miR159a基因的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种miR159a基因的应用，该基因能够用于转基因育种且具有高抗旱性。将miR159a转入拟南芥，可显著提高拟南芥的抗旱性，因此，可将miR159a基因用于培育抗旱性经济作物，提高经济作物的产量。
【专利说明】miR159a基因的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物育种，具体涉及miR159a基因的应用。
【背景技术】
[0002]小麦是人类的主要粮食作物，在世界范围内被广泛种植。随着世界人口数量的不断增加以及人们生活水平的提高，人类对于粮食的需求量越来越大。因此，保持小麦生产持续稳定的发展，对维护世界粮食安全意义重大。在影响小麦产量的诸多因素中，干旱造成的产量损失是巨大的。据统计，在我国约2 / 3的小麦种植在干旱半干旱地区，每年由于干旱造成的小麦减产达700~800亿公斤。因此，提高小麦对于旱、盐碱等非生物胁迫的抗性，改良其对环境的适应性，一直是育种家们面临的一项艰巨任务。
[0003]利用传统的育种方法和物种间的现有遗传基因通过基因重组技术来改良作物的耐旱能力还存在很多局限，发展起来的转基因技术为改良作物的耐旱性提供了新的途径，通过外源基因的导入和表达，可以提高许多转基因植物对干旱胁迫的耐性。因此，寻求干旱诱导基因，研究抗旱基因的表达、调控和功能，是利用基因工程技术获得抗旱转基因小麦的前提，也是生产上亟待解决的突出问题。
[0004]近年来人们在植物miRNA应答各种逆境胁迫方面开展了大量的研究工作。早在2004年，Sunkar等人率先利用miRNA mi croarray技术对拟南芥mi RNA对非生物逆境胁迫的应答反应进行研究，结果表明，在高盐、低温及干旱等条件下，拟南芥中部分miRNA的表达谱会发生相应的变化。另外，miR399和miR395a分别涉及到对无机磷以及硫酸盐缺乏胁迫下的应答反应。Sunkar等人在2006年发现在氧化胁迫下拟南芥miR398的表达明显下调，并通过转基因技术证明如果抑制miR398的表达将会大大提高拟南芥对氧化胁迫的抗性。Zhao等人在水稻中发现miR169的表达明显受到高盐胁迫的诱导。还有,应用Solexa测序技术和microarray等高通`量技术,人们已经从玉米、水稻以及拟南芥等植物中识别了大量与养分、高盐和低温等非生物胁迫相关的miRNA基因；此外，人们对植物miRNA在应答生物胁迫方面也展开了一定的研究。例如在2006年，Navairo等人发现当拟南芥受到病原细菌侵染时，其体内的miR399的表达明显增加，进一步研究发现miR399在转基因拟南芥体内过量表达将提高拟南芥对该病菌的抗性。上述相关研究表明，植物在受到外界非生物胁迫或生物胁迫时，会通过调节其自身miRNA的表达谱以应答这些胁迫，并且这些受胁迫诱导表达的miRNA可能直接与植物抗逆性相关。
[0005]近年来植物miRNA对干旱胁迫应答的研究越来越受到研究人员的重视。如:2007年，Zhao等人发现水稻miR-169g的表达受干旱胁迫诱导，且在水稻根中受诱导程度明显大于叶片；2008年，Liu等人利用microarray技术识别了 4个受干旱胁迫应答的拟南芥miRNA ；2011年,Frazier等人发现9个miRNA受干旱胁迫表达上调,其中miR395a对干旱胁迫最为敏感，而Li等人利用高通量测序技术及生物信息学分析发现有104个miRNA在干旱胁迫的胡杨中表达升高，27个胡杨miRNA表达下调；2012年，Eldem等人对扁桃干旱应答相关miRNA的研究表明，在叶片中有262个miRNA的表达受干旱胁迫影响，而有368个miRNA在根中的表达受干旱胁迫发生显著改变，而Sun等人发现miR156和miR162这两个miRNA的表达在柳枝稷受干旱胁迫时发生显著变化，Chen等人发现miR393可提高拟南芥根对干旱胁迫的耐受性。在转基因研究方面，2011年，Zhang等人利用转基因技术将miR169c导入番茄使其过量表达，发现转基因番茄具有较强的抗旱性。以上研究成果均表明，miRNA可能在植物应答干旱胁迫的过程中扮演着重要的角色，因此，识别抗旱miRNA并研究其相应的抗旱调控机制将有望帮助我们更加深入揭示植物抗旱的调控网络，为将来人工培育抗旱作物奠定理论基础。
[0006]但是，上述已报道的抗性相关的基因通过转基因进行抗旱性鉴定，发现很多不具有抗旱性，或对转基因植物的抗旱性提高不明显。因此，有必要提供一种能够用于转基因育种且具有高抗旱性的基因。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种能够用于转基因育种且具有高抗旱性的基因。
[0008]一种miR159a基因的应用，其特征在于:miR159a基因在培育抗旱性植物中的应用。上述所指的miR159a基因是指所有能够在植物体内最终产生序列为:5，_uuuggauugaagggagcucua_3，°
[0009]具体的为:miR159a基因在抗旱性植物育种中的应用。miR159a基因在抗旱性植物转基因育种中的应用。
[0010] 申请人:通过长期试验发现:过表达miR159a拟南芥突变株的构建分析得到，miR159a转入拟南芥，可显著提高拟南芥的抗旱性，因此，可将miR159a基因用于培育抗旱性经济作物，提高经济作物的产量。例外，通过将miR159a转入不同经济作物的比较，发现转入小麦中获取的抗旱效果最佳，因此，更为优选的方案为:
[0011 ] miR159a基因在培育抗旱性小麦中的应用。
`[0012]miR159a基因在抗旱性`小麦育种中的应用。
[0013]miR159a基因在抗旱性小麦转基因育种中的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为实施例2中干旱胁迫对miR159a前体表达的影响；
[0015]图2为实施例3中构建的载体的结构图；
[0016]图3为实施例4中Northern杂交检测Tae_miR159在正常及转基因拟南芥的表达，其中:1:非转基因植株；2:转基因植株；
[0017]图4为实施例5中停止浇水16天处理的转基因拟南芥。
【具体实施方式】
[0018]以下通过【具体实施方式】对本发明作进一步的说明和佐证；
[0019]实施例1:小麦干旱胁迫处理及和RNA的提取
[0020]本实施例对2周龄的抗旱和不抗旱的两种小麦的水培幼苗进行干旱处理，即用20%PEG6000模拟干旱条件对小麦幼苗分别处理0h、3h、6h、9h和12h，然后提取处理后的小麦幼苗的总RNA。[0021]本实施例采用Trizol试剂盒提取小麦总RNA，其具体步骤如下:
[0022]1、液氮速冻的叶片用塑料棒于Eppendorf管中磨碎,加入800 μ I的Trizol,剧烈混匀后室温放置5min。
[0023]2、在管中再加入400 μ I酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，剧烈混匀后室温放置5min。
[0024]3、4°C 1000Og离心IOmin,吸取上清液600 μ I至另一新的Eppendorf管，加入600 μ I氯仿，轻柔混匀，室温放置lOmin。
[0025]4、4°C 1000Og离心IOmin,吸取上清液500 μ I至另一新的Eppendorf管，加入850 μ I无水乙醇,轻柔混匀后，-20°C放置8h以上。
[0026]5、4°C 12000g离心IOmin,弃上清液,加入1000 μ 170%乙醇,轻柔颠倒Eppendorf管，室温放置5min。
[0027]6、4°C 12000g离心lOmin，弃上清液，放置超净台上自然风干。
[0028]7、用50 μ I经DEPC处理后的ddH20溶解沉淀。保存于-20 V。
[0029]8、取I μ IDNA样品稀释50倍，以紫外分光光度计测样品的0D260和0D280，通过0D260计算RNA样品浓度及纯度。依据浓度，将样品统一稀释至50ng / ul，取I μ I用于反转录反应。
[0030]实施例2:干旱胁迫下抗旱和不抗旱小麦中miR159a前体的表达动态
[0031 ] 本实施例对实施例1提取的样品总RNA进行定量RT-PCR分析，其具体步骤如下:`[0032]按照invitrogen公司提供的反转录酶说明书配制，反转录引物为Oligo (dT) 18,反应条件为:60°C 5min ；37°C Ih ；70°C IOmin0
[0033]反转录产物稀释10倍后取I μ I作为模版，其他试剂及容量按照Takara公司提供的 Ex-Taq 说明书配制反应体系，温度条件:94°C Imin ；94°C 20sec, 58°C 20sec, 72°C 40sec,32 循环；72°C 7min。
[0034]PCR产物加入I / 10体积的IOXloading buffer，上样于I %琼脂糖凝胶上，电泳至溴酚蓝跑出底线，经溴化乙锭染色后应用凝胶图像分析系统记录结果，参见图1。
[0035]实施例3:过表达miR159a拟南芥突变株的构建
[0036]本实施例在实施例2的检测结果基础上，进一步构建了过表达miR159a的拟南芥突变株，其具体步骤如下:
[0037]l、miR159a组成型表达质粒的构建
[0038]回收图1中陕合6号48h的miR159前体片段，通过分子克隆及DNA测定鉴定正确后，通过与35S启动子融合构建成目标miRNA的植物表达载体。大致的构建策略是:切除PCAMBIA1301载体上的⑶S基因，然后将目标片段(miRNA前体片段)插入到原来⑶S基因的位置上。最终构建的载体简图如图2所示:
[0039]2、miR159a组成型表达质粒转化拟南芥
[0040](I)将上述构建的重组质粒导入农杆菌GV3103，然后将含有表达载体的阳性农杆菌菌落接种于5m含有适量Rif、Gen、Spec抗性的LB液体培养基中，28°C培养2d。
[0041](2)按照1:100比例，移取上一步的培养物于500ml含有适量Rif、Gen、Spec抗性的LB液体培养基中扩大培养，28°C培养16-24h。
[0042](3)测得此时菌液的OD值在1.5-2.0之间，室温4000gX IOmin离心收集菌体。
[0043](4)用5%等体积的蔗糖溶液重悬菌体，并往其中加入IOOul Silwet_L77，混匀，转移至500ml大烧杯中。
[0044](5)倒置处于花期的野生型拟南芥(培养方法见2.2.1)，将其花及茎部分浸入农杆菌悬浮液中并轻轻搅动1Os左右。
[0045](6)为了保持一定的湿度，用塑料袋将浸染过的拟南芥覆盖住16_24h。
[0046](7)将处理过的植物移回温室中继续培养1个月，收集种子。
[0047]3、转基因拟南芥的筛选
[0048](1)将上述收集的种子经过消毒后均匀涂布到含有适量Kan和Crb抗性的MS培养基上。
[0049](2)将培养皿置于长日照条件(16h光照/ 8h黑暗，20°C )培养2周，让种子发芽和小苗生长，然后筛选能够正常生长的转基因阳性苗转移到湿土中。
[0050](3)将土中的拟南芥置于温室短日照培养3-4周，再转换成长日照条件诱导其开花。
[0051](4)通过PCR技术筛选出PCR阳性的转基因植株。
[0052]实施例4:miR159a在转基因拟南芥和野生型中的表达鉴定
[0053]本实施例采用northern blot来检测实施例3所得转基因拟南芥miR159a的表达情况，野生型拟南芥作为对照。具体操作参考《分子克隆实验指南(第三版)》。结果如图3所示，目标miRNA在转基因拟南芥中得到过量表达。
[0054]实施例5:干旱处理野生型和转基因拟南芥
[0055]将野生型拟南芥和实施例4所得的miR159a高表达的T3代突变株种子种到土里，一个月后进行停水处理，结果如图4所示，当停止浇水16天后，转基因拟南芥仍然生长良好，而对照组的非转基因拟南芥却已经全部枯死。表明Tae-miR159是一个具有强抗旱功能的 miRNA。
[0056]以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该于解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
【权利要求】
1.一种miR159a基因的应用，其特征在于:miR159a基因在培育抗旱性植物中的应用。
2.如权利要求1所述的miR159a基因的应用，其特征在于:miR159a基因在抗旱性植物育种中的应用。
3.如权利要求1所述的miR159a基因的应用，其特征在于:miR159a基因在培育抗旱性小麦中的应用。
4.如权利要求2所述的miR159a基因的应用，其特征在于:miR159a基因在抗旱性植物转基因育种中的应用。
5.如权利要求3所述的miR159a基因的应用，其特征在于:miR159a基因在抗旱性小麦育种中的应用。
6.如权利要求3所述的miR159a基因的应用，其特征在于:miR159a基因在抗旱性小麦转基因育种中 的应用。
【文档编号】A01H5/00GK103695461SQ201310545024
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年11月2日 优先权日:2013年11月2日
【发明者】金伟波, 吴方丽, 刘雨, 郑聿贤, 张伟 申请人:浙江理工大学