一株固氮地衣芽孢杆菌及其用途
【专利摘要】本发明公开了一株固氮地衣芽孢杆菌及其用途。该固氮地衣芽孢杆菌是地衣芽孢杆菌(Bacillus?licheniformis)BF007，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC?No.8345。本发明所提供的地衣芽孢杆菌(Bacillus?licheniformis)BF007CGMCC?No.8345安全无害，环境友好，能够在作物根际定殖，具有很高的固氮潜能，用于农业生产增产效果显著，在小麦、水稻、玉米等粮食作物拌种剂，蔬菜工厂化育苗接种剂，果树抗病叶面喷施菌剂，重茬障碍土壤修复，中低产田培肥改良，固氮微生物菌剂和生物有机肥生产应用中具有广阔前景。
【专利说明】一株固氮地衣芽孢杆菌及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株固氮地衣芽孢杆菌及其用途。
【背景技术】 [0002]氮肥是农业生产中最重要的生产资料之一。生产化学氮肥消耗大量能源，占生产总成本的70 %~80 %。近年来能源日趋紧张，化肥生产用煤价格飚升导致化学氮肥价格上涨，农民难以承受，反响强烈。化学氮肥在提高作物产量、保障我国粮食安全方面发挥了巨大作用，但是不合理施氮已经形成了严重的面源污染，造成一系列的严重危害，如太湖蓝藻事件令人触目惊心。城市地下水硝酸盐污染已经对饮用水安全造成了威胁。
[0003]大气中含有78%的氮素，但其存在形式是分子态氮气，动植物不能直接利用，自然界只有某些原核微生物具有直接利用大气中氮气的能力，将其还原成氨，这就是生物固氮作用。选用高效固氮微生物菌种工厂化生产制成菌剂，或进一步与其它富含植物营养的物料复合加工成生物制品，应用于农业生产，可以提供作物氮素营养，改善作物根际生态环境，提高土壤生物肥力性状，这就是通常所说的固氮微生物菌剂或固氮微生物肥料。生物氮肥具有多种优势:①生物氮肥由可再生的生化制剂和活体微生物组成，可以再生，不存在资源枯竭问题，是可持续发展农资产品。②生物氮肥是环境友好型肥料，其生产和使用过程均不产生三废等污染性物质，而且能改善土壤理化性质，提高土壤肥力，是生态农业农资产品。③生物氮肥生产耗能少、成本低，其成本仅为等效化学氮肥的20%~40%，可以为国家节省大量的煤炭和石油等能源战略物资。④使用生物氮肥可以显著降低农业生产成本，提高农产品品质，提升土壤肥力，使农民受益，促进社会和谐发展。
[0004]菌种是微生物肥料生产应用的基础。目前，限制我国微生物肥料行业发展的瓶颈就是高效菌种，农业生产迫切需要能够高效固氮的生产用菌株。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一株具有固氮作用的细菌。
[0006]本发明提供的细菌是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007,该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC N0.8345。
[0007]下述任一种地衣芽抱杆菌(Bacilluslicheniformis)BF007CGMCC N0.8345 的相关产品也属于本发明的保护范围:
[0008]A、含有所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345 的菌剂；
[0009]B、含有所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) BF007CGMCC N0.8345 或 A所述菌剂的栽培植物拌种剂，所述栽培植物采用种子繁殖法进行繁殖；
[0010]C、含有所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) BF007CGMCC N0.8345 或 A所述菌剂的生物有机肥；
[0011]D、含有所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) BF007CGMCC N0.8345 或 A所述菌剂的蔬菜工厂化育苗接种剂；
[0012]E、含有所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) BF007CGMCC N0.8345 或 A所述菌剂的果树叶面喷施剂。
[0013]上述相关产品中，A所述菌剂的活性成份可为所述的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BF007CGMCC N0.8345，也可还含其他物质，如其他固氮菌株。所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料或高分子化合物；所述矿物材料为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸杆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述高分子化合物为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
[0014]上述相关产品中，A所述菌剂具体可为下述Al) -A6)中任一的菌剂:
[0015]Al)用于生物固氮的菌剂；
[0016]A2)提高栽培植物的产量和/或品质的菌剂；
[0017]A3)促进植物生长的菌剂；
[0018]A4)产生固氮酶的菌剂；
[0019]A5)生荒地改良培 肥的菌剂；
[0020]A6)防止栽培植物重茬病害和/或土传病害的菌剂。
[0021]所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BF007CGMCC N0.8345 在制备上述相关产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0022]所述地衣芽抱杆菌(Bacilluslicheniformis)BF007CGMCC N0.8345 或所述相关产品的下述任一种应用也属于本发明的保护范围:
[0023]I)在提高栽培植物的产量和/或品质中的应用；
[0024]2 )在蔬菜工厂化育苗中的应用；
[0025]3)在生产固氮酶中的应用；
[0026]4)在促进植物生长中的应用；
[0027]5)在生荒地改良中的应用；
[0028]6 )在提高土壤肥力中的应用。
[0029]本发明还提供了利用地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCCN0.8345栽培植物的方法。
[0030]本发明所提供的栽培植物的方法，为下述NI或N2的方法:
[0031]N1、包括将所述栽培植物的种子用B所述拌种剂进行拌种后进行种植；
[0032]N2、包括对秧苗或扦插枝条采用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345或A所述菌剂进行蘸根后进行种植。
[0033]本发明还提供了利用地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCCN0.8345进行施肥的方法。
[0034]本发明所提供的施肥方法，为下述Ml、M2或M3的方法:[0035]Ml、包括向栽培植物的土壤中施入地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345或所述相关产品；
[0036]M2、包括向栽培植物的植株表面喷施地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345或所述相关产品；
[0037]M3、包括向栽培植物的土壤中随水冲施地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345或所述相关产品。
[0038]上文中，所述栽培植物可为小麦、水稻、玉米、甘蔗或甘薯等农作物。
[0039]上述在提高栽培植物的产量和/或品质中的应用和上述栽培植物的方法中，所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345或所述菌剂的用量可为每亩大于等于 10lclcfu 所述地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345,如每亩 10ncfu-1012cfu 所述地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCCN0.8345。在本发明的一个实施方式中，所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345或所述菌剂作为拌种剂对小麦进行拌种，所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345 或所述菌剂的用量为每亩 IO11Cfu 所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345。在本发明的另一个实施方式中，所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345或所述菌剂在玉米四叶期到六叶期作为追肥施入土壤中，所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345或所述菌剂的用量为每亩施入IO12Cfu所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BF007CGMCC N0.8345。在本发明的又一个实施方式中，所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345或所述菌剂对水稻进行拌种并施入土壤中，所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345或所述菌剂的用量为每亩施入 IO11Cfu 所述地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345。在本发明的再一个实施方式中，所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCCN0.8345或所述菌剂施入甘鹿土壤中，所述地`衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345或所述菌剂的用量为每亩施入IO12Cfu所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BF007CGMCC N0.8345。在本发明的再一个实施方式中，所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345或所述菌剂施入甘薯土壤中，所述地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345或所述菌剂的用量为每亩施入IO12Cfu 所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345。
[0040]培养所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BF007CGMCC N0.8345 的方法和制备所述相关产品的方法也属于本发明的保护范围。
[0041]本发明所提供的培养所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCCN0.8345 的方法，包括将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345 在用于培养地衣芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。
[0042]本发明所提供的制备所述相关产品的方法，包括将所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BF007CGMCC N0.8345作为所述相关产品的组分。
[0043]所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BF007CGMCC N0.8345 是从农田土壤中分离的固氮菌，该菌株固氮酶活性为85.583nmol C2H4/h.mg蛋白，统计分析极显著高于微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103。本发明所提供的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345安全无害，环境友好，能够在作物根际定殖，具有很高的固氮潜能，用于农业生产增产效果显著，在小麦、水稻、玉米等粮食作物拌种剂，蔬菜工厂化育苗接种剂，果树抗病叶面喷施菌剂，重茬障碍土壤修复，中低产田培肥改良，固氮微生物菌剂和生物有机肥生产应用中具有广阔前景。
[0044]保藏说明
[0045]菌种名称:地衣芽孢杆菌
[0046]拉丁名:(Bacilluslicheniformis)
[0047]菌株编号:BR)07
[0048]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0049]保藏机构简称:CGMCC
[0050]地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号
[0051]保藏日期:2013年10月16日
[0052]保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.8345
【具体实施方式】
[0053]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
`[0054]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0055]下述实施例中所用的培养基如下，使用前均在115°C条件下灭菌20分钟:
[0056]固氮菌富集培养液ACCC55:蔗糖 10g、K2HPO4.3Η200.5g、NaCl0.2g、CaCO3Ig,MgSO4.7Η200.2g、用蒸馏水定容至 1000ml、ρΗ7.0 ~7.2。
[0057]改良的ACCC55 固氮菌固体培养基:蔗糖 10g、K2HPO4.3H200.5g、NaCl0.2g、CaCO3Ig^MgSO4.7Η200.2g、酵母膏 0.5g、琼脂 15_20g，用蒸馏水定容至 1000ml，ρΗ7.0 ~7.2。
[0058]无氮培养基:蔗糖10g, NaCl0.12g，K2HPO4.3Η200.5g，CaCO3Ig, MgSO4.7Η200.2g，用蒸懼水定容至1000ml, pH7.2。
[0059]牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaC15g、琼脂15_20g，用蒸馏水定容至 1000ml, ρΗ7.2。
[0060]改良固氮培养基:蔗糖10g、K2HPO4.3Η200.5g、NaCl0.2g、CaCO3Ig,MgSO4.7Η200.2g、酵母膏 0.5g、蒸馏水 1000ml、琼脂 15_20g，ρΗ7.0 ~7.2。
[0061]下述实施例中所用的圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum) ACCCl 1103(参见“孙建光等.高效固氮芽孢杆菌筛选及其生物学特性.中国农业科学，2009，42 (6): 2043-2051”)。公众可从中国农业科学院农业资源与农业区划研究所获得该菌株，以重复本申请的实验。
[0062]实施例1、地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345 的分离
与鉴定
[0063]一、作物根际固氮菌BF007的富集与分离
[0064]取IOg土样(采自中国山西省临汾市小麦根际)放入90ml无菌水中摇床振荡20min制成混浊液，吸取5ml放入30ml固氮菌富集培养液ACCC55中，lOOrpm，28°C进行摇床振荡培养，72h后换新鲜培养液继续培养。重复培养3次后进行固氮芽孢菌分离。吸取Iml上述固氮菌富集培养物放到9ml无菌水中制成KT1稀释度，继续稀释制成10_2、10_3、10_4、10_5稀释度的菌悬液，在100°c沸水中加热lOmin，冷却后每个稀释度取0.1ml涂布在无氮培养基平板上，29°C静置培养。2~3d待菌落形成后，在改良的ACCC55固氮菌培养基平板上用平板划线法进行菌种纯化。将分离纯化所得的其中一个菌株命名为作物根际固氮菌BF007。
[0065]二、作物根际固氮菌BF007的鉴定
[0066]从以下几个方面鉴定步骤一分离纯化并筛选得到的作物根际固氮菌BF007:
[0067]1、形态学鉴定
[0068]将处于对数生长期且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的作物根际固氮菌BR)07进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。
[0069]对于处于对数生长期的所述作物根际固氮菌BF007，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
[0070]结果表明，上述步骤一分离并纯化得到的作物根际固氮菌BF007在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24h后菌落直径约3mm ;菌体杆状0.8 μ mX (1.5~3.5) μ m，革兰氏阳性，形成芽孢，孢囊不膨大。
[0071]2、生理生化特征分析
[0072]参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验(第三版).北京:高等教育出版社，1999.)测定上述作物根际固氮菌BF007的生理生化特征。
[0073]所述作物根际固氮菌BF007的生理生化特征测定结果如下表1。
[0074]表1.作物根际固氮菌BF`007的生理生化特征
[0075]
【权利要求】
1.地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BF007,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC N0.8345。
2.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的相关产品，为下述任一种: A、含有权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BF007CGMCCN0.8345的菌剂； B、含有权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BF007CGMCCN0.8345或A所述菌剂的栽培植物拌种剂，所述栽培植物采用种子繁殖法进行繁殖； C、含有权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis) BF007CGMCCN0.8345或A所述菌剂的生物有机肥； D、含有权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheni f ormi s) BF007CGMCCN0.8345或A所述菌剂的蔬菜工厂化育苗接种剂； E、含有权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BF007CGMCCN0.8345或A所述菌剂的果树叶面喷施剂。
3.根据权利要求2所述的相关产品，其特征在于:A所述菌剂为下述Al)-A6)中任一的菌剂: Al)用于生物固氮的菌剂； A2)提高栽培植物的产量和/或品质的菌剂； A3)促进植物生长的菌剂； A4)产生固氮酶的菌剂； A5)生荒地改良培肥的菌剂； A6)防止栽培植物重茬病害和/或土传病害的菌剂。
4.权利要求1 所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345在制备权利要求2或3所述相关产品中的应用。
5.权利要求1 所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345或权利要求2或3所述相关产品的下述任一种应用: 1)在提高栽培植物的产量和/或品质中的应用； 2)在蔬菜工厂化育苗中的应用； 3)在生产固氮酶中的应用； 4)在促进植物生长中的应用； 5)在生荒地改良中的应用； 6 )在提高土壤肥力中的应用。
6.栽培植物的方法，为下述NI或N2的方法: N1、包括将所述栽培植物的种子用权利要求2中B所述的拌种剂进行拌种后进行种植； N2、包括对秧苗或扦插枝条采用权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BF007CGMCC N0.8345或权利要求2或3中A所述菌剂进行蘸根后进行种植。
7.施肥方法，为下述Ml、M2或M3的方法: Ml、包括向栽培植物的土壤中施入权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BF007CGMCC N0.8345或权利要求2或3所述相关产品； M2、包括向栽培植物的植株表面喷施权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BF007CGMCC N0.8345或权利要求2或3所述相关产品； M3、包括向栽培植物的土壤中随水冲施权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BFOO7CGMCC N0.8345或权利要求2或3所述相关产品。
8.培养权利要求1所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BF007CGMCCN0.8345 的方法，包括将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BF007CGMCC N0.8345 在用于培养地衣芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。
9.制备权利要求2或3所述相关产品的方法，包括将权利要求1所述地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenifor`mis)BF007CGMCC N0.8345 作为所述相关产品的组分。
【文档编号】A01P1/00GK103555624SQ201310512513
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月25日 优先权日:2013年10月25日
【发明者】王天喜, 孙建光, 刘青, 李扬, 杨兰芳 申请人:王天喜, 孙建光, 刘青, 李扬, 杨兰芳