一种从水稻种子生产重组人碱性成纤维细胞生长因子的方法
【专利摘要】本发明提供了一种水稻遗传密码子优化的OsrbFGF基因，相关载体及其制备OsrbFGF转基因水稻种子的方法和OsrbFGF的分离纯化方法。通过水稻胚乳细胞特异性表达OsrbFGF的表达载体来制备OsrbFGF转基因水稻种子，并从中分离纯化OsrbFGF，所获得OsrbFGF的纯度达95%，并具有体外促进NIH/3T3细胞增殖和体内促进伤口愈合的活性。
【专利说明】一种从水稻种子生产重组人碱性成纤维细胞生长因子的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及通过基因工程技术在植物中制备人细胞生长因子的方法。
【背景技术】
[0002]成纤维细胞生长因子(FGF)是一类与肝素有高亲和力且生物活性相似的蛋白家族。至今已分离鉴别出23个不同的成纤维细胞生长因子。成纤维细胞生长因子的原型，即喊性成纤维细胞生长因子(bFGF,basic fibroblast growth factor, bFGF or FGF-2)是20世纪70年代首次在垂体和大脑发现的。它是一个单链的、分子量为171^&、等电点为9.6的蛋白质。它可以促进NIH/3T3细胞的增殖和抑制干细胞的分化，由于它可促进人气道平滑肌细胞的增殖、迁移并在体外改变其收缩表型从而引起气道重塑的衰减，因此可能在哮喘治疗中发挥重要的作用。随后，碱性成纤维细胞生长因子还被证实可促进小鼠乳腺上皮细胞的生长。此外，它被广泛应用于烧伤治疗和伤口愈合的临床应用，因为碱性成纤维细胞生长因子可显着加快伤口愈合速度。用碱性成纤维细胞生长因子治疗创口发红、伤口红肿及烫伤愈合比单纯用手术治疗更有效并且皮肤表面的硬度较小。因此，碱性成纤维细胞生长因子常被用于心血管疾病和神经退行性疾病中的组织修复和伤口愈合。
[0003]碱性成纤维细胞生长因子最初分 离自大脑和垂体，其来源十分有限，体内外对碱性成纤维细胞生长因子应用的大量需求难以得到满足。在过去的几十年间，科学家已作出了广泛的努力，分别用大肠杆菌、毕赤酵母、大豆种子和蚕来表达重组人碱性成纤维细胞生长因子。然而，由于收益率较低、工艺复杂和不溶性等问题，结果都难以满足市场的需求，特别是难以满足细胞治疗和转化医学对人碱性成纤维细胞生长因子日渐增加的应用需求。
[0004]最近，已报道用水稻胚乳表达各种重组药物蛋白，包括人乳铁蛋白、人溶菌酶、rhIGF-Ι融合蛋白，人粒细胞-巨噬细胞群刺激因子和人血清白蛋白。这些结果表明，水稻胚乳表达系统具有成本效益、安全、易于扩大生产规模且相对于动物和其他植物细胞表达系统的生产工艺更加简便等优点。因此，水稻胚乳被认为是有利的大规模生产药用蛋白表达的平台。其优势对学术研究和工业应用都具有相当的吸引力。
[0005]如今，尚未有有关利用水稻胚乳系统表达碱性成纤维细胞生长因子的报道。
【发明内容】
[0006]本发明的一个目的是提供一种水稻遗传密码子优化的表达人碱性成纤维细胞生长因子基因(OsrbFGF基因)，其具有如SEQ ID N0.1所示的序列。
[0007]进一步地，还提供了含有所述OsrbFGF基因的载体，优选水稻胚乳细胞特异性表达载体，更优选具有如图3所示的结构的载体。
[0008]本发明另一个目的是提供含有所述OsrbFGF基因的载体在制备OsrbFGF转基因水稻种子中的应用。[0009]本发明的又一个目的是提供一种制备OsrbFGF转基因水稻种子的方法，包括以下步骤:
[0010](I)制备具有如SEQ ID N0.1所示序列的OsrbFGF基因；
[0011](2)构建水稻胚乳细胞特异性表达的OsrbFGF表达载体和选择性标记基因载体；
[0012](3)将步骤2所获得载体共转化到水稻品种的愈伤再生组织中；
[0013](4)培养所述愈伤再生组织，经筛选和诱导获得OsrbFGF转基因水稻植株；
[0014](5)培养OsrbFGF转基因水稻植株，获得OsrbFGF转因水稻种子。
[0015]进一步地，上述方法中所的OsrbFGF表达载体具有如图3所示的结构。
[0016]进一步地，上述方法中所述的选择性标记基因载体具有如图4所示的结构。
[0017]本发明的再一个目的是提供一种从OsrbFGF转基因水稻种子中分离纯化OsrbFGF的方法，包括以下步骤:
[0018](I)以OsrbFGF转基因水稻种子为原料制备OsrbFGF提取液；
[0019](2)用正压力过滤器对OsrbFGF提取液进行过滤，获得OsrbFGF滤液；
[0020](3)以Heparin 6Fast Flow柱分离纯化OsrbFGF滤液,采用两步洗杂法去除结合在Heparin 6Fast Flow柱上OsrbFGF滤液中的杂蛋白；
[0021](4)用OsrbFGF洗脱液对结合在Heparin 6Fast Flow柱上的OsrbFGF进行洗脱，获得高纯度的OsrbFGF。
[0022]具体地，上述方法包括以下步骤:
[0023](I)以OsrbFGF转基因水稻种子为原料，以包括50mM PB (pH 7.5)、lmM EDTAUmML-还原型谷胱甘肽、250mMNaCl的提取缓冲液制备OsrbFGF提取液；
[0024](2)分别用3 μ m和0.22 μ m的正压力过滤器对OsrbFGF提取液进行过滤，获得OsrbFGF 滤液；
[0025](3)用 Heparin 6Fast Flow柱分离纯化OsrbFGF滤液，并用包括250mMNaCl 和 ImML-还原型谷胱甘肽的50mM PB (pH 7.5)进行平衡；采用两步洗杂法去除OsrbFGF滤液中的杂蛋白；其中洗杂缓冲液I包括:50mM PB (pH 7.5)、600mM NaClUmM L-还原型谷胱甘肽，洗杂缓冲液II包括:50mM PB (pH7.5)、900mM NaCl、ImM L-还原型谷胱甘肽；
[0026](4)用OsrbFGF洗脱液对对结合在Heparin 6Fast Flow柱上的的OsrbFGF进行洗脱，获得高纯度的OsrbFGF，所述OsrbFGF洗脱缓冲液包括:IOmMTris-HCl (pH 7.5),1.7mMNaCl、ImML-还原型谷胱甘肽。
[0027]本发明构建了利于水稻胚乳表达的人bFGF基因并成功地在水稻中表达，制备和分离纯化出OsrbFGF蛋白，获得的OsrbFGF蛋白具有人碱性成纤维细胞生长因子的活性，为利用植物基因工程技术制备人细胞生长因子蛋白奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1是质粒p0sPMP2的结构示意图。
[0029]图2是质粒p0sPMP276的结构示意图。
[0030]图3是质粒p0sPMP277的结构示意图。
[0031]图4是质粒p0sPMP05的结构示意图。
[0032]图5是PCR扩增鉴别阳性转化植株的结果图；[0033]其中，从左到右第1-8泳道为阳性转化植株，Ne为阴性对照即非转基因TP309水稻基因组DNA为模板，Pc为阳性对照即p0sPMP276质粒为模板。
[0034]图6是Western杂交鉴定转基因水稻表达OsrbFGF的结果图；
[0035]其中，从左到右第1-8泳道为阳性转化植株，Ne为非转基因TP309水稻种子提取液，Pc为bFGF标准品。
[0036]图7显示了 OsrbFGF的表达水平。
[0037]图8显示了从转基因水稻种子中分离纯化OsrbFGF的结果；
[0038]其中，a显示了 OsrbFGF的回收率；b显示了纯化过程中SDS-PAGE的检测结果；c显示了纯化过程中Western杂交的鉴定结果。其中，图b和c中，从左到右的泳道M为分子标记，UF-5为5kDa超滤浓缩除盐，Elu为亲和洗脱，W2为第二次洗杂，Wl为第一次洗杂，Extra为bFGF粗提液。
[0039]图9显示了 OsrbFGF在体外和体内的活性分析结果；
[0040]其中，a显示了 OsrbFGF对NIH/3T3细胞增殖的影响；b显示了 OsrbFGF处理伤口后第2、4、6、8、10、12、14的愈合率；(^Pe分别显示了 OsrbFGF处理伤口后第3、7、14天CD68和PCNA的阳性数量；d和f分别显示了 CD68和PCNA的免疫射线自动照相结果。
【具体实施方式】
[0041]以下通过结合附图详细说明本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的举例说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
`[0042]实施例中所用到的各种试剂和仪器，除特别说明以外，均为普通市售。
[0043]【实施例1】水稻特异性表达重组人碱性成纤维细胞生长因子载体的构建及转基因水稻植株的制备
[0044]人bFGF基因(Genbank登记号:NM002006)由Heron Blue生物技术公司合成并根据水稻偏好的遗传密码子，将bFGF基因中61.54%的遗传密码子进行优化并使人bFGF基因中21.65%的核苷酸发生改变，优化后的人bFGF基因序列如SEQ ID N0.1所示，密码子优化前后的氨基酸序列没有变化。本实施例选用水稻特异性启动子Gtl3a及其信号肽来介导重组人bFGF基因在水稻胚乳细胞中的表达，用如图1所示的质粒p0sPMP2来构建水稻胚乳特异性表达盒。将所述合成的经密码子优化的人bFGF基因用SchI和XhoI酶切后克隆到p0sPMP2中构建成质粒p0sPMP276，如图2所示。然后构建用于根癌农杆菌介导转化的质粒，用HindIII和EcoRI酶切p0sPMP276，将长度为1983bp的含Gtl3a启动子及其信号肽序列还有经密码子优化的bFGF基因以及Nos终止子的整个表达盒，如SEQ ID N0.2所示，插入到双元表达载体JH2600，所获得的双元质粒命名为p0sPMP277，具体如图3所示。将双元质粒p0sPMP277转化到根癌农杆菌菌株EHA105 (美国Invitrogen公司),经根癌农杆菌介导共转化将所述p0sPMP277质粒和如图4所示的p0sPMP05质粒共转化到水稻品种TP309的愈伤再生组织中，具体方法参照(Daley, M.;Knauf, V.C.; Summerfelt, K.R.;Turner, J.C.Co-transformation with one agrobacterium tumefaciens strain containing twobinary plasmids as a method for producing marker-fee transgenic plants.PlantCellRep.1998.17，489-496.)，经培养、筛选和诱导后形成完整的植株，总获得58株独立的转化植株；然后，通过PCR扩增来鉴别阳性转化植株，用起始于Gtl3a信号肽的正向引物(5' -GAGGGTGTGGAGGCTCTTGT-3')和起始于Nos 终止子的反向引物序列(5' -GCCAGTGAATTCCCGATCTAGTAAC-3')来进行PCR扩增，结果如图5所示。
[0045]【实施例2】OsrbFGF的分析和鉴定
[0046]本实施例用Western杂交来检测所获得的转基因水稻表达的bFGF (本发明称OsrbFGF)是否聚集在水稻胚乳细胞中。分别取经PCR鉴定为阳性的转基因水稻植株的Tl种子lOOmg，用Iml的提取缓冲液(50mM PB, pH 7.5，ImM EDTA, ImM L-还原型谷胱甘肽，250mMNaCl)在4° C下研磨60分钟，然后在10620xg的条件下离心10分钟，获得蛋白粗提液。用15% SDS-PAGE分离40 μ I蛋白粗提液和350ng源于Ecoli的重组bFGF，并将凝胶转移到硝酸纤维素膜上。使用碱性成纤维细胞生长因子的兔多抗(Abeam，英国)和碱性磷酸酶山羊抗兔IgG (ZSGB-BIO，中国)，以氯化硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP，B10SHARP，中国)为底物进行目标蛋白的检测。结果显示，有35株转基因水稻表达的OsrbFGF积累在水稻胚乳中，结果图6所示。用Image-proPlus软件对最终的Western杂交结果进行分析，结果显示OsrbFGF的表达水平为每公斤粗米生产99.11-185.66mg0srbFGF，如图 7 所示。
[0047]另外，本实施例还进一步采用Southern杂交鉴定转基因水稻植株，分别取约200mg转基因水稻的嫩叶，用液氮研磨并用快捷型植物基因组DNA提取系统(中国天根生物科技有限公司)提取基因组DNA。分别用EcoR1、HindIII或用EcoRI和HindIII (新英格兰生物公司)在37° C过夜酶切所述基因组DNA，然后0.8%琼脂糖凝胶进行分离；将凝胶转移到 MILLIP0RE NY+膜后，按照罗氏 DIG High Prime DNA Labeling and DetectionStarter Kit I 的指示进行杂交，用以下引物(5’ -GCATCCATAAATCGCCCCATAG-3’ 和5’-GCCAGTGAATTCCCGATCTAGTAAC-3’)扩增源自bFGF编码区的长度为824bp的探针。结果显示:当用EcoRI或HindIII消化酶酶切时均检测到单个片段，该结果与遗传分析的结果一致；EcoRI和HindIII双酶切获得的单个条带与整个表达盒相比较，结果显示所述农杆菌双向载体存在于整个表达盒中。
[0048]【实施例3】OsrbFGF的分离和纯化
`[0049]在室温下，用提取缓冲液(50mM PB, pH 7.5, ImM EDTA, ImM L-还原型谷胱甘肽，250mMNaCl)研磨并提取转基因水稻的种子I小时，获得的提取液分别通过3 μ m和0.22 μ m的正压力过滤器进行过虑澄清，然后将滤液加到Heparin 6Fast Flow柱(GE Healthcare,www.gelifesciences.com),并用含有 250mM NaCl 和 ImM L-还原型谷胱甘妝的 50mM PB 进行平衡；采用两步洗杂法去除杂蛋白并增加OsrbFGF的回收率，其中洗杂缓冲液I为(50mMPB (pH 7.5)，600mM NaCl, ImML-还原型谷胱甘肽)，洗杂缓冲液 II 为(50mM PB (pH 7.5)，900mM NaCl, ImML-还原型谷胱甘妝)；洗杂后，结合于Heparin 6Fast Flow柱上的OsrbFGF用洗脱缓冲液(IOmM Tris-HCKpH 7.5)，1.7mM NaCl, ImML-还原型谷胱甘肽)进行洗脱，获得高纯度的OsrbFGF蛋白，其中OsrbFGF的回收率如图8a所示，各洗脱步骤的SDS-PAGE检测结果及Western杂交分析结果分别如图8b和8c所示。在冻干之前，先将OsrbFGF洗脱液进行浓缩并用Pellicon XL (Millipore公司)5kD的超滤过滤器进行部分脱盐，然后用Viva Flow 50 (Sartorius) IOOkD的超滤过滤器去除内毒素,所获得的OsrbFGF最终纯度达95%以上且内毒素含量低于IEU/μ g。最后，OsrbFGF在OsrHSA的保护下进行冻干(1:50，w/w)。[0050]【实施例4】OsrbFGF对NIH/3T3细胞增殖的影响
[0051]在含有DMEM培养基并补以1.5% FBS和I %青霉素和链霉素(P/S)的96孔平板中培养NIH/3T3细胞，NIH/3T3细胞的初始浓度为1χ105_5χ105个/ml，于37°C、5% CO2下孵育24小时。然后除去培养基并用PBS洗涤细胞，在37°C下用0.25%的胰蛋白酶处理3分钟。将处理后的细胞重悬于DMEM培养基中，补以1.5% FBS和I % P/S，然后在800rpm下离心3分钟。除去上清液，将细胞重悬于含有1.5% FBS和I % P/S的DMEM培养基中。以4000个/ml的浓度将NIH/3T3细胞接种于96孔平板中，于37°C、5% CO2下孵育24小时。然后用补以0.75% FBS的DMEM培养基洗涤细胞并于37°C、5% CO2下再孵育24小时。最后，细胞在含有不同OsrbFGF浓度(200 μ I/孔)的DMEM培养基孵育48小时，加入20 μ I的MTT (溴化噻唑蓝四氮唑)溶液并于37°C下再孵育4小时，将微量滴定板置于VersaMax (MolecularDevices,美国)中于490nm处进行读数。所有数据均用GraphPadPrism 5软件进行分析且所有实验均重复三次。结果显示，在OsrbFGF浓度为6pg-5ng/ml的范围内，显示出浓度依赖性的NIH/3T3细胞增殖作用，达到1.15X106IU/mg，如图9a所示；表明在体外OsrbFGF具有促进NIH/3T3细胞增殖的活性。说明本发明的OsrbFGF具有与商业rbFGF相同的生物活性。
[0052]【实施例5】OsrbFGF对伤口愈合的影响
[0053]取体重为200~250克的雌性SD大鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)，随机分成4组并制备成切除伤口夹板模型，具体方法参考(Galiano，R.D.;Michaels, V.;Dobryansky, Μ.;Levine, J.P.;Gurtner, G.C.Quantitative and reproducible murinemodel of excisional wound healing, ffound Repair Regen.200412, 485-492.)? 以三个 OsrbFGF 剂量组:2000ng/ml 组(n=15)、500ng/ml, (n=15)、125ng/ml 组(n=15)和一个生理盐水阴性对照组(n=15)对应处理上述随机分组的4组模型以测试伤口的愈合率。分别在第O天，第2天，第4天 ，第6天，第8天，第10天，12天及14天的观察伤□的闭合情况并按(Wu, Y.; Chen, L.; Scott, P.G.; Tredget, E.E.Mesenchymal stem cells enhancewound healing through differentiation and angiogenesis.Stem Cells 2007,25,2648-2659.)所述的方法进行伤口愈合率[(原创面-实际创面)/原创面X 100]、病理和免疫组化观察。结果表示，伤口愈合率对OsrbFGF有剂量依赖性，其中在治疗的前8天，低剂量比高剂量如500ng和2000ng作用更为显著，如图9b所示。通常，当受伤的皮肤康复时能促进上皮形成和⑶68表达以及细胞核抗原(PCNA)的增殖。因此本实施例还检测了治疗第3天、第7天和第14天时PCNA和⑶68的表达，结果显示，与阴性对照组相比，于治疗的第3天和第7天，OsrbFGF剂量组的PCNA和⑶68表达显著增加，而在治疗第14天时，OsrbFGF剂量组的PCNA和⑶68表达水平却低于阴性对照组，如图9c-9f所示。在治疗的早期阶段，OsrbFGF可以通过刺激细胞的增殖和促进⑶68和PCNA的增殖从而加速伤口愈合，然后，通过降低细胞、CD68和PCNA的表达以防止在治疗的后期阶段产生疤痕和伤口闭合时的细胞增殖。
【权利要求】
1.一种水稻遗传密码子优化的表达人碱性成纤维细胞生长因子的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一种含有权利要求1所述表达人碱性成纤维细胞生长因子基因的重组表达载体。
3.权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体是水稻胚乳细胞特异性表达载体。
4.权利要求3所述载体，其特征在于，所述载体具有如图3所示的结构。
5.权利要求2-4中任一项所述的载体在制备转基因水稻种子中的应用，其中所述转基因水稻种子表达人碱性成纤维细胞生长因子。
6.一种制备表达人碱性成纤维细胞生长因子的转基因水稻种子的方法，包括以下步骤: (1)构建具有如SEQID N0.1所示序列的表达人碱性成纤维细胞生长因子的OsrbFGF基因; (2)构建水稻胚乳细胞特异性表达的OsrbFGF表达载体和选择性标记基因载体； (3)将步骤(2)获得载体共转化到水稻品种的愈伤再生组织中； (4)培养所述愈伤再生组织，经筛选和诱导获得表达人碱性成纤维细胞生长因子的OsrbFGF转基因水稻植株； (5)培育OsrbFGF转基因水稻植株，获得表达人碱性成纤维细胞生长因子的OsrbFGF转基因水稻种子。
7.权利要求6所述的方法，其`特征在于，所述OsrbFGF表达载体具有如图3所示的结构。
8.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述选择性标记基因载体具有如图4所示的结构。
9.一种从OsrbFGF转基因水稻种子中分离纯化人碱性成纤维细胞生长因子的方法，包括以下步骤: (1)以OsrbFGF转基因水稻种子为原料制备OsrbFGF提取液； (2)用正压力过滤器对OsrbFGF提取液进行过滤，获得OsrbFGF滤液； (3)以Heparin6 Fast Flow柱分离纯化OsrbFGF滤液；采用两步洗杂法去除结合在Heparin 6 Fast Flow柱上OsrbFGF滤液中的杂蛋白； (4)用OsrbFGF洗脱液对结合在Heparin6Fast Flow柱上的OsrbFGF进行洗脱,获得高纯度的OsrbFGF。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)以OsrbFGF转基因水稻种子为原料，以包括50mMPBCpH 7.5)、lmM EDTAUmM L-还原型谷胱甘肽、250mMNaCl的提取缓冲液制备OsrbFGF提取液； (2)分别用3μ m和0.22 μ m的正压力过滤器对OsrbFGF提取液进行过滤，获得OsrbFGF滤液； (3)用Heparin6 Fast Flow柱分离纯化OsrbFGF滤液，并用包括250mMNaCl和ImML-还原型谷胱甘肽的50mM PB (pH 7.5)进行平衡；采用两步洗杂法去除结合在Ifeparin 6Fast Flow柱上的OsrbFGF滤液中杂蛋白，其中洗杂缓冲液I包括:50mM PBCpH 7.5)、600mMNaClUmM L-还原型谷胱甘肽，洗杂缓冲液II包括:50mM PB (pH 7.5)、900mM NaClUmML-还原型谷胱甘肽；(4)用OsrbFGF洗脱液对结合在Heparin 6 Fast Flow上的OsrbFGF进行洗脱，获得高纯度的人碱性成纤维细胞生长因子蛋白，所述O srbFGF洗脱缓冲液包括:I OmMTris-HCKpH 7.5)、1.7mM NaCl、ImM`L-还原型谷胱甘肽。
【文档编号】A01H5/00GK103865932SQ201210534797
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月11日 优先权日:2012年12月11日
【发明者】杨代常, 欧吉权, 安娜 申请人:武汉禾元生物科技有限公司