环状芽孢杆菌及微生物菌剂和它们的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种环状芽孢杆菌，其保藏编号为CGMCC?NO.8910。本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，所述菌体包括保藏编号为CGMCC?NO.8910的环状芽孢杆菌。本发明还提供了如上所述的环状芽孢杆菌和如上所述的微生物菌剂在防治农作物的病害中的应用。通过上述技术方案，本发明可以更加有效地防治番茄灰霉病等农作物的病害。
【专利说明】环状芽孢杆菌及微生物菌剂和它们的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物【技术领域】，具体地，涉及一种环状芽孢杆菌、一种微生物菌剂和它们的应用。
【背景技术】
[0002]番爺灰霉病是番爺上危害较重且常见的病害,各菜区都发生。除危害番爺外，还可危害茄子、辣椒、黄瓜、瓠瓜等20多种作物。低温、连续阴雨天气多的年份危害严重。发病严重时造成茎叶枯死和大量的烂花、烂果，直接影响产量。遭受番茄灰霉病侵染的番茄一般减产20%-30%,有时减产高达50%左右，严重时甚至造成番茄绝产。番茄灰霉病病原为半知菌亚门的葡萄孢菌。病菌主要以菌核(寒冷地区)或菌丝体及分孢梗(温暖地区)随病残体遗落在土中越夏或越冬，条件适宜时，萌发菌丝，产生分生孢子，借气流、雨水和人们生产活动进行传播。分生孢子依靠气流传播，从寄主伤口或衰老器官侵入致病。病菌为弱寄生菌，可在有机物上营腐生生活。
[0003]目前，番茄灰霉病的防治主要采用化学药剂法，化学药剂例如聚砹嘧霉胺、氯溴异氰尿酸、丙环唑、恶霜菌酯、多菌灵、速克灵、扑海因、甲基嘧菌胺、菌核净、嘧菌酯、百菌清、甲基托布津和噻菌灵等。生物防治法也有望应用于番茄灰霉病的防治，其相比化学药剂法具有低残留等优点，但是目前生物防治法所用的微生物菌株的防治效果仍然不高。
【发明内容】
[0004]为了克服现有的微生物菌株防治番茄灰霉病的效果较差的缺陷，本发明提供了一种环状芽孢杆菌，该环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的保藏编号为CGMCC N0.8910。
[0005]本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，所述菌体包括保藏编号为CGMCC N0.8910的环状芽孢杆菌。
[0006]本发明还提供了如上所述的环状芽孢杆菌和如上所述的微生物菌剂在防治农作物的病害中的应用。
[0007]通过上述技术方案，本发明可以更加有效地防治番茄灰霉病等农作物的病害。
[0008]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
[0009]生物材料保藏
[0010]本发明的环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)是本发明的发明人从四川泸州白酒生产厂的下层窖泥样品中分离的纯培养物，其保藏编号为CGMCC N0.8910，保藏日期为2014年3月12日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)。
【具体实施方式】
[0011]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0012]本发明提供了一种环状芽孢杆菌，该环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的保藏编号为 CGMCC N0.8910。
[0013]本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，所述菌体包括保藏编号为CGMCC N0.8910的环状芽孢杆菌。
[0014]其中，所述微生物菌剂中含有的菌体的量可以在很大范围内改变，例如每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC N0.8910的环状芽孢杆菌的活菌数可以为(2-200) X IO7CFU,优选情况下，每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC N0.8910的环状芽孢杆菌的活菌数可以为(20-120) X 107CFU。
[0015]根据本发明，所述培养基的种类可以在很大范围内改变，可以将各种能够用于培养环状芽孢杆菌的培养基，例如，可以为牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基、LB培养基等常用培养基作为种子培养基，用于菌种的保存；而发酵的培养基一般用于生产，这些培养基的种类也为本领域技术人员所公知。上述培养基能够商购得到或者根据“微生物培养基手册”(Microbiology Culture Media Manual)的记载制备得到。例如，种子培养基可以为牛肉膏蛋白胨培养基，其含有I_3g/L的牛肉膏、5-15g/L的蛋白胨、3-8g/L的氯化钠、15-20g/L的琼脂。例如发酵培养基可以含有:3-7g/L的淀粉、0.5-2g/L的蔗糖、0.5_2g/L的碳酸钙、l-3g/L的硫酸铵、0.5-2g/L的磷酸二氢钾和0.3-0.8g/L的氯化镁。又例如，所述发酵培养基可以含有 :10-40g/L的蔗糖、l-5g/L的豆饼粉、l-4g/L的硫酸铵、0.1-0.3g/L的酵母粉、0.5-lg/L的磷酸氢二铵、0.01-0.lg/L的氯化镁和0.05-0.2g/L的氯化钠。
[0016]其中，上述各种培养基可以按照常规的灭菌方法进行灭菌后备用，例如在115-125°C和1.5-2个标准大气压的条件下灭菌10_30分钟。
[0017]其中，所述微生物菌剂的制备方法可以包括:将CGMCC N0.8910的环状芽孢杆菌接种于发酵培养基中进行培养。优选情况下，通过培养使得到的每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC N0.8910的环状芽孢杆菌的活菌数可以为(1_50) X IO7CFU,更优选为(2-20) X 107CFU。其中，培养的温度可以为30-35°C，培养的时间可以为24-48小时。
[0018]本发明还提供了如上所述的环状芽孢杆菌和如上所述的微生物菌剂在防治农作物的病害中的应用。
[0019]特别优选地,所述农作物的病害包括由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引发的灰霉病。例如，所述灰霉病包括番茄灰霉病、黄瓜灰霉病、葡萄灰霉病、草莓灰霉病、苣荬菜灰霉病、爺子灰霉病、辣椒灰霉病、桃灰霉病和甜瓜灰霉病中的至少一种。
[0020]以下通过实施例进一步详细说明本发明:
[0021]实施例1
[0022]本实施例用于说明本发明的环状芽孢杆菌的培养及微生物菌剂的制备。
[0023]将保藏编号为CGMCC N0.8910的环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在30°C和180转/分振荡下培养至菌密度0D_值为0.6-0.8，得到种子菌液。
[0024]将IOOmL上述种子菌液加入100L发酵培养基中(发酵培养基含有30g/L的蔗糖、3g/L的豆饼粉、2g/L的硫酸铵、0.2g/L的酵母粉、0.8g/L的磷酸氢二铵、0.08g/L的氯化镁和0.lg/L的氯化钠)，在30°C下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的环状芽孢杆菌的活菌数为IO8CFU,所得到的培养液即为本实施例的微生物菌剂。
[0025]实施例2
[0026]按照实施例1的方法制备微生物菌剂，不同的是，所用的发酵培养基为含有5g/L的淀粉、lg/L的蔗糖、lg/L的碳酸钙、2g/L的硫酸铵、lg/L的磷酸二氢钾和0.5g/L的氯化镁的培养基。
[0027]对比例I
[0028]将购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)的商品号为11078的环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在30°C和180转/分振荡下培养至菌密度OD600值为0.6-0.8，得到种子菌液。
[0029]将IOOmL上述种子菌液加入100L发酵培养基中(发酵培养基含有30g/L的蔗糖、3g/L的豆饼粉、2g/L的硫酸铵、0.2g/L的酵母粉、0.8g/L的磷酸氢二铵、0.08g/L的氯化镁和0.lg/L的氯化钠)，在30°C下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的环状芽孢杆菌的活菌数为IO8CFU,所得到的培养液即为本对比例的微生物菌剂。
[0030]测试实施例1
[0031]本测试实施例中，在实验室环境测试实施例1、2和对比例I的微生物菌剂对购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的抑制作用。灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)是多种作物的灰霉病的病原菌,其中，商品号为ACCC36037的灰葡萄孢菌是番茄灰霉病的致病菌；商品号为ACCC36041的灰葡萄孢菌是黄瓜灰霉病的致病菌；商品号为ACCC36044的灰葡萄孢菌是苣荬菜灰霉病的致病菌；商品号为ACCC36047的灰葡萄孢菌是茄子灰霉病的致病菌；商品号为ACCC36056的灰葡萄孢菌是辣椒灰霉病的致病菌；商品号为ACCC36058的灰葡萄孢菌是桃灰霉病的致病菌；商品号为ACCC36055的灰葡萄孢菌是甜瓜灰霉病的致病菌。将上述7种灰葡萄孢菌在马铃薯液体培养基(20g马铃薯去皮，切成块加水，煮沸30min，用纱布过滤，滤液加2g葡萄糖，补足水至lOOmL，灭菌后得到)中分别培养至对数期，然后分别涂布在马铃薯平板培养基平板(20g马铃薯去皮，切成块加水，煮沸30min,用纱布过滤,滤液加2g葡萄糖和2g琼脂糖,补足水至IOOmL,灭菌后倒平板得到)上，然后在平板上挖取直径Icm的孔，将实施例1、2和对比例I的微生物菌剂分别加入孔中，28°C下培养4天后，测定抑菌圈的直径，结果如表1所示。
[0032]表1
[0033]
【权利要求】
1.一种环状芽孢杆菌，其特征在于:该环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的保藏编号为 CGMCC N0.8910。
2.一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，其特征在于:所述菌体包括保藏编号为CGMCC N0.8910的环状芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于:每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC N0.8910的环状芽孢杆菌的活菌数为(2-200) X 107CFU。
4.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于:所述培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基和LB培养基中的至少一种。
5.根据权利要求2或3所述的维生素菌剂，其特征在于:所述培养基含有3-7g/L的淀粉、0.5-2g/L的蔗糖、0.5-2g/L的碳酸钙、l_3g/L的硫酸铵、0.5_2g/L的磷酸二氢钾和0.3-0.8g/L的氯化镁。
6.根据权利要求2或3所述的维生素菌剂，其特征在于:所述培养基含有10-40g/L的蔗糖、l-5g/L的豆饼粉、l_4g/L的硫酸铵、0.1-0.3g/L的酵母粉、0.5-lg/L的磷酸氢二铵、0.01-0.lg/L的氯化镁和0.05-0.2g/L的氯化钠。
7.权利要求1所述的环状芽孢杆菌和权利要求2-6中任意一项所述的微生物菌剂在防治农作物的病害中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述农作物的病害包括由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引发的灰霉病。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述灰霉病包括番爺灰霉病、黄瓜灰霉病、葡萄灰霉病、草莓灰霉病、苣荬菜灰霉病、爺子灰霉病、辣椒灰霉病、桃灰霉病和甜瓜灰霉病中的至少一种。
【文档编号】A01N63/00GK103952352SQ201410168116
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月24日 优先权日:2014年4月24日
【发明者】赵君才, 阮志勇, 赵秉强, 王慧敏, 赵文勇, 吕昭辉, 刘慧 , 宋昭, 王彦伟, 刘小飞 申请人:烟台海上传奇生物科技有限公司