专利名称：一种用于牛肝菌孢子萌发的培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及菌根性食用菌孢子的培养方法，具体地说，本发明涉及一种用于使牛肝菌孢子萌发的培养基和采用所述培养基培养牛肝菌菌丝体的方法。
背景技术：
牛肝菌属于担子菌亚门伞菌目中的牛肝菌科(Boletaceae)，除少数品种有毒或味苦而不能食用外，大部分品种均可食用。主要有白、黄、黑牛肝菌。白牛肝菌味道鲜美，营养丰富。该菌菌体较大，肉肥厚，柄粗壮，食味香甜可ロ，营养丰富，是ー种世界性著名食用菌。云南省各族群众喜爱采集鲜菌烹调食用。西欧各国也有广泛食用白牛肝菌的习惯，除新鮮的作菜外，大部分切片干燥，加工成各种小包装，用来配制汤料或做成酱油浸膏，也有制成盐腌品食用。其中，点柄粘盖牛肝菌(Suillus granulatus (L.:Fr.) 0.Kuntce)属于属于粘盖牛肝菌属，于夏秋季松林及混交林地上散生、群生或丛生。其子实体可食用，富含多种营养，味道鲜美。点柄粘盖牛肝菌主要与油松形成外生菌根，是油松林地的优势菌根性食用菌。菌根食用菌(Edible mycorrhizal fungi, EMF)是对森林外生菌根(Ectomycorrhizal fungi,ECM fungi)真菌中具有食用价值的大型真菌的统称。菌根食用菌的生长需要与植物根系建立共生关系、形成共生体菌根后，通过菌根从树木根系吸取自身生长所需营养物质，同时又向树木提供其生长发育所需的其他营养物质或水分等，条件适宜时产生子实体。很多名贵野生菌都是菌根性食用菌，因为它们所具有的高营养价值、药用价值以及重要的生态作用，使其成为食用菌和菌根学研究中最活跃的领域，也是极具挑战性的前沿学科之一。关于菌根食用菌能 够栽培的研究报道较少，目前只有松乳菇林地栽培已获成功。食用菌孢子是重要的繁殖材料，但孢子的萌发因其所属的类别不同而有所不同，有关点柄粘盖牛肝菌孢子的研究少有报道。采用孢子萌发后的菌丝体作为菌种是野生菌驯化菌种来源的可靠保障。为了驯化栽培点柄粘盖牛肝菌，需要进行人工大量培养菌种，而找到使其孢子萌发的适宜培养基无疑是驯化的重要开端。
发明内容
为了解决上述的问题，本发明人对点柄粘盖牛肝菌的生物学习性进行了多年连续的调查和采集。在获得纯净孢子的基础上，发明人搜集了大量有关菌根性食用菌菌丝培养的培养基配方，并结合点柄粘盖牛肝菌的生长环境和发生规律，制定了几种配方，反复接种观察，最終得到了适宜于点柄粘盖牛肝菌孢子萌发的培养基。本发明是通过如下技术方案来实现的。1、一种用于使点柄粘盖牛肝菌孢子萌发的培养基，其中，所述培养基包含:I)血红铆钉菇干品；2) PDA培养基；和
3)水。2、如技术方案I所述的培养基，其中，以所述水的重量计，用以配制使点柄粘盖牛肝菌孢子萌发的培养基的所述血红铆钉菇干品的含量为4%至6%。3、如技术方案I或2所述的方法，其中，以所述水的重量计，用以配制使点柄粘盖牛肝菌孢子萌发的培养基的所述PDA培养基的含量为20%至30%。4、一种配制技术方案I至3中任一项所述培养基的方法，其中，所述方法包括如下步骤:I)血红铆钉菇煮制步骤:取血红铆钉菇，煮制20分钟至40分钟，得到血红铆钉菇蒸煮液；2)过滤步骤:将所述血红铆钉菇蒸煮液过滤，得到血红铆钉菇滤液；3) PDA培养基煮制步骤:使用所述血红铆钉菇滤液煮制所述PDA培养基，得到用于使菌孢子萌发的所述培养基。5、如技术方案4所述的方法，其中，所述方法进ー步包括将血红铆钉菇煮制步骤制得的所述培养基于120°C至121°C进行30分钟灭菌处理的灭菌处理步骤。6、ー种使菌孢子萌发的方法，所述方法使用技术方案I至3中任一项所述的培养基或者技术方案4或5所述方法制得的所述培养基进行。7、如技术方案6所述的方法，其中，所述方法包括如下步骤:I)倒板步骤:将经过灭菌处理的所述培养基倒入培养皿；2)孢子悬浮液制备步骤:将采集到的点柄粘盖牛肝菌孢子制备成孢子悬浮液；3)孢子涂抹步骤:使用移液器将所述孢子悬浮液涂抹在所述培养皿上；和4)培养萌发步骤:将所述培养皿放置在培养箱中培养，使得所述点柄粘盖牛肝菌孢子萌发。8、如技术方案7所述的方法，其中，所述孢子悬浮液的浓度为10倍至100倍稀释液。9、如技术方案7或8所述的方法，其中，每个所述培养皿的所述培养基的涂抹量为40 u I M 60 u I。10、如技术方案7至9中任一项所述的方法，其中，所述培养萌发步骤在20°C至30°C的温度下培养。11、如技术方案10所述的方法，其中，所述培养萌发步骤依次包括正置培养培养和倒置培养。12、如技术方案11所述的方法，其中所述正置培养时间为3天至5天。本发明综合考虑了萌发过程需要的培养基配方、无菌孢子悬浮液制备、孢子接种、培养萌发等，并充分考虑了各环节彼此之间的相关性，建立起适用于点柄粘盖牛肝菌孢子萌发的培养基体系。本发明的培养基体系具有配方简单和可操作性强等优点，可以使所述点柄粘盖牛肝菌孢子菌种容易获得，菌丝生长粗壮浓密，菌落形态整齐。为实现点柄粘盖牛肝菌人工驯化栽培奠定了基础。
为了更加便于理解本发明，本文在此提供如下附图，但是这些附图只用于说明目的，而不应理解为用于限定本发明，其中:图1显示了采用本发明的培养基(M2)使点柄粘盖牛肝菌孢子萌发的萌发初期照片。图2显示了采用本发明的培养基(M2)使点柄粘盖牛肝菌孢子萌发的萌发中期照片。图3显示了采用本发明的培养基(M2)使点柄粘盖牛肝菌孢子萌发的萌发后期照片。图4显示了在采用本发明的培养基(M2)使点柄粘盖牛肝菌孢子萌发后的第10天，将单菌落转接新鮮M2培养基中继续培养所得到的菌丝体。图5显示了图4中所述的菌丝体的放大图。
具体实施例方式在第一方面，本发明提供了一种用于使点柄粘盖牛肝菌孢子萌发的培养基，所述培养基包含I)血红铆钉菇干品；2)PDA培养基；和3)水。血红铆钉菇，东北地区俗称红蘑、松树伞、松蘑等。红蘑在真菌分类上属于担子菌亚门层菌纲、伞菌目、铆钉菇科、铆钉菇属，子实体散生、群生或单生。肉质肥嫩、鲜美可ロ，长期以来作为名贵的食用真菌，深受人们的喜爱。而且，本发明人发现血红铆钉菇含有丰富的营养成分。据测定，每IOOg血红铆钉菇干品的营养成分大致为:蛋白质:18.4克；脂肪:
0.7克；碳水化合物:58.1克；膳食纤维:24.6克；核黄素:1.16毫克；钙:14毫克；磷:35毫克；钾:169晕克；钠:4.3晕克； 铁:235.1晕克；猛:3.75晕克；锋:3.14晕克；硒:91.7晕克；铜:0.51毫克M:3.75毫克。PDA培养基是马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称(PDA, Potato Dextrose Agar),由200g马铃薯、20g葡萄糖和20g琼脂制得，可以通过市售获得。本发明人意外地发现，采用血红铆钉菇和PDA培养基的组合可以使点柄粘盖牛肝菌孢子能够很好的萌发。在一些优选的实施方式中，以所述水的重量计，用于煮制所述培养基的所述血红铆钉燕干品的重量为4%至6%,例如为4%、5%或者6%。在一些优选的实施方式中，以所述水的重量计，用于煮制本发明的培养基的所述PDA培养基的重量为20%至30%。优选为22%至28%，最优选为24%。例如，所述含量可以为 21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或 30%。本文所述的 PDA 培养基的重量为马铃薯、葡萄糖和琼脂的总重量。在第二方面，本发明提供了一种配制以上所述培养基的方法，其中，所述方法包括如下步骤:I)血红铆钉菇煮制步骤:取血红铆钉菇，煮制20分钟至40分钟，得到血红铆钉菇蒸煮液；2)过滤步骤:将所述血红铆钉菇蒸煮液过滤，得到血红铆钉菇滤液；3) PDA培养基煮制步骤:使用所述血红铆钉菇滤液煮制所述PDA培养基，得到用于使菌孢子萌发的所述培养基。
PDA培养基的制备处于本领域技术人员应当具有的技能范围之内。例如，将50g血红铆钉菇干品放入IOOOml的水中，煮沸30分钟左右(例如25分钟至35分钟)，过滤得到血红铆钉燕煮液，用此煮液1000ml,放入马铃薯小块(黄豆粒大小小块,例如3mm至5mmX3mm至5mm X3mm至5mm小块，如4mm X4mm X4mm小块)200g,煮沸5分钟左右(例如4分钟至6分钟)，过滤弃去马铃薯残渣，加入琼脂20g和葡萄糖20g，用水补充至1000ml，煮沸即得到血红铆钉菇煮液+PDA培养基(即本发明的培养基，例如实施例中编为M2培养基)。在一些优选的实施方式中，所述方法进ー步包括将血红铆钉菇煮制步骤制得的所述培养基于120°C至121°C进行30分钟灭菌处理的灭菌处理步骤。在第三方面，本发明还提供了由所述方法制得的培养基。在第四方面，本发明还提供了一种使点柄粘盖牛肝菌孢子萌发的方法，所述方法使用以上所述的培养基或者由以上所述方法制得的所述培养基进行。在一些优选的实施方式中，使点柄粘盖牛肝菌的所述方法包括如下步骤:1)倒板步骤:将经过灭菌处理的所述培养基倒入培养皿；2)孢子悬浮液制备步骤:将采集到的点柄粘盖牛肝菌孢子制备成孢子悬浮液；3)孢子涂抹步骤:使用移液器将所述孢子悬浮液涂抹在所述培养皿上；和4)培养萌发步骤:将所述培养皿放置在培养箱中培养，使得所述点柄粘盖牛肝菌孢子萌发。在一些优选的实施方式中，所述孢子悬浮液为例如由本发明的方法采集得到的一张包含孢子的过滤纸条带，用3ml的无菌蒸馏水将孢子条带上的孢子冲洗至无菌容器中，冲洗至条带无色为止，将所得孢子悬浮液溶液制备成10倍至100倍稀释液。例如为10、20、30、40、50、60、70、80、90 或 100 倍稀释液。在一些优选的实施方式中，每个所述培养皿的所述培养基的涂抹量为40iU至60 u I,优选为 50 u 10 例如可以为 40 u I>41 u I>42 u I>43 u I>44 u I>45 u I>46 u I>47 u I>48 u I>49 u I>50 u 1>51 u 1>52 u 1>53 u 1>54 u 1>55 u 1>56 u 1>57 u 1>58 u 1>59 u I 或60 u I。在一些优选的实施方式中，所述培养萌发步骤在20°C至30°C的温度下培养。在更优选的一些实施方式中，所述培养萌发步骤依次包括正置培养(即培养皿的盖子在上方)和倒置培养(即，将培养皿倒置，使盖子在下方)。在又一些优选的实施方式中，所述正置培养时间为3天至5天，例如为3天、4天或者5天。顺便说明的是，本发明所使用的数值范围意指包括该范围的端值和该范围内任意数值以及任意子范围。实施例下文将通过实施例来对本发明进行进一步的说明，不过这些实施例仅为说明目的，不应解释为对本发明范围的限制。本发明所用的制剂均购自北京化学试剂公司。
_0]点柄粘盖牛肝菌孢子的采集采集前一天取250ml的广ロ玻璃瓶和瓶盖若干个，瓶底部铺圆形滤纸ー张，封盖；准备20cm X20cm长宽的牛皮纸或报纸若干张、橡皮筋若干个、灭菌刀片5_10个、剪刀和镊子。将上述物品于121°C高压灭菌30分钟，置于用酒精表面消毒的塑料常温箱内备用。还准备表面酒精消毒的保温箱1-2个。所有用具均为市售产品，没有本发明的专用的特殊产品。在7至9月份，在油松林地选择尚未散发孢子的无虫的(菌孔刚刚张开、肉眼可见，请參照图1和2)点柄粘盖牛肝菌子实体，用灭菌刀片小心取下菌盖，分别放在灭菌后的采集瓶瓶ロ，子实体上再盖上灭菌的报纸或牛皮纸，用橡皮筋固定后快速置于干净的保温箱内，保温箱中的温度保持不超过15°C。将保温箱和塑料常温箱都带回实验室。将放有子实体的广ロ玻璃瓶置于温度设为5°C的冰箱内。3小时后，在无菌条件下取出滤纸，剪成条带，放于灭菌的试管内。将试管保存于温度设为5°C的冰箱内。凃抹梓种在超净工作台中，用无菌镊子夹取保存于试管的含有孢子的一个条带，用3ml的无菌蒸馏水将孢子条上的孢子冲洗至IOOml无菌三角瓶中，冲洗至孢子条无色为止，得到孢子悬浮液，摇匀备用。取悬浮液100 u I加入到900 u I无菌水中即得KT1孢子悬浮液，摇勻，用100 u I无菌吸管吸取KT1孢子悬浮液放入到900 u I无菌水管中得到10_2孢子悬浮液，按照相同的方式依次制得KT1至10_5连续稀释至10_5。在血球计数器观察，发现适合于接种的孢子悬浮液为10_3孢子悬浮液。用无菌移液器吸取10倍稀释的孢子悬浮液50 Ul加入到空白培养基中心位置上，并用灭菌处理的玻璃刮铲将孢子悬浮液涂抹开，使孢子悬浮液均匀的分布于培养基表面，但不要划破培养基。将孢子悬浮液分别接种于6种培养基中，每种培养基接种15个皿。:1 养基所述6种培养基的配方如下:
Ml (/L):PDA 培养基M2 (/L) =PDA+血红铆钉菇干品50gM3 (/L):PDA+麦麸 5OgM4 (/L):PDA+菌塘土 IOOg菌塘土需提前一天用水浸泡，取浸提液制作培养基。M5 (/L) =PDA综合培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，KH2P043g,MgSO4 7H201.5g，VB1 微量)M6 (/L):改良 MMN 培养基(CaCl2 2H200.05g, NaCl0.025g, KH2PO40.5g,(NH4)2HPO40.25g，MgSO4 *7H200.15g，FeCl3(l%溶液)1.2ml，麦芽粉 3g，硫胺素 0.0Olg，葡萄糖 10g，琼脂 20g，pH5.8)培养萌发将接种后的培养皿放置于25°C恒温培养箱内暗培养4天后，再将其改为倒置培养，并观察记录孢子萌发的时间、菌丝长势、萌发率等情況。结果发现，点柄粘盖牛肝菌的孢子在不同培养基上均可萌发，但萌发情况有所不同。孢子萌发需要时间最短的是M6培养基28d，最长是Ml培养基需36d。在M2、M3、M6培养基上供试的15个皿都有孢子萌发，高于其他培养基。但M6培养基中单个培养皿内萌发的菌落数少于M2与M3，且萌发形成的菌落菌丝稀疏。孢子在M2与M3培养基上均可萌发产生大量菌落，但孢子在M2上萌发时间短于M3，且形成的菌落形态整齐，菌丝粗壮浓密。因此，比较而言，M2培养基最适宜点柄粘盖牛肝菌孢子的萌发，采用M2培养基的不同萌发时期的菌落形态如图1至3所示。
在孢子萌发后第10天，挑选M2培养基组中长势良好的单菌落转接至新鮮M2培养基中继续培养，获得点柄粘盖牛肝菌孢子分离菌丝体(图4和图5)。表I不同培养基对孢子萌发的影响
权利要求
1.一种用于使点柄粘盖牛肝菌萌发的培养基，其中，所述培养基包含: 1)血红柳钉姑干品； 2)PDA培养基；和 3)水。
2.如权利要求1所述的培养基，其中，以所述水的重量计，用于煮制使点柄粘盖牛肝菌萌发的培养基的所述血红铆钉菇干品的重量为4%至6%。
3.如权利要求1或2所述的培养基，其中，以所述水的重量计，用于煮制使点柄粘盖牛肝菌萌发的培养基的所述PDA培养基的重量为20%至30%。
4.ー种配制权利要求1至3中任一项所述培养基的方法，其中，所述方法包括如下步骤: 1)血红铆钉菇煮制步骤:取血红铆钉菇，煮制20分钟至40分钟，得到血红铆钉菇蒸煮液； 2)过滤步骤:将所述血红铆钉菇蒸煮液过滤，得到血红铆钉菇滤液； 3)PDA培养基煮制步骤:使用所述血红铆钉菇滤液煮制所述PDA培养基，得到用于使菌孢子萌发的所述培养基。
5.如权利要求4所 述的方法，其中，所述方法进ー步包括将血红铆钉菇煮制步骤制得的所述培养基于120°C至121°C进行30分钟灭菌处理的灭菌处理步骤。
6.由权利要求4或5所述方法制得的培养基。
7.一种使点柄粘盖牛肝菌孢子萌发的方法，所述方法使用权利要求1至3中任ー项所述的培养基或者权利要求4或5所述方法制得的所述培养基进行。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述方法包括如下步骤: 1)倒板步骤:将经过灭菌处理的所述培养基倒入培养皿； 2)孢子悬浮液制备步骤:将采集到的点柄粘盖牛肝菌孢子制备成孢子悬浮液； 3)孢子涂抹步骤:使用移液器和玻璃刮铲将所述孢子悬浮液涂抹在所述培养皿上；和 4)培养萌发步骤:将所述培养皿放置在培养箱中培养，使得所述点柄粘盖牛肝菌孢子萌发。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述培养萌发步骤在20°C至30°C的温度下培养。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述培养萌发步骤依次包括正置培养和倒置培养，优选所述正置培养时间为3天至5天。
全文摘要
本发明提供了一种用于牛肝菌孢子萌发的培养基，所述培养基包含血红铆钉菇干品、PDA培养基和水。本发明还提供了配制所述培养基的方法，采用所述培养基使牛肝菌孢子萌发的方法。所述培养基具有配方简单、易于配制、孢子萌发多、形成的菌落形态整齐、菌丝粗壮浓密等优点。
文档编号C05G1/00GK103113148SQ20131007380
公开日2013年5月22日 申请日期2013年3月8日 优先权日2013年3月8日
发明者陈青君, 牛玉蓉, 张国庆, 程继鸿, 王明花, 杨瑞 申请人:北京农学院