外植体完全脱分化，待完全形成愈伤组织后，每IOOml三角瓶接种6个外植体，培养条件如前述，培养45天(d)后将愈伤组织行继代培养，以补充培养物所需的营养物质和其它要求。接种30d后进行第一次继代培养，以后每3-4周继代一次。(3)当得到愈伤组织后，将其转入到MS液体培养基中。愈伤组织块直径应小于3mm。若组织块较大可用无菌解剖刀将其分割成小块。液体培养基分装在50ml的锥形瓶内，每IOml液体培养基接种I. 5-2. Og愈伤组织，接种后震荡培养，120rpm, 24°C，暗培养。每隔
4-7d继代一次。2、细胞处理及其RNA提取(I)细胞处理
I)取460 μ L茉莉酸甲酯(Me JA )溶于4540 μ L乙醇，加5ml双蒸水至IOml，配成IOml 200mM的MeJA母液，用O. 22 μ m的滤器过滤除菌，处理组每IOml液体培养基加入10 μ L母液至终浓度为200 μ M ;取4540 μ L乙醇加入双蒸水中定容至IOml做为对照，用
O.22 μ m的滤器过滤除菌后，对照组每IOml液体培养基加入10 μ L。2)在悬浮细胞继代的48h后按以上方法处理处理组与对照组的细胞，120rpm,24°C，振荡暗培养，培养24h后分别提取处理组的对照组的人参细胞的总RNA。(2)人参悬浮细胞总RNA提取①3000 Xg离心5min收集的悬浮细胞,在研钵内用液氮充分研磨成粉末。每40mg研磨的粉末置于1.5ml离心管中，加入Iml TRIzoI试剂，40 μ L β-巯基乙醇，用移液器吸头重悬细胞沉淀，室温孵育5-10min。②加入O. 2ml氯仿，振摇15sec,室温孵育10_15min。③4°C、12000Xg离心15min，收集上层无色水相于I. 5ml离心管中，勿吸动中间
层，弃沉淀。④加入0.4ml 3mol/L醋酸铵(ρΗ5· 2)，O. 6ml异丙醇，轻柔振荡混匀，室温孵育
5-10min(RNA 沉淀)。4°C、12000 X g 离心 IOmin,弃上清。⑤加入Iml 75%乙醇并振荡；4°C,7500Xg离心5min,弃上清,重复该步骤。⑥空气中干燥lOmin，加入20 μ L DEPC水溶解RNA。⑦RNA的非变性琼脂糖凝胶电泳在O. 5XTBE中进行，琼脂糖浓度为1%(每IOOml凝胶中加入2. 5 μ L的10mg/ml EB), 4 μ L上样量，8v/cm恒压40min,然后在紫外凝胶成像系统中观察所提取RNA的完整性。(3)mRNA 的纯化①取人参悬浮细胞总RNA200 μ g，用DEPC水补至500 μ L，65°C水浴IOmin后，加入3μ L生物素酰化的oligo (dT)探针与13 μ L20 X SSC溶解并孵育至室温，使生物素酰化的oligo(dT)探针与mRNA分子poly(A)尾充分杂交。②悬浮于管中的链亲和顺磁珠(Stroptavidin-ParamagneticParticles,SA-PMPs)用0. 5 X SSC溶液洗涤3次，0. 3ml/次，然后重悬于0. Iml 0.5 X SSC中。③将上述经处理的RNA溶液与SA-PMPs混合，室温孵育lOmin，每12min混匀一次，用磁力架收集含有RNA的SA-PMPs，弃上清。④用0. IXSSC溶液重复洗涤SA-PMPs 4次，其中0. 3ml/次，用磁力架收集SA-PMPs并弃上清。⑤加入100 μ L DEPC水重悬SA-PMPs，磁力架收集SA-PMPs，吸取水相。再加入150 μ L DEPC水重悬SA-PMPs，磁力架收集SA-PMPs，吸取水相。
⑥收集合并以上两次的水相，加入1/10体积3M NaAc和等体积异丙醇，震荡混匀，-20°C静置Ih0⑦4°C, 12000 X g 离心 20min,弃上清。⑧用75%乙醇8000\区,5111；[11,洗漆沉淀两次，Iml/次。⑨mRNA空气中自然干燥lOmin，用20 μ LDEPC水溶解。3、cDNA 合成纯化mRNA后，以oligo (dT)为引物，M-MuLV反转录酶反转录总mRNA。(I)反应体系如下
Template mRNA (200 η g/μ L) IO μ _.
5x1 strand synthesis buffer4 μΕ
dNTP mixture (.10 mM)I μL
RNase InhibitorI pL
oligo(dT) (50 μΜ)2 μ ,
M~MLV(200U/^iL)I μ
RNase-free H2OI μ L
Total volume20 μ (2)轻柔搅拌混匀；室温放置IOmin后，移至恒温水浴箱；42°C，Ih ;结束后，冰上冷去P 2min。4、cDNA-AFLP(I) cDNA第二链的合成以及末端平滑化①在第一条cDNA合成后的离心管中按下列顺序配制合成cDNA第二条链的反应液
合成cDNA第一条链的反应液 20 μ ,
5>-2 strand synthesis buffer30 μL
dNTP (IOmM )3 μL
RNase-free Η089 μL
I:, coIi DNA polymerase I2 μL
lixoli RNase HI μΕ
E.coli DNA ligaseI μΕ②16°C 反应 2h。③70°C加热 IOmin。④加入4 μ L 的 T4DNA Ploymerase,轻轻揽拌。⑤37O 反应 IOmin。⑥加入15 μ L的0. 25Μ EDTA (ρΗ8. 0)以及15 μ L的10%SDS溶液，终止反应。(2 )合成的cDNA的精制
①在上述反应液中加入等量(180 μ L)的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)溶液。②剧烈振荡混匀。③在室温条件下12000Xg离心5min,液体分为三层。小心取出水相(上层),移至另外一个新的I. 5ml离心管中。④向水相中加入等量的氯仿/异戊醇(24 :1)溶液，剧烈振荡混匀。⑤在室温下12000 Xg离心5min，液体分为二层。小心取出水相移至另外一个新的
I.5ml离心管中。
⑥加入150 μ L的4M醋酸铵，2. 5体积的乙醇，充分混匀，室温下放置lOmin。⑦在4°C下14000父8离心2011^11，去上清。⑧用Iml 70%乙醇8000 Xg离心5min，重复2次。⑨用适量的TE缓冲液溶解。(3)cDNA 酶切消化①将上一实验步骤合成的cDNA与以下试剂混合于I. 5ml的反应管中
5 xTeaction buffer5 μL
cDNA(250 ng)I I liL
1\coR MMse I2 μL
ddH207 pL②轻柔混匀后短暂离心，370C，水浴2h。③70°C，水浴15min结束酶切反应。(4)接头连接①在上一步的反应管中加入24 μ L adapter ligation solution和 I μ L 的 T4DNAligase。②轻柔混匀后短暂离心，20°C左右水浴2h。③将10 μ L反应液转移至I. 5ml的离心管中，加入90 μ L的TE缓冲液，使连接反应液稀释10倍，轻柔混匀后短暂离心。④连接反应液于_20°C保存。(5 ) cDNA-AFLP预扩增、选择性扩增和电泳分析将连接接头的产物稀释10倍，进行预扩增。预扩增引物为EcoRI引物5，-GACTGCGTACCAATTCA-3’ (SEQ ID NO. 3), Mse I 引物5，-GATGAGTCCTGAGTAAC-3，(SEQ ID NO. 4);预扩增反应条件为94°C，30s，56°C，lmin，72°C，lmin，20 个循环。将预扩增产物稀释20倍，再选用8条选择性扩增E引物和8条M引物进行选择性扩增。其中8条E引物与预扩增的EcoR I引物匹配，8条M引物与Mse I引物匹配；每条选择性EcoR I引物(E引物)分别与选择性Mse I引物(M引物)进行组合，共有64个引物对组合。用于选择性扩增的引物如下E 引物为 5’ -GACTGCGTACCAATTCA-3’ 序列的 3’ 端分别加 AC、AG、CA、CT、CC、CG、GC 和 GG) ;M 引物 5’ -GATGAGTCCTGAGTAAC-3，序列的 3，分别加 AA、AC、AG、AT、TA、TC、TG
和 TT)。cDNA-AFLP 选择性扩增米用 “touchdown”PCR,条件为94°C,lmin ；94°C, 30sec,65°C，lmin，72°C，90sec;每循环一次，退火温度降低1°C，至56°C后循环23次。对照组和MeJA处理组的各引物组合均重复3次选择性扩增反应。然后将三次重复反应产物合并，力口入1/10体积的3M NaAc，再加入3倍体积预冷的无水乙醇沉淀;70%乙醇洗2次，沉淀重悬于20 μ L双蒸水，2%琼脂糖凝胶电泳分析。
(6)差异表达条带二次扩增和克隆从琼脂糖凝胶中切出明显差异的条带，采用胶回收试剂盒回收差异表达片段，以回收片段为模板进行二次PCR扩增，PCR反应体系及程序与选择性扩增相同。PCR产物经
2.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，胶回收并与pGEM-T Easy载体连接，转化大肠杆菌DH5 α，提取单菌落质粒。对质粒进行双酶切鉴定和PCR检测，检测无误后送上海英骏公司测序。测序后获得序列长度为439bp，测序结果经Blast比对，与其他植物PDR基因高度同源。5、cDNA全长扩增根据cDNA-AFLP扩增获得的439bp PDR基因序列设计5 ’端和3 ’端扩增引物，5，-RACE 引物(GSP5-1)和 3，-RACE 引物(GSP3-1)分别为GSP5-1 :5，-TGCCCGCCTGAGATACCCCTTACCA-3，，(SEQ ID NO. 5)GSP3-1 :5’ -CAGGCGGGCAAATGAAGCGTGTTAC-3’。(SEQ ID NO. 6)①RNA提取及其反转录RNA提取采用上述方法进行，反转录采用SMART RACE cDNA AmplificationKit中反转录酶和引物。②5’端扩增反应体系
PCR-Grade WaterM、
μ
IOxAdvantage 2 PCR Buffer5.0 μL
dNTP Mix (10 mM)1.0 liL
50χAdvantage 2 Polymerase Mix1.0 μL
5’ -RACE-Ready cDNA2.5
pL
UPM ( ΙΟχ)5.0 liL
GSP5-1 (ΙΟμΜ)LO
μL③5’端扩增反应条件94°C 2min，I cycles:94°C 30sec, 72°C Imin 30sec，5 cycles;94°C 30sec, 70°C 30sec, 72°C Imin 30sec，5 cycles;94°C 30sec, 68°C 30sec, 72°C Imin 30sec，20 cycles④3’端扩增体系PCR-Grade Water34.5
pL
10>-Advantage 2 PCR Buffer5.0 μL
dNTP Mix (IOmM)1.0 μ
50χAdvantage 2 Polymerase Mix1.0 μL 3，-RACE-Ready cDNA2.5 μL
UPM(IO )5.0 μΕ
GSP3-1 (ΙΟμΜ)1.0 μΕ⑤3 ’端扩增反应条件94°C 2min，Icycles:94°C 30 sec, 72°C 4 min，5 cycles;94°C 30 sec, 70°C 30 sec, 72°C 4 min，5 cycles;94°C 30 sec, 68°C 30 sec, 72°C 4 min，20 cycles⑥电泳及其测序PCR产物经I. 0%琼脂糖凝胶电泳检测后，胶回收并与pGEM-T Easy载体连接，转化大肠杆菌DH5a，提取单菌落质粒。对质粒进行双酶切鉴定和PCR检测，检测无误后送上海英骏公司测序。测序后获得5’端cDNA长度为1043bp，3’端cDNA长度为3482bp，经拼接后得到包含完整编码框的全长为4515bp的序列(PgPDR3)，提交到Genbank，登录号为KC013238。6、序列分析经过测序成功获得了长度为4515bp的cDNA序列，利用NCBI中在线分析工具BLAST 和 ORFFinder (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi 和 http://www. ncbi.nlm. nih. gov/gorf/orfig. cgi)进行比较和ORF查找发现该序列中⑶S序列长度为4137bp,对其编码的氨基酸序列采用CLUSTALX软件分析比较，与其他植物I3DR基因如大豆(GmPDRl，XM003546171)、烟草(NpPDRl，AJ404328 ；NtPDRl,AB109388. I 和 NpPDR2，BAD07484. I)、水稻(OsPDRl, AJ535054 ；0sPDR2, AJ535053 和 0sPDR3，AJ535052)有较高的同源性。利用 TMHMM(http://www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM-2. 0/)在线分析软件分析跨膜结构域,结果显示该蛋白为跨膜蛋白。并使用MEGA4软件以邻接法(Neighbor-J0ining，NJ)构建系统发生树。系统树中分支的置信水平用自引导值(Bootstrap test)估计，重复1000次，结果显示该基因与大豆的PDR基因亲缘性最近，其次是烟草和水稻。7、表达分析取新鲜的人参的根、不定根、芽、种子和发根，分别提取RNA ;再以10(^丽6从分别诱导人参根0、1、3、6、12和24h，提取各时间点人参根总RNA。以oligod(T)18为引物，AMV反转录酶合成cDNA，并以β -actin为内参，利用real-time PCR扩增PgPDR3基因，PgPDR3和β-actin扩增引物分别为PgPDR3 F :5，-GTGGGGCTGGGAAGACCACTCT-3’ ；(SEQID NO. 7)R:5’ -GCTCCCAGTATCCTGCTATGCGA-3’ ；(SEQ ID NO. 8)
β actin F :5’ -CGTGATCTTACAGATAGCTTCATGA-3’ ；(SEQID NO. 9)R:5’ -AGAGAAGCTAAGATTGATCCTCC-3’。(SEQ ID NO. 10)
反应体系为
2 X S Y B R #l Premix Ex Taq II 25 μL 引物 I (ΙΟμΜ)IpL
弓丨物 2 (ΙΟμΜ)I
cDNAI IiL CidH2O22 ,uL采用两步法PCR扩增标准程序95°C 30sec ；95°C 40sec,60°C 30sec共40个循环；95°C 15sec，60°C lmin，95°C 15sec。每个样品三次重复。反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，采用2_“ct方法计算PgPDR3基因在不同组织和MeJA诱导下不同时间表达水平的差异。结果显示其在发根中表达最高，其次是根、不定根和种子，芽中表达最低。MeJA可以显著诱导人参皂苷的合成，MeJA诱导24h，PgPDR3基因表达迅速增加至10倍以上，PgPDR3表达与人参皂苷的合成密切相关。实施实例2表达载体的构建及转化I、植物过表达载体的构建及转基因植株筛选(I)分别用 BamH I 和 Sac I 双酶切 pBI12 I 和 PgPDR3，回收 pBI12 I 载体和 PgPDR3基因片段。将两片段连接并转化DH5a，筛选出重组子，重组质粒命名为pBI-PgPDR3。其中扩增PgPDR3基因的上下游引物分别为PgPDR 3 :F1:5’ -CGGGATCCCGCACCATGGCATTAAAAAGTAGCAG-3，；(SEQ ID NO. 11)Rl: 5’ -CGCGAGCTCGGCCATTTTGTTATCTCTTTTGG-3’。(SEQ ID NO. 12)其中划线部分为BamH I和Sac I酶切位点。(2)根癌农杆菌感受态细胞的制备①在含有100 μ g/ml利福霉素的YEB平板上划线培养农杆菌LBA4404，28°C暗培养2d。②挑取单菌落接种到含有100 μ g/ml利福霉素的YEB培养基中，28°C振荡培养过夜。③将过夜活化的农杆菌按1:50的比例稀释到50ml含有100 μ g/ml的卡那霉索的YEB培养基中，28°C振荡培养至0D600约为O. 4-0. 6，冰浴30min。④于4°C, 5000rpm离心lOmin,弃上清液,用IOmlO. 15mMNaCl悬浮菌体。⑤于4°C, 5000rpm离心lOmin,弃上清液,用2ml20mMCaCl2悬浮菌体。⑥每管200 μ L分装，液氮速冻，_70°C保存。(3)根癌农杆菌感受态细胞的转化①将根癌农杆菌感受态细胞置于冰上，缓慢解冻。②加入O. 5 μ gpBI121-PgPDR3 质粒 DNA，轻轻混匀，冰浴 30min。③置液氮中冷冻2min，迅速移入37°C水浴中热激5min，再迅速冰浴2min，之后加入800 μ LYEB液体培养基，于28 °C振荡培养3_4h。
④5000rpm离心5min沉淀菌体,弃掉800 μ L上清后重新悬浮菌体,均勻涂布于含有100 μ g/ml利福霉素和50 μ g/ml卡那霉素的YEB培养基上，28°C培养2_3d。(4)根癌农杆菌质粒提取和鉴定①PCR鉴定挑取转化的农杆菌单菌落接种于I. 5ml含卡那霉素的LB液体培养基中37°C振荡培养，用PgPDR3基因特异性引物F:5，-GTGGGGCTGGGAAGACCACTCT-3，；(SEQ ID NO. 7)R:5’ -GCTCCCAGTATCCTGCTATGCGA-3’ ；(SEQ ID NO. 8)进行PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测是否含有预期片段。PCR反应程序如下940C 30sec,55°C 45sec,72°C 30sec，35 个循环；72°C 2min。②酶切鉴定挑取农杆菌单菌落接种于含有100 μ g/ml的利福霉素和50 μ g/ml的卡那霉素的YEB培养基中，28°C培养过夜培养，提取重组质粒pBI121-PgPDR3，采用上述方法以BamH I和Sac I酶切提取的质粒。(5)含pBI121_PgPDR3质粒的根癌农杆菌培养28°C划线培养含有pBI121_PgPDR3质粒的农杆菌约2d。挑取单菌落接种于含有100mg/L利福霉素和50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，28°C振荡培养过夜，至0D600约为O. 6时收集菌液，4000rpm离心lOmin，沉淀重悬于1/2MS液体培养基中。
(6)叶盘法侵染烟草将烟草幼叶置于自来水中冲洗3-4次，然后在70%乙醇中浸泡30_60sec，10%次氯酸钠中消毒10_20min，再用无菌水充分冲洗，然后置于无菌培养皿中，将叶片切成
0.5-1 cm2的小片，将剪好的叶片分别放入含有pBI121-PgPDR3质粒的农杆菌菌液中侵染5min，将叶片上的菌液用无菌滤纸吸干。(7)共培养侵染过并吸干表面菌液的叶盘，气孔面朝上，紧靠着放在共培养基上(MS+6-BA
1.Omg/L+IAA O. lmg/L)，黑暗处培养 2d。(8)筛选及分化培养暗培养2d后，转换到筛选分化培养基上(MS+6-BA I. Omg/L+IAA O. Img/L+Kanl00mg/L+Cef300mg/L),每15d换一次筛选分化培养基,至分化出的烟草长至3_5cm时转至生根培养基中。(9)生根培养将分化至3-5cm的烟草分别切下，转移至生根培养基(1/2MS+IBA 2. Omg/L)。(10)移栽当再生植株的根长至5_8cm时，打开封口膜炼苗2_3d，将幼苗移栽至花盆内，移栽后最初的5-10d罩上透明塑料，保持90%-100%的湿度，并在罩上打些小孔以利于气体交换。移栽的基质以及花盆均预先消毒。(7)转基因植株PCR鉴定以转基因植株的基因组DNA为模板，采用上述重组质粒鉴定所用的PgPDR3基因特异性引物进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件同上。经鉴定得到分化成苗的Ttl代阳性转基因植株。2、转运功能鉴定取转PgPDR3基因的烟草幼叶，采用上述相同方法诱导产生悬浮细胞，利用人参皂苷饲喂及比较植物功能基因组学技术，通过通过气相色谱-质谱联用(gaschromatography-mass spectrometry, GC/MS)法直接定量测定并比较分析转基因烟草培养系中人参皂苷化学成分谱表型的改变，确定PgPDR3转运蛋白对人参皂苷的转运功能。3、原核表达分析(I) PCR 扩增以已扩增的PgPDR3基因为模板，以上下游分别添加EcoR I和Hind III酶切位点序列的引物进行扩增，其扩增所用的引物如下(划线部分分别为EcoR I和HindIII酶切位 点)F:5，-CGGGA ATTCATGGCATTAAAAAGTAGCAG-3，；( SEQ ID NO 13)R:5 -CCCAAGCTTGGGCATTTTGTTATCTCTTTTGG-3>。(SEQ ID NO. 14)反应体系同上，PCR反应程序如下94°C 30sec，55°C 45sec，72°C 4min30sec，35 个循环；72°C IOmin。(2)酶切、连接转化及其筛选分别用EcoR I和Hind III双酶切pET28a和PCR产物，回收pET28a和PCR产物片段。将两片段连接并转化BL21，通过卡那霉素筛选、PCR扩增和酶切鉴定出重组子，重组质粒命名为pET28a-PgPDR3。(3) PgPDR3蛋白诱导表达及其功能分析挑取含有重组pET28a-PgPDR3 质粒的菌落 BL21 (DE3)，至 IOmlLB(含 Kan50 μ g/ml)中37°C过夜培养。取Iml菌液加入到含IOOml LB培养基(含Kan50 μ g/ml)，37°C震荡培养至0D600约为O. 4-0. 6。加入IPTG至终浓度为ImM进行诱导，每隔Ih收集一次菌液，5000 X g离心lOmin，收获沉淀，以Ig菌体加入4ml PBS缓冲液的比例重悬，加入5 X SDS-PAGE上样缓冲液，混匀，沸水浴5min取上清进行SDS-PAGE分析。选取PgPDR3蛋白表达量高的时间点，加入人参皂苷等底物，分析PgPDR3蛋白的转运功能，并结合His-tag进行蛋白纯化,体外解析其结构。
权利要求
1.一种人参PgPDR3基因，其特征在于，所述PgPDR3基因序列如SEQ ID NO. I所示。
2.一种用于扩增权利要求I所述PgPDR3基因的引物对，其特征在于，所述引物对如SEQID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示。
3.—种重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因为权利要求I所述的PgPDR3基因。
4.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述空载体为PBI121或pET28a。
5.根据权利要求I所述PgPDR3基因在调控人参皂苷转运与积累中的应用。
6.根据权利要求I所述PgPDR3基因在人参育种中的应用。
7.一种转运蛋白，其特征在于，所述蛋白由SEQ ID NO. I所示的基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
8.根据权利要求6所述蛋白在调控人参皂苷转运与积累中的应用。
9.根据权利要求6所述蛋白在人参育种中的应用。
全文摘要
本发明公开一种促进人参皂苷转运与积累相关基因PgPDR3及其编码蛋白和应用。该人参皂苷转运与积累相关基因PgPDR3序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。研究发现PgPDR3基因表达具有组织特异性且与人参皂苷的积累密切相关。所述PgPDR3基因在促进人参皂苷合成、转运和积累方面有显著的效果。可以通过该基因或其衍生物筛选或改良人参及其它植物，获得人参皂苷含量高的优良植物品种。亦可以采用人参转基因细胞或植物生产原人参二醇、Rb、Re、Rh2、Rg2和Rg3等人参皂苷单体。
文档编号A01H5/00GK102925459SQ20121046240
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者罗志勇, 张儒, 黄景嘉, 祝捷, 陈湘晖, 曹宏哲 申请人:中南大学