一种解淀粉芽孢杆菌的培养方法及用途
【专利摘要】本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌的培养方法，解淀粉芽孢杆菌的培养方法包括如下步骤：①固体平板培养；②液体摇瓶培养；③种子液的制备；④发酵液的制备；⑤发酵液浓缩；⑥浓缩液喷雾干燥；⑦200亿活孢子/克解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂的制备。解淀粉芽孢杆菌用于防治烟草、番茄和辣椒等作物的青枯病，应用于农业对人畜安全性高、环境相容性好、有害生物不易产生抗药性，污染较小。
【专利说明】一种解淀粉芽孢杆菌的培养方法及用途
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌的培养方法及用途。
【背景技术】
[0002]青枯病是由青枯雷尔氏菌，又称茄料雷尔菌引起的世界范围的细菌性土传病害。病原菌极易从根系、莖部伤口侵人植株，进而危害整个维管系统引起植株萎蔫枯死。该病原菌有着广泛的寄主范围及地理分布，可侵染50多个种的300多种植物，包括许多具有重要经济价值的栽培植物，其中烟草、马铃薯、花生、番茄、玉米、甘薯、茄子、辣椒、香蕉、草墓、桑、木麻黄、油橄榄、聚合草惟及一些贵重药材和花卉等植物受害最为严重，给作物生产带来巨大经济损失。特别是烟草，我国是烟草种植和消费大国，也是最重要的经济植物之一。
[0003]长期以来，烟草青枯病等作物的细菌性病害防治均以农用链霉素等抗生素类农药为主，这类农药防效不稳定，见效慢且难以达到理想的防效，更重要的是，随着人类安全认识的不断提升，我国已从2008年始禁止各种抗生素类和剧毒用于人和动物，高毒类农药应用于农业生产，从而造成了防治烟草等作物细菌性病害农药的严重缺乏。在微生物防治逐渐成为植物病害防治研究热点的今天，研究开发和利用微生物农药来防治烟草等作物的细菌性病害无疑是最佳出路。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种能用于防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌的培养方法。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌，其保藏名称为:Baeillus amgloliquefaciens。
[0006]本发明从秦岭烤烟叶面上分离得到一株优势芽孢杆菌作为试验菌种，对其进行了16SrRNA、atPA基因序列分析，鉴定结果表明，该细菌属于解淀粉芽孢杆菌，其分类命名为Bacillus amgloliquefaciens。
[0007]进一步的，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amgloliquefaciens)的形态学和生理化性质特征为:菌体呈杆状，革兰氏阳性，芽孢椭园形，中生或端生，不膨大，大小为
0.7-0.8 μ m，长2-3 μ m.。常规生理生化实验表明，是好氧菌，接触酶，氧化酶，VP试验呈阳性，在7%的NaCl中生长，PH5.7生长，水解淀粉，还原硝酸盐成亚硝酸盐。
[0008]本发明提供了上述解淀粉芽孢杆菌的培养方法，包括如下步骤:
(I)固体平板培养:用接种环蘸取解淀粉芽孢杆菌在NA固体培养基上划线接种，于30°C培养72小时，得到菌种I，所述菌种I能在4°C以下保存三个月。
[0009](2)液体摇瓶培养:取一环菌种I接入装有液体NA培养基的三角瓶内，于30°C、200r/min培养24小时，得到菌种II。
[0010](3)种子液的制备:根据种子量需要量，选用合适的三角瓶，按照0.05%-0.5%的比例向装有液体NA培养基的三角瓶中接入菌种II，于30°C、200r/min培养24小时或更长时间，种子液的孢子数达到0.6X 19左右，即为种子液。
[0011](4)发酵液的制备:选用50L发酵罐，经空消后加入自制培养基，装料系数为0.6，装料30L，用蒸汽在121°C条件下实消0.5小时后，控制发酵温度30土 1°C，通气20-40L /min，转速150-200r/min，接种量0.05%_1%，发酵40-48小时，发酵液孢子量为2 X 19个活孢子/ml时放罐，得解淀粉芽孢杆菌发酵液。
[0012]其中所述自制培养基的组分及其重量百分比为:酵母粉1%_3%，玉米粉1%_5%，葡萄糖0.8%-3%，氯化钙0.1%-1%，豆柏粉1% -4%，消泡剂0.1-0.3%，其余为水。
[0013](5)发酵液浓缩:选用陶瓷膜过滤浓缩，膜孔径0.05-0.2 μ m，膜面积0.2-0.5 m2，将上述发酵液27kg进行膜过滤，得浓缩液7.0kgo
[0014](6)浓缩液喷雾干燥:选用每小时脱水量为3kg的离心喷雾干燥塔，将浓缩液7.0kg进行喷雾干燥，进风温度120-220°C，出风温度60-90°C，约三小时后可得干粉370克，即为解淀粉枯草芽孢杆菌母药，其孢子量为2X 111个活孢子/克。
[0015](7)200亿活孢子/克解淀粉芽孢杆菌可湿性粉的制备:将上述解淀粉芽孢杆菌母药和各种助剂进行混合，经气流粉碎后得到200亿活孢子/克解淀粉芽杆菌可湿性粉剂产品O
[0016]本发明的有益效果是:解淀粉芽孢杆菌，能产生芽孢，具有极强的抗逆性，应用于农业对人畜安全性高、环境相容性好、有害生物不易产生抗药性，污染较小。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。
[0018]实施例1:解淀粉芽孢杆菌的培养方法 1.1解淀粉芽孢杆菌种子液的获得:
1.1.1解淀粉芽孢杆菌菌种活化:用接种环挑取
三环解淀粉芽孢杆菌冻干菌种于250ml三角瓶中，采用NA培养基，30°C培养18h。
[0019]NA培养基配方:蛋白胨10克，牛肉膏3克，Nacl5克，琼脂 15 克，蒸馏水 1000ml, PH 值 7.3。
[0020]1.1.2划线法固体平板培养:在NA培养基平板上30 V培养，培养72-120小时，长出单菌落。
[0021]1.1.3试管斜面培养:NA试管斜面，挑取上述单菌落接于试管斜面，30°C培养72-96小时，直到孢子散落。
[0022]从上述试管斜面中选用较好的菌种，用无菌水将试管斜面种子冲洗，接于装有NA培养基的750mL三角瓶中，于30°C、摇床转速200r/min培养24-26小时，菌体含量达到0.6 X 19个/mL左右时，即可作为种子液。
[0023]1.2解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备:
解淀粉芽孢杆菌发酵培养基:酵母粉2.8%，玉米淀粉1.4%，葡萄糖1.0%，氯化钙0.3%，豆柏粉3.0%，消泡剂0.14%，其余为水，调节PH 8.1~8.3。
[0024]50升全自动控制不锈钢发酵罐进行消毒:用蒸汽121°C消毒 I小时。
[0025]向发酵罐装料:装料系数为0.6，加入酵母粉840克，玉米淀粉420克，葡萄糖300克，氯化钙90克，豆柏粉900克，消泡剂42克，加入自来水22升，通入蒸汽，于1211:消毒1.0小时，体积达30升，查无杂菌。
[0026]发酵最佳参数:发酵温度30± I°C，初始PH值为8.1~8.3，通
气量为1: 1，搅拌转速200r/min，接种量为1%，升温至30°C，发酵46-48小时，孢子量为0.6X 1VmL时，即到终点，得26.5公斤的发酵液。
[0027]1.3发酵液的浓缩:
将26.5kg的发酵液装入膜分离装置的料液槽，采用孔径为0.1 μ m的陶瓷膜，膜面积为
0.25 Hi2，开启循环泵进行分离，循环3小时后得到7.0kg浓缩液。
[0028]1.4浓缩液喷雾干燥:
采用脱水量为3kg/h的离心式喷雾干燥塔，进风温度140
V，出风温度70°C，将7.0kg解淀粉芽孢杆菌浓缩液进行喷雾干燥，经三小时得375g解淀粉芽孢杆菌母粉，经检测孢子量为3.4X 111活孢子/克的解淀粉芽孢杆菌母药。
[0029]实施例2:解淀粉芽孢杆菌室内抑菌试验
选择的病原菌有:烟草青枯病菌、辣椒疮痂菌、柑桔疮痂病菌、白菜软腐病菌、水稻白叶枯病菌、辣椒根腐病菌、马铃薯环腐病菌、猕猴桃溃疡病菌、菜豆细菌性疫病菌、黄瓜细菌性角斑病菌。
[0030]选用质量体积比为100mg/L，10mg/L, lmg/L的解淀粉芽孢杆菌分别对上述病原菌进行抑菌试验，试验结果如下表1:
解淀粉芽孢杆菌的抑菌谱表1
【权利要求】
1.一种解淀粉芽孢杆菌，保藏名称为:Bacillus amyloliquefaciens,其特征在于,解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amgloliquefaciens)的形态学和生理化性质特征为:菌体呈杆状，革兰氏阳性，芽孢椭园形，中生或端生，不膨大，大小为0.7-0.8 μ m，长2-3 μ m。常规生理生化实验表明，是好氧菌，接触酶，氧化酶，VP试验呈阳性，在7%的NaCl中生长，PH5.7生长，水解淀粉，还原硝酸盐成亚硝酸盐； 进一步的，解淀粉芽孢杆菌的培养方法包括以下步骤:
(I)固体平板培养:用接种环蘸取解淀粉芽孢杆菌在NA固体培养基上划线接种，于30°C培养72小时，得到菌种I。
(2)液体摇瓶培养:取一环菌种I接入装有液体NA培养基的三角瓶内，于30°C、200r/min培养24小时，得到菌种II。
(3)种子液的制备:根据种子量需要量，选用合适的三角瓶，按照0.05%-0.5%的比例向装有液体NA培养基的三角瓶中接入菌种II，于30°C、200r/min培养24小时或更长时间，种子液的孢子数达到0.6X 19左右，即为种子液。
(4)发酵液的制备:选用50L发酵罐，经空消后加入自制培养基，装料系数为0.6，装料30L，用蒸汽在121 °C条件下实消0.5-1小时后，控制发酵温度30±1°C，通气20-40L /min，转速150-200r/min，接种量0.05%_1%，发酵40-48小时，发酵液孢子量为2 X 19个活孢子/ml时放罐，得解淀粉芽孢杆菌发酵液。
(5)发酵液浓缩:选用陶瓷膜过滤浓缩，膜孔径0.05-0.2 μ m,膜面积0.2-0.5 Ilf，将上述发酵液27kg进行膜过滤，得浓缩液7.0kgo
(6)浓缩液喷雾干燥:选用每小时脱水量为3kg的离心喷雾干燥塔，将浓缩液7.0kg进行喷雾干燥，进风温度120-220°C，出风温度60-90°C，约三小时后可得干粉370克，即为解淀粉枯草芽孢杆菌母药，其孢子量约为2X 111个活孢子/克。
(7)200亿活孢子/克解淀粉芽孢杆菌可湿性粉的制备:将上述解淀粉芽孢杆菌母药和各种助剂进行混合，经气流粉碎后得到200亿活孢子/克解淀粉芽杆菌可湿性粉剂产品O
2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于:所述的自制培养基的组分及其重量百分比为:酵母粉1%_3%，玉米粉1%_5%，葡萄糖0.8%-3%，氯化钙0.1%-1%，豆柏粉1%-4%，消泡剂0.1%-0.3%，其余为水，调节PH 8.1~8.3。
3.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于:所述的NA培养基配方:蛋白胨10克，牛肉膏3克，Nacl5克，琼脂15克，蒸馏水1000ml，PH值7.3。
4.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于:所述菌种I能在4°C以下保存三个月。
5.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于:所述的解淀粉芽孢杆菌可以用于防治烟草、番茄和辣椒等作物的青枯病。
【文档编号】A01N25/14GK104046576SQ201310083560
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年3月17日 优先权日:2013年3月17日
【发明者】张海华, 黄带辉, 张小平 申请人:江西顺泉生物科技有限公司