专利名称：一种人参内生多粘类芽孢杆菌生物防治菌剂制备方法
技术领域：
本发明涉及一种人参内生多粘类芽孢杆菌生物防治菌剂制备方法，属生物技术领域。
背景技术：
随着环境压力的增大和人们对健康及食品安全要求的提高，微生物农药受到越来越多的重视。目前，用于生防细菌的种类有:枯草芽孢杆菌{Bacillus subtilis)、多粘芽抱杆菌^Paenibacillus、腊状芽抱杆菌{Bacillus cereus)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)和短小芽抱杆菌(Jiacilluspumilis)等。许多生防细菌产生的拮抗物质，抗菌作用是广谱的。多黏类芽孢杆菌{Paenibacillus polymyxa)中很多菌株作为重要的生防资源，用于多种植物病害的生物防治，美国环境保护署已将其列为可商业上应用的微生物种类之一，我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种。我国许多学者分尚到多个多黏类芽孢杆菌生防菌株，分别对黄瓜枯萎病、番爺灰霉病、稻痕病、蒸枝霜疫霉病等具有较好地抑制作用，但现已报道的多黏类芽孢杆菌主要分离自土壤，少数为植物内生菌，本发明采用人参内生多粘类芽孢杆菌菌株是从人参植株中分离获得的，该菌株的发酵液对人参黑斑病菌panax Whetz )> 参.腐舊iCyIindrocarpondestructans Zinns)、人参菌核病菌(.Sclerotinia schinseng^ang)> 人参立才古病菌{Rhizoctonia solani Kuhn)、人参根腐病菌solani App)及人参细菌性软腐病{Erwinia carotovora subsp)等病原菌具有明显的防病效果,表现了良好的生防前景,为了进一步较好地开发利用该菌株进行植物病害的生物防治，本发明系统研究了该菌株的发酵条件，旨在为该菌株生物农药和制剂的开发提供依据。
发明内容
本发明提供一种人参内生多粘类芽孢杆菌生物防治菌剂制备方法，该菌株抑菌谱广、抑菌能力强，用于防治人参、西洋参等植物的病害。该方法可应用在制备防治人参、西洋参等植物病害的菌剂或制剂中。本发明所述人参内生多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa),已于2013年2月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC 7250。本发明所述人参内生多粘类芽孢杆菌制剂的制备方法:将保存的人参内生多粘类芽孢杆菌接入灭菌的PDA斜面培养基，25°C -35°C培养24h_48h，进行人参内生多粘类芽孢杆菌菌种活化。挑取活化的人参内生多粘类芽孢杆菌菌种，接入灭菌的PDB培养基中，120rpm/min, 25°C培养24h_48h，培养到OD6tltl值为0.5左右，得种子液。将人参内生多粘类芽孢杆菌种子液按体积比2%接种量，接种入灭菌的PDB培养基中，120rpm/min，25°C培养24h-48h，芽胞形成85%以上时，得发酵液。将人参内生多粘类芽孢杆菌发酵液经细菌计数后，调整到108CFU/ml，包装，阴凉避光保存。
具体实施例方式本发明提供了人参内生多粘类芽孢杆菌制剂的制备方法，本发明领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改进工艺参数实现，所有类似的替换和改动对本领域技术人员是显而易见的，都视为本发明。本发明所述人人参内生多粘类芽孢杆菌制剂的制备方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面结合实施例，进一步阐述本发明。实施例1本发明人参内生多粘类芽孢杆菌生防菌菌剂的制备
1、菌种:人参内生多粘类芽孢杆菌polymyxa),已于2013年2月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 7250。2、人参内生多粘类芽孢杆菌菌种活化
将保存的人参内生多粘类芽孢杆菌接入灭菌的P D A斜面培养基，2 5 °C - 3 5 °C培养24h-48h。PDA培养基制备方法:马铃薯洗净去皮后称取200g，切成小块，加蒸馏水煮至沸腾后20-30min (马铃薯能用玻璃棒戳破即可)，然后用四层纱布过滤，向滤液中加20g葡萄糖及20g琼脂粉，继续加热至溶解，加蒸馏水至1000ml，115°C下高压灭菌20min。温度降至50°C左右时倒入试管中，制成斜面培养基，凝固后倒置24h无菌生长即可使用。3、人参内生多粘类芽孢杆菌种子液制备
挑取活化的人参内生多粘类芽孢杆菌菌种，接入灭菌的PDB培养基中，120rpm/min, 25°C培养24h_48h，培养到OD6tltl值为0.5左右，得种子液。PDB培养基制备方法:马铃薯洗净去皮后称取200g，切成小块，加蒸馏水煮至沸腾后20-30min(马铃薯能用玻璃棒戳破即可)，然后用四层纱布过滤，向滤液中加20g葡萄糖，继续加热至溶解，加蒸馏水至1000ml，温度降至50°C左右时倒入三角瓶中，250ml三角瓶中加50ml培养基，包扎后115°C下高压灭菌20min，冷却后备用。4、人参内生多粘类芽孢杆菌发酵液制备
(1)培养基优化
将人参内生多粘类芽孢杆菌种子液按体积比2%接种量，分别接种入灭菌的PDB培养基、发酵培养基、NB培养基、LB培养基和YEH)培养基中，每个培养基做4个重复。120rpm/min, 25 °C，培养48h后测定菌株生物量。结果见表1，由表I可见，人参内生多粘类芽孢杆菌发酵液制备的最优培养基为PDB培养基。表I培养基对菌株生物量的影响
权利要求
1.一种人参内生多粘类芽孢杆菌生物防治菌剂制备方法，即防治人参、西洋参等植物病害的生物菌剂的制备方法。
2.按权利要求I所述，菌种培养本发明所用菌种为人参内生多粘类芽孢杆菌{Paenibacillus polymyxa )保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为 CGMCC 7250。
3.将保存的人参内生多粘类芽孢杆菌接入灭菌的PDA斜面培养基，25°C-35°C培养24h-48h，活化人参内生多粘类芽孢杆菌菌种。
4.按权利要求I所述，种子液制备挑取活化的人参内生多粘类芽孢杆菌菌种，接入灭菌的PDB培养基中，120rpm/min，25°C培养24h_48h，培养到OD6tltl值为O. 5左右，得种子液。
5.按权利要求I所述，发酵液制备将人参内生多粘类芽孢杆菌种子液按体积比2%接种量，接种入灭菌的PDB培养基中，120rpm/min, 25°C培养24h_48h，芽胞形成85%以上时，得发酵液。
6.按权利要求I所述，人参内生多粘类芽孢杆菌生物防治菌剂成品将人参内生多粘类芽孢杆菌发酵液经细菌计数后，调整到108CFU/ml，包装，阴凉避光保存。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域,具体公开了一种人参内生多粘类芽孢杆菌生物防治菌剂制备方法。本发明所用菌种为人参内生多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，已于2013年2月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.7250。本发明方法包括人参内生多粘类芽孢杆菌菌种培养，种子液制备，发酵液制备，成品制备。本发明生物防治菌剂生产操作简单、成本低、菌体发酵完全、芽孢形成率高，为人参内生多粘类芽孢杆菌大规模培养和开发利用打下坚实基础。
文档编号A01N63/02GK103250741SQ20131006769
公开日2013年8月21日 申请日期2013年3月5日 优先权日2013年3月5日
发明者郜玉钢, 张连学, 臧埔, 卢宗志, 祝彦海, 赵岩, 杨鹤, 王玉方, 李 学, 赵雪亮, 李丽 申请人:吉林农业大学