专利名称：一种提高粳稻花药培养愈伤组织诱导率和绿苗分化率的方法
技术领域：
本发明涉及一种水稻花药培养改良技术，具体涉及一种提高粳稻花药培养愈伤组织诱导率和绿苗分化率的方法，属农业技术领域。
背景技术：
水稻花培的目的是诱导花粉形成单倍体，经染色体加倍后快速的获得纯系，是选育作物新品种的有效手段，与传统育种手段相比，能大大缩短育种周期，提高选择效率，力口速有效性状的转移；水稻花药培养技术能在短期内育成大量遗传性状稳定的材料，随着水稻基因组计划和转基因水稻的堀起，该技术在粳稻种质资源创新、新品种选育及水稻基因工程育种上应用越来越广泛。但是，由于品种间基因型的差异，离体花药对于培养基的反应差异很大，导致愈伤诱导频率和绿苗分化率低等问题，综合历年来花药培养相关报道，粳稻花药培养的愈伤诱导率一般在30-50%之间。花培效率的低下，尤其是愈伤诱导率和绿苗分化率的低下极大影响了花培育种效率和DH系遗传群体的构建，限制了花药培养技术在水稻育种和水稻基因工程中大力的应用。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足之处，提供一种提高粳稻花药培养愈伤组织诱导率和绿苗分化率的方法。该方法通过取样前喷施了多效唑(10%的多效唑可湿性粉剂200g/667m2兑水50 60L喷雾处理)，前人的研究多为调整培养基组分及含量，并未在取样前期进行前处理；喷施多效唑和低温处理使得花药内大量的花粉细胞处于单核靠边期，接种至愈伤诱导培养基:改良N6培养基+KT 0.5mg/L+2, 4-D 2.0mg/L+4-FA 0.4mg/L+蔗糖60g/L+琼脂粉8.0g/L ;培养基灭菌前调pH值:5.9-6.0后，在新型的细胞分裂素4-FA和KT、2，4-D的协同作用下，暗培养易启动分裂，大大提高了愈伤组织诱导率。通过利用这一花药培养方法，粳稻花药培养的愈伤组织诱导率获得显著提高，均超过85.0% ;而分化培养基组成成分:MS 基本培养基 +NAA 0.5mg/L+ZT 0.5mg/L+TDZ 0.8mg/L+4_FA 0.2mg/L+MET 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L，引进新型激素ZT、4_FA和TDZ以后，光照培养，绿苗分化率能达到86%以上，显著提高粳稻花药培养愈伤组织诱导率和绿苗分化率。本发明是以如下技术方案实现的:一种提高粳稻花药培养愈伤组织诱导率和绿苗分化率的方法，其特征是:按如下步骤进行:(I)前处理:选取粳稻品种徐稻5号为材料，叶枕平前5-7天，用10%的多效唑可湿性粉剂200g/667m2，兑水50 60L喷施植株；(2)取样及取样后处理:待叶枕距3_5cm时取幼穗，5_8°C处理5_8天；(3)愈伤诱导:挑取花药接种至愈伤诱导培养基:改良N6培养基+KT 0.5mg/L+2, 4-D 2.0mg/L+4-FA 0.4mg/L+蔗糖 60g/L+琼脂粉 8.0g/L ;培养基灭菌前调 pH 值:5.9-6.0，25±1°C 暗培养；(4)分化培养:待愈伤增大至l_2mm，转至分化培养基；MS基本培养基+NAA 0.5mg/L+ZT 0.5mg/L+TDZ 0.8mg/L+4_FA 0.2mg/L+MET 2.0mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂粉 8g/L，培养基灭菌前调pH值:5.9-6.0 ;在温度25±1°C、光照14小时/天条件下培养；(5)植株再生后转入生根培养基，23± I°C、光照14小时/天条件下继代培养。本发明的优点是:该方法可操作性强、简单易行，重复性好。这一花药培养技术的改进，将有助于粳稻花药培养技术的推广应用，提高花培育种工作效率，推动水稻研究工作中遗传群体DH系的构建。
具体实施例方式下面结合实施例进一步说明本发明的方法和效果，但不限制本发明的保护范围。实施例1、1.试验材料 和方法1.1试验材料:徐稻5号1.2试验方法:所选材料为粳稻品种徐稻5号，叶枕平前5-7天用10%的多效唑可湿性粉剂200g/667m2兑水50 60L喷雾，以不喷施多效唑的材料作为对照；待叶枕距3_5cm时取幼穗，5_8°C处理5-8天，取雄蕊伸长至颖壳1/2-2/3的幼穗为实验材料，经70%酒精灭菌45s，加0.l%HgCl2消毒10_15min，去除Hgcl2溶液后，用无菌水冲洗3-4次，边洗边摇，用镊子挑出花药，接种至愈伤诱导培养基改良，N6培养基+KT
0.5mg/L+2, 4-D2.0 mg/L+4-FA 0-2.0mg/L+ 蔗糖 60g/L+ 琼脂粉 8.0g/L,改良 N6 培养基 +KT
2.0mg/L+2, 4-D 2.0mg/L+ 蔗糖 60g/L+ 琼脂粉 8.0g/L 为对照，pH 值:5.9-6.0，25± 1°C 暗培养;待愈伤增大至l_2mm，转至分化培养基(MS基本培养基+NAA0.5mg/L+ZT 0.5mg/L+TDZ 0-1.6mg/L+4-FA 0.2-0.4mg/L+MET2.0 mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂粉 8g/L，MS 基本培养基 +NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L+MET 2.0mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂粉 8g/L 为对照，pH 值:
5.9-6.0)，在温度25±1°C、光照14小时/天条件下培养；植株再生后转入绿苗越冬保存培养基，23 土 1°C、光照14小时/天条件下继代培养。1.3调查及数据统计:接种在愈伤诱导培养基上50天，统计愈伤诱导率；接种至分化培养基上60天，统计绿苗分化率。2.结果与分析2.1喷施多效唑及使用不同诱导培养基对愈伤诱导率的影响研究发现，使用相同激素配比的培养基，喷施多效唑的花药在接种后12天即出现愈伤组织，1-2mm的愈伤组织集中出现时间为18-25天，不使用多效唑的花药最早出现愈伤组织在接种后20天，l-2mm的愈伤组织多出现在接种后25-35天，40天以后鲜有新的愈伤组织产生。具体结果见表1:与对照相比，培养基中添加KT 0.5mg/L+2，4-D 2.0mg/L+4-FA
0.4mg/L，徐稻5号愈伤组织诱导率都得到了显著的提高，最高达87.2% (见表I)。表1:不同诱导培养基配方对绿苗分化率及植株再生率的影响
权利要求
1.一种提高粳稻花药培养愈伤组织诱导率和绿苗分化率的方法，其特征是:按如下步骤进行: (1)前处理:选取粳稻品种徐稻5号为材料，叶枕平前5-7天，用10%的多效唑可湿性粉剂200g/667m2，兑水50 60L喷施植株； (2)取样及取样后处理:待叶枕距3-5cm时取幼穗，5-8°C处理5_8天； (3 )愈伤诱导:挑取花药接种至愈伤诱导培养基:改良N6培养基+ΚΤ0.5mg/L+2, 4-D2.0mg/L+4-FA0.4mg/L+ 蔗糖 60g/L+ 琼脂粉 8.0g/L ;培养基灭菌前调 pH 值:5.9-6.0，25±1°C 暗培养； (4)分化培养:待愈伤增大至l_2mm，转至分化培养基:MS基本培养基+NAA0.5mg/L+ZT0.5mg/L+TDZ0.8mg/L+4-FA0.2mg/L+MET2.0mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂粉 8g/L，培养基灭菌前调pH值:5.9-6.0 ;在温度25土 1°C、光照14小时/天条件下培养； (5)植株再生后转入生根 培养基，23±1°C、光照14小时/天条件下继代培养。
全文摘要
本发明涉及一种水稻花药培养改良技术，具体涉及一种提高粳稻花药培养愈伤组织诱导率和绿苗分化率的方法。该方法通过取样前用10%的多效唑可湿性粉剂200g/667m2兑水50～60L进行了喷雾处理，喷施多效唑和低温处理使得花药内大量的花粉细胞处于单核靠边期，并在愈伤组织诱导培养基中引进了新型的细胞分裂素4-FA，在4-FA和KT、2,4-D的协同作用下，接种后暗培养易启动分裂，大大提高了愈伤组织诱导率。通过利用这一花药培养方法，粳稻花药培养的愈伤组织诱导率获得显著提高，均超过85.0%；而分化培养基组成成分MS基本培养基+NAA0.5mg/L+ZT0.5mg/L+TDZ0.8mg/L+4-FA0.2mg/L+MET2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L，引进了新型激素ZT、4-FA和TDZ以后，光照培养，绿苗分化率能达到86%以上。
文档编号A01H4/00GK103210844SQ20131014646
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月23日 优先权日2013年4月23日
发明者胡婷婷, 王健康, 丁成伟, 郭荣良, 吴玉玲, 徐家安, 王友霜, 赵轶鹏 申请人:江苏徐淮地区徐州农业科学研究所