一种StP5CS耐盐转基因大豆的培育方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学与生物【技术领域】，涉及基因StP5CS及其在耐盐转基因大豆培育中应用，提供利用该基因培育耐盐转基因大豆方法、培育过程中使用的StP5CS过表达载体和工程菌、转基因大豆StP5CS基因荧光定量方法和检测试剂盒。本发明提供的StP5CS耐盐转基因大豆方法为：1)在植物表达载体pCAMBIA3301-StP5CS构建基础上，获得StP5CS耐盐转基因大豆转化体；2)筛选纯合体转基因大豆。本发明解决现有技术中StP5CS在耐盐转基因育种中空白，该基因在转基因植株中超量表达，提高目标作物耐盐性。本发明的载体还含有广谱除草剂抗性基因，既方便检测又赋予转基因大豆抗除草剂特性，便于生产应用。
【专利说明】-种StP5CS耐盐转基因大s_的培育方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学与生物【技术领域】，涉及野生茄子Λ L吡咯啉-5-羧酸合成 酶基因 StP5CS及该基因在耐盐转基因大豆培育中的应用，提供利用该基因培育耐盐转基 因大豆的方法、在培育过程中使用的StP5CS过表达载体和工程菌、以及转基因大豆StP5CS 基因荧光定量方法和检测试剂盒。 技术背景
[0002] 大豆是我国重要的粮食作物和油料作物。然而，由于受国外进口转基因大豆的影 响，我国大豆生产面积和产量逐年下降，截止2012年大豆总产量为1449万吨，仅占世界大 豆总产量的 5 % (国家统计局：http://data, stats, gov. cn/ 和 SoyStats :http://www. soystats. com)。目前，我国已经成为是世界上主要的大豆消费国和进口国，每年消费的大 豆约有80%依赖于国外进口，其中2012年进口大豆5838万吨，占世界大豆总产量的20% (国家统计局：http://data, stats, gov. cn/)。随着经济的持续发展和人口数量的增加，我 国对大豆的需求量将日益增大，扩大大豆种植面积，提高大豆产量已是当务之急。东北地区 是大豆的主产区，同时也是土地盐碱化最严重的地区之一，盐碱土面积384万hm 2,约占全区 总面积的3.1% (姚荣江，杨劲松，刘广明.东北地区盐碱土特征及其农业生物治理.土 壤，2006, 38:256-262.)。大豆属盐敏感作物，在盐胁迫条件下栽培大豆的株高、茎节数、分 枝数、百粒重、单株荚数、粒数和粒重等显著下降，品质降低，东北地区的土壤盐碱化严重限 制了大豆的生产（Phang T H，Shao G H, Lam Η M. Salt tolerance in soybean. Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50 (10): 1196-1212·)。因此，培育大豆耐盐新品种对 减少盐害对大豆生产的影响，扩大大豆种植面积具有重要意义。
[0003] 随着对大豆耐盐机制的研究不断深入和对耐盐相关基因的挖掘，借助转基因手 段培育耐盐新种质将是一种有效的途径。目前，抗除草剂、抗虫、低反式脂肪酸和高油酸 转基因大豆已经在国外大面积种植，并取得较好的经济效益，然而关于耐盐转基因大豆 的培育及商业化种植报道较少。有研究表明在大豆中过量表达拟南芥AtMYB44转录因 子能显著提高200mM NaCl胁迫条件下转基因植株的耐盐性，并且在田间试验中转基因大 豆产量显著高于对照（Seo J S，Sohn H B，Noh K, Jung C, An J H, Donovan C M, Somers D A, Kim D I,Jeong S C, Kim C G.Expression of the Arabidopsis AtMYB44gene confers drought/salt-stress tolerance in transgenic soybean.Molecular Breeding, 2012, 29:601-608.)。此外，在大豆中过量表达一个来源于水稻的0sDREB2A转录 因子，可以促进转基因大豆中可溶性糖和脯氨酸的积累，以及诱导胁迫响应相关转录因子 和基因的表达，进而提高转基因大豆的耐盐性（Zhang X X，Tang Y J，Ma Q B, Yang C Y, Mu Y H, Suo H C, Luo L H, Nian H. 0sDREB2A, a rice transcription factor, significantly affects salt tolerance in transgenic soybean. PloS One, 2013, 8:e83011. )〇 以 上报道说明，通过转基因手段在大豆植株中过表达耐盐相关基因培育耐盐新种质具有 可行性。目前，除了已经报道的耐盐相关转录因子之外，已经证实在转基因植物中超量 表达小分子量化合物（如脯氨酸、甜菜碱、甘露醇、糖类、多胺类等）合成途径的相关基 因，促进这些渗透调节物质在植物体内的累积，能够提高转基因植物的耐盐性（Ashraf M，Akram N A. Improving salinity tolerance of plants through conventional breeding and genetic engineering:an analytical comparison. Biotechnology Advances，2009, 27(6) :744-752.)。
[0004] 脯氨酸是一种小分子的渗透调节物质，是水溶性最大的氨基酸。植物体内通 常大量积累脯氨酸以提高自身的抗渗透胁迫能力（Szabados L，Savour6A.Proline:a multifunctional amino acid. Trends in Plant Science, 2010, 15(2):89-97. )〇 盐 胁迫条件下，植物主要通过谷氨酸途径合成脯氨酸（Kiran Kumar Ghanti S，Sujata K G, Vijay Kumar B M，Nataraja Karba N，Janardhan Reddy K，Srinath Rao M, Kavi Kishor P B. Heterologous expression of P5CS gene in chickpea enhances salt tolerance without affecting yield. Biologia Plantarum，2011，55 (4):634-640.)〇 Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 P5CS是谷氨酸途径的关键基因，编码脯氨酸生物合 成的关键酶，在植物对盐胁迫的响应中发挥重要作用（Rai A N，Penna S.Molecular evolution of plant P5CS gene involved in proline biosynthesis. Molecular Biology R印orts，2013, 40:6429-6435.)。通过基因工程手段在植物体内过量表达P5CS，可促进脯 氨酸的积累，提高植物的耐盐性。目前，已经报道了多种耐盐性增强的转P5CS基因植物， 如烟草、水稻、小麦、马铃薯、鹰嘴豆和鴻豆等（Ashraf M, Akram N A. Improving salinity tolerance of plants through conventional breeding and genetic engineering:an analytical comparison. Biotechnology Advances, 2009, 27 (6): 744-752·)。但未见有将 P5CS基因转入大豆培育P5CS耐盐转基因大豆的报道。
[0005] 野生爺子（Solanum torvum Swartz)是爺子的近缘野生种，耐盐性强，在设施栽培 中常用作嫁接砧木以缓解设施土壤中次生盐渍化的危害（Wei G P，Yang L F，Zhu Y L，Chen G. Changes in oxidative damage, antioxidant enzyme activities and polyamine contents in leaves of grafted and non-grafted eggplant seedlings under stress by excess of calcium nitrate. Scientia Horticulturae, 2009, 120:443-451.) 〇 目前关 于野生茄子中耐盐基因的发掘报道较少，利用基因工程手段将野生茄子耐盐基因特别是脯 氨酸合成积累相关基因导入作物中培育耐盐新种质尚未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是解决现有技术中StP5CS基因在耐盐转基因大豆育种中的空白，培 育大豆耐盐新种质，提高大豆的耐盐性，从而降低盐害对大豆生产中的影响，促进大豆生 产。
[0007] 本发明的目的通过以下技术手段获得
[0008] 本发明提供一种野生茄子Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS，该基因序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0009] 一种重组载体，该重组载体包含Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS。
[0010] 重组载体可以将上述基因 StP5CS插入到克隆载体或表达载体而得到。本发明采 用的基础载体包括PMD19-T载体和pCAMBIA3301载体，但本发明所述的重组载体并不限于 以上述2种载体为基础与基因 StP5CS重组后获得的载体，任何可以与基因 StP5CS进行重 组并可在宿主细胞中进行复制和表达的重组载体均应为本发明保护的范围。
[0011] 本发明上述的重组载体，为植物表达载体pCAMBIA3301-StP5CS，含有StP5CS基因 和抗除草剂bar基因，将StP5CS基因的5'端和3'端分别引入CaMV35S启动子和nos终止 子，并克隆到基础载体PCAMBIA3301的T-DNA区得到的。
[0012] 包含上述重组载体的转化细胞。
[0013] 上述重组载体为包含基因 StP5CS的载体或质粒。转化细胞是宿主细胞经过转 化或侵染后得到的细胞。宿主细胞可以为原核生物细胞--其可用于繁殖载体和真核细 胞--其可用于表达核酸。
[0014] 一种StP5CS耐盐转基因大豆的培育方法，该方法将野生茄子StP5CS基因构建至 PCAMBIA3301表达载体中，通过该表达载体将外源StP5CS基因导入大豆基因组中获得耐盐 转基因大豆。
[0015] 本发明实施例中，将该表达载体所携带的外源基因 StP5CS基因导入大豆基因组 中是通过根癌农杆菌EHA105介导的农杆菌转化法完成的，但是，本实验提供的方法不仅限 于此，任何一种转化方法能将本发明提供的外源基因 StP5CS导入大豆基因组中都适用。
[0016] 上述的StP5CS耐盐转基因大豆的培育方法，包括如下步骤：
[0017] 1) StP5CS耐盐转基因大豆转化体的获得
[0018] 将上述的植物表达载体pCAMBIA3301-StP5CS导入大豆基因组，通过除草剂筛选 获得L代转基因大豆植株；
[0019] 2)纯合体转基因大豆的筛选
[0020] 利用⑶S组织化学分析法和PCR鉴定法检测?\代转基因大豆，获得阳性植株，进 行自交获得τ 2代种子。选取Τ2代种子萌发后的第一片完全展开叶，利用GUS组织化学分析 法和PCR鉴定法，选择均为阳性的株系，即为纯合体转基因株系。
[0021] 本发明一个实施例中，将植物表达载体pCAMBIA3301-StP5CS导入大豆基因组是 通过农杆菌侵染大豆子叶外植体完成的。
[0022] 上述基因或重组载体在耐盐转基因植物中的应用，优选地，为耐盐转基因大豆中 的应用。
[0023] 本发明所述野生茄子Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS，取自野生茄子 (Solanum torvum Swartz cv. 'Torvum Vigor'）叶片中，是爺子的近缘野生种，属爺科。因 此，可以预见，该基因可应用于茄科任一种物种，而本发明优选地在转基因大豆中的应用， 只是本发明实施例中的一个方案，证明该基因可应用于非茄科物种中。
[0024] 上述转化细胞在耐盐转基因植物中的应用，优选地，为耐盐转基因大豆中的应用。
[0025] 本发明提供一种耐盐转基因大豆StP5CS基因相对表达量的测定方法，该方法通 过设计特异性引物，经荧光定量PCR测定StP5CS基因在耐盐转基因大豆中的表达量；
[0026] 其中，特异性引物：
[0027] 上游引物PF4 :如SEQ ID No. 13所示，
[0028] 下游引物PR4 :如SEQ ID No. 14所示。
[0029] 本发明还提供一种耐盐转基因大豆StP5CS基因相对表达量测定的试剂盒，该试 剂盒包括如下序列：
[0030] StP5CS基因检测引物，上游引物PF4 :如SEQ ID No. 13所示，下游引物PR4 :如SEQ ID No. 14 所示；
[0031] 大豆内参基因 ELFlb的检测引物，上游引物ELFlbF :如SEQ ID No. 15所示；下游 引物 ELFlbR :如 SEQ ID No. 16 所示。
[0032] 本发明有益效果：
[0033] 1.本发明提供了一个新的野生茄子Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS基因， 该基因编码脯氨酸合成途径的关键酶；在植物中过量表达该基因可以促进目标植物体内脯 氨酸的大量积累，提高目标植物的耐盐性。
[0034] 2.本发明构建的StP5CS基因重组植物表达载体pCAMBIA3301-StP5CS，将StP5CS 基因5'端和3'端分别引入CaMV35S启动子和nos终止子，提高了 StP5CS基因的表达水 平；该载体可以应用于多种耐盐转基因植株的培育，尤其是耐盐转基因大豆的培育，填补了 现有技术中的空白。
[0035] 3.采用本发明提供的耐盐转基因大豆的培育方法生产出的含有StP5CS基因的转 基因大豆，具有耐盐的特性，可在盐渍化环境下种植，通过试验鉴定，通过本发明提供的培 育方法生产出的耐盐转基因大豆，盆栽条件下可以耐受1. 17%氯化钠（200mM NaCl)胁迫， 水培条件下可以耐受0.59%氯化钠（100mM NaCl)胁迫，在胁迫条件下转基因植株生长状 况良好，结荚数也显著高于野生型对照植株。
[0036] 4.本发明构建的StP5CS基因重组植物表达载体pCAMBIA3301-StP5CS，除了含有 耐盐StP5CS基因之外，还含有除草剂抗性基因 bar基因，赋予了转基因植株耐盐和抗除草 剂双重特性，更有利于在生产中的应用。
[0037] 5.本发明通过设计特异的检测引物，使用荧光定量PCR技术，定量测定StP5CS基 因在转基因大豆中的相对表达量，从而实时监测StP5CS基因在转基因大豆中的表达情况， 为转基因大豆的育种和检测提供方便。
【专利附图】
【附图说明】
[0038] 图1植物表达载体pCAMBIA3301-StP5CS构建流程图
[0039] 图2StP5CS的克隆及植物表达载体pCAMBIA3301-StP5CS的酶切鉴定
[0040] A图：StP5CS琼脂糖凝胶电泳分析
[0041] M :DNA Marker 电泳条带，由上至下大小分别为 2Kb、lKb、0. 75Kb、0. 5Kb、0. 25Kb 和 0. 1Kb ；
[0042] 1 :StP5CS 电泳条带；
[0043] B图：中间载体pCAMBIA3301-T800双酶切检测琼脂糖凝胶电泳分析
[0044] M :DNA Marker 电泳条带，由上至下大小分别为 2Kb、lKb、0. 75Kb、0. 5Kb、0. 25Kb 和 0. 1Kb ；
[0045] 1 :HindIII/EcoRI 双酶切 pCAMBIA3301-T800 产物电泳条带；
[0046] 2 :pCAMBIA3301-T800 质粒电泳条带；
[0047] C图：植物表达载体pCAMBIA3301-StP5CS双酶切检测琼脂糖凝胶电泳分析
[0048] M:DNA Marker 由上至下大小分别为 15Kb、10Kb、7. 5Kb、5Kb、2. 5Kb、lKb 和 0.25Kb ；
[0049] 1，2 :BamHI/SalI 双酶切 pCAMBIA3301-StP5CS 产物电泳条带；
[0050] 3 :pCAMBIA3301-StP5CS 质粒电泳条带；
[0051] 图3转基因大豆的获得流程图
[0052] A图：大豆种子萌发后的无菌苗；B图：外植体与农杆菌共培养；C图：不定芽的诱 导；D图：不定芽的伸长；E图：伸长的不定芽；F图：半叶法GUS组织化学分析；G图：生根培 养；Η图：移栽于温室的转基因苗；I图：转基因大豆植株抗除草剂Basta鉴定；J图：非转基 因大豆植株抗除草剂Basta鉴定；
[0053] 图4转基因大豆不同组织器官⑶S组织化学分析
[0054] 所有小图中左侧为转基因植株组织器官，右侧为野生型对照植株组织器官；A图： TQ叶片；B图：TQ茎段；C图和D图：TQ花（花药和柱头）；E图：T Q豆荚；F图：萌发72h的?\ 种子；G图：萌发24h的Τ2种子；Η图：Τ2幼苗的侧根；坚线为标尺，标尺=0. 5cm
[0055] 图5转基因大豆L代植株PCR和Southern鉴定
[0056] A图：转基因大豆?；代植株PCR鉴定；B图：转基因大豆?；代植株Southern鉴定； P :pCAMBIA3301-StP5CS质粒；WT :未转化植株，Z1和Z2 :TQ转基因植株；
[0057] 图6转基因大豆纯合体株系的耐盐性鉴定
[0058] A图：T2代纯合体转基因植株在盆栽试验200mM NaCl胁迫条件下的生长表现；
[0059] B图：T3代纯合体转基因植株在水培试验lOOmM NaCl胁迫条件下的生长表现；
[0060] 图7T3代纯合体转基因植株中外源StP5CS基因的荧光定量表达分析
[0061] WT:野生型植株阴性对照；Z1-3和Z2-7 :分别为1~3代转基因大豆株系Z1-3和 Z2-7 ;相对表达量数据为8次重复（8株植株）的平均值；数据采用Student's t测验进行 显著性差异分析，*表示处理间的差异达5%显著水平，**表示处理间的差异达1%显著水 平。
【具体实施方式】
[0062] 下述实施例中所用方法若无特殊说明均为本领域惯用的技术手段，所用的试剂、 材料，如无特殊说明均可通过商业途径得到。
[0063] 一、StP5CS基因的克隆及植物表达载体的构建
[0064] 本发明从野生爺子（Solanum torvum Swartz cv. 'Torvum Vigor'）叶片中克隆 了一个新的Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS，以pCAMBIA3301载体为基础载体构建 含有该基因的过表达载体，构建流程如图1所示，【具体实施方式】如下：
[0065] 1.野生茄子Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS的克隆：
[0066] 以3周龄野生茄子幼苗叶片为材料，采用TaKaRa公司总RNA提取试剂（目录号： D9108A)提取总RNA。然后将总RNA反转录成cDNA。参照番茄P5CS基因序列信息（NCBI登 录号：U60267)，设计特异引物扩增如SEQ ID NO. 1所示基因片段；
[0067] 其中，特异性引物为：
[0068] 正向引物PF1 :如SEQ ID N0. 2所示
[0069] 反向引物PR1 :如SEQ ID NO. 3所示
[0070] 以上述获得的野生茄子cDNA为模板进行PCR反应，50yL反应体系包含： 10 X PCRBuffer5. 0 μ L，dNTP mix4. 0 μ L (2. 5mmol · Γ1)，MgCl23 μ L (25mmol · Γ1)，PF1、PR1 引物各 1· Ομ L(20ymol .171)，Taq DNA PolymeraseO. 2μ L，cDNA 模板 1 μ L，ddH2034. 8μ L ; 反应程序：95°C预变性4min，然后30个循环反应包括94°C解链30sec，52. 7°C退火30sec， 72°C延伸2min30sec，最后72°C延伸lOmin ;PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果 如图2A所示。检测结束后，将PCR产物用凝胶回收试剂盒（AXYGEN，目录号：AP-GX-50)回 收纯化，用T 4DNA连接酶（TaKaRa，目录号：D2011A)连接到pMD19-T载体（TaKaRa，目录号： D102A)，转化T0P10感受态细胞，进行序列测定；
[0071] 2.中间载体 pCAMBIA3301-T800 的改造
[0072] 全序列合成含有CaMV35S启动子、多克隆位点、nos终止子的T800序列片段，其序 列如SEQ ID N0. 4所示，通过合成在T800序列片段两端分别引入EcoRI和Hindlll酶切位 点；使用EcoRI(Promega，目录号：R6011)和HindIII(Promega，目录号：R6041)双酶切基础 载体PCAMBIA3301 (CAMBIA，Australia)和T800片段，得到酶切产物，将酶切产物按1:4的 比例用T4DNA连接酶（TaKaRa，目录号：D2011A)连接，产物按照常规方法转化T0P10感受态 细胞，提取质粒，酶切验证，具体过程如下所述：
[0073] 1)取pCAMBIA3301质粒和T800片段各15 μ L，分别用EcoRI和Hindlll双酶切， 其中，50μ L 双酶切体系：10XBuffer Ε5μ L，BSA0. 5μ L，DNA15y L，EcoR II. 25μ L，Hind III1. 25 μ L，ddH2027 μ L ;37°C酶切反应3h，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，回收质粒 PCAMBIA3301 大片段（11256bp)和 T800 小片段（849bp);
[0074] 2)将上述酶切后的回收片段，按照大片段与小片段1:4的比例用T4DNA连接酶连 接，连接反应体系（25yL) :10XT4ligase Buffer2.5yL，pCAMBIA3301 大片段 2yL，T800 小片段8以1^，1'40嫩连接酶1以1^，(1(1!12011.5以1^161：反应过夜，获得连接产物 ；取1(^1^连 接产物转化T0P10感受态细胞，涂布于LB平板，37°C过夜培养；挑取单克隆扩大培养后， 提取质粒，进行酶切验证，如图2B所示；含有CaMV35S启动子、多克隆位点、nos终止子的 PCAMBIA3301-T800中间载体改造完成；
[0075] 3.植物表达载体pCAMBIA3301-StP5CS的构建
[0076] 设计引物进行PCR反应，在目的基因StP5CS的5'端和3'端分别引入酶切位点 BamHI 和 Sail，米用 BamHI(Promega，目录号：R6021)和 SalI(Promega，目录号：R6051)双 酶切PCAMBIA3301-T800中间载体和StP5CS基因PCR产物，回收pCAMBIA3301-T800大片段 (12097bp)和StP5CS (2250bp)片段，按1:4的比例用T4DNA连接酶连接，产物转化T0P10感 受态细胞，提取质粒，进行双酶切验证，【具体实施方式】如下：
[0077] 其中，引物为：
[0078] 正向引物PF2:如SEQ ID N0. 5所示；
[0079] 反向引物PR2:如SEQ ID Ν0· 6所示。
[0080] 1)以野生茄子叶片cDNA作为模板，用高保真酶（PrimeSTAR? HS DNA Polymerase，TaKaRa 目录号：DR010A)进行 PCR 反应，50yL 反应体系：10XPCR Buffer5. 0 μ L，dNTP mix4. 0 μ L(2. 5mmol · Γ1)，引物 PF2 和 PR2 各 1· 0 μ L(20 μ mol · Γ1)， PrimeSTAR? HS DNA PolymeraseO. 4 μ L，cDNA 模板 1 μ L，ddH2037. 6 μ L ;反应程序：95°C预 变性4min，然后30个循环反应包括98°C解链10sec，68°C延伸2min30sec，最后72°C延伸 lOmin。PCR产物用凝胶回收试剂盒回收，进行序列测定；
[0081] 2)分别取改造好的pCAMBIA3301-T800中间载体和含有酶切位点的StP5CS PCR产 物各15μL，用BamHI和SalI双酶切，双酶切体系（50μL):10XBufferE5μL，BSA(λ5μL， DNA15y L，BamHIl. 25μ L，Salll. 25μ L，（ΜΗ2027 μ L ;37°C酶切反应 3h ;酶切结束后进行 琼脂糖凝胶电泳分离，回收质粒PCAMBIA3301-T800大片段（12097bp)和StP5CS小片段 (2250bp)；
[0082] 3)上述回收的大片段和小片段，按照1:4的比例，用T4DNA连接酶连接，连接反应 体系（25μ L) :10XT4ligase Buffer2. 5μ L，PCAMBIA3301-T800 大片段 2μ L，StP5CS 小片 段8 μ L，T4DNA连接酶1 μ L，ddH2011. 5 μ L ; 16°C反应过夜，取10 μ L连接产物转化T0P10感 受态细胞。37°C过夜培养，挑取单克隆扩大培养，提取质粒，进行酶切验证（图2C)，植物表 达载体pCAMBIA3301-StP5CS的构建成功。
[0083] 二、植物表达载体采用冻融法转化农杆菌菌株EHA105
[0084] 实验用农杆菌 EHA105 在文献（Hood E E, Gelvin S B, Melchers L S, Hoekema A. New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgenic Research, 1993,2:208-218.)中公开过，购自北京天恩泽生物技术有限公司。冻融法转 化农杆菌的具体方法在文献（Jyothishwaran G，Kotresha D，Selvaraj T，Srideshikan S,Rajvanshi P,Jayabaskaran C. A modified freeze-thaw method for efficient transformation of Agrobacterium tumefaciens. Current Science, 2007, 93:770-772.) 中公开过。
[0085] 1.根癌农杆菌EHA105感受态的制备
[0086] 取_70°C保存的EHA105甘油菌于YEB固体培养基划线活化；挑取单菌落，接到5mL YEB液体培养基，28°C，250rpm培养过夜进行活化；取2. 5mL活化的菌液，加入到50mL YEB 液体培养基中，28°C，250rpm扩大培养至0D_值约0. 5-0. 6左右；将菌液转至50mL无菌离 心管中，冰浴3〇111；[11，41€，6000印1]1离心5111；[11 ;弃上清，沉淀用101]11^预冷的0.151似(]1悬浮 后4°C，6000rpm，离心5min，弃上清液；将沉淀再次用2mL CaCl2 (20mM)悬浮后，每份200 μ L 分装到1. 5mL离心管中，液氮迅速冷冻lmin，保存于-70°C冰箱备用。
[0087] 2.植物表达载体冻融法转化根癌农杆菌
[0088] 取_70°C保存的EHA105感受态细胞，置冰上融化；取2 μ g纯化的植物表达载体 pCAMBIA3301-T800-StP5CS质粒，加入到200 μ L已解冻的菌液中，轻轻混合，冰浴30min。然 后转移至液氮中冷冻3min，迅速转至37°C水浴中温浴5min ;向菌液中加入800 μ L新鲜YEB 液体培养基（蛋白胨5g · ΙΛ酵母提取物lg · ΙΛ牛肉膏5g · L'MgSC^ · 7H200. 5g · ΙΛ蔗 糖5g · Γ1，pH值至7· 0)，28°C，lOOrprn，振荡培养2-4h，使菌体复苏。将菌液5000rpm离心 5min，弃去大部分上清液，剩余菌液吸打混匀；涂布于含有50mg · Γ1卡那霉素的YEB固体 培养基；28°C培养直至出现单克隆；挑取单克隆，接种到5mL YEB液体培养基（含50mg吨4 卡那霉素），28°C，250rpm培养过夜，PCR检测阳性菌液制备甘油菌，-70°C保存。
[0089] 三、农杆菌介导StP5CS基因转化大豆
[0090] 大豆品种 'ΝΥ-100Γ 及转化方法在文献（Liu S C，Zhang G C，Yang L F，Mii M，Gai J Y，Zhu Y L Bialaphos-resistant transgenic soybeans produced by the Agrobacterium-mediated cotyledonary-node method.Journal of Agricultural Science and Technology，2014, 16:175-190.)中公开过。
[0091] 1.外植体的制备及农杆菌侵染
[0092] 取成熟饱满的'ΝΥ100Γ大豆种子，在密闭容器中氯气表面消毒16h(氯气由 3. 5mL12N的HC1和100mL5. 25%的次氯酸钠混合制得）。消毒结束后转移至萌发培养基 (B5基本培养基+3% (w/v)蔗糖+0.8% (w/v)琼脂，pH5.8)，25°C条件下，光照（16/8h， 90 μ mol · m_2 · S_〇培养5天，获得无菌苗（图3A)，切取子叶节作为外植体。
[0093] 将含有pCAMBIA3301-T800-StP5CS载体的农杆菌ΕΗΑ105划线于ΥΕΒ平板，28°C培 养24h，挑取单克隆液体培养24h，然后取2mL复苏的菌液加入200mL YEP液体培养基中，扩 大培养至〇D65(l为0. 8,菌液离心后，用液体共培养培养基（1/10B5,1. 67mg · L、-苄基氨基 噪呤，0.2511^^171 赤霉素，200 μ mol· L-1 乙酰丁香酮，3% (w/v)鹿糖和 0.7% (w/v)琼脂， PH5. 4)重悬，调节0D65(I值为1。每25个外植体加入到50mL重悬菌液中，侵染30min，期间 每隔lOmin摇动一次。侵染结束后，吸干多余菌液，将外植体近轴面向下放置于铺有一层滤 纸的共培养基上（添加3. 3mmol · L^L-半胱氨酸，lmmol · I71硫代硫酸钠和lmmol · I71二 硫苏糖醇），22°C遮光共培养4天（图3B)。
[0094] 2.转基因大豆的再生与筛选
[0095] 1)不定芽的诱导
[0096] 共培养结束后的外植体，用液体芽诱导培养基（B5,1. 67mg · L、-苄基氨基嘌呤， 500mg .171羧节青霉素，3% (w/v)鹿糖，3mmol .1^2-吗啉乙磺酸，pH5. 6)摇动洗漆4-5次， 近轴面向上置于固体芽诱导培养基（液体芽诱导培养基添加0.8% (w/v)琼脂）。25°C光 照（16/8h，90ymol m^V1)培养10天。10天后，外植体转移至含有4mg·]^双丙氨膦的芽 诱导筛选培养基（图3C)，筛选培养4周，每2周继代一次。
[0097] 2)芽伸长培养
[0098] 将筛选后含有丛生芽的外植体，转移到芽伸长培养基（MS, lmg · I71玉米素， 0. 5mg · I71赤霉素,0. lmg · I71卩引哚乙酸，100mg · L-1焦谷氨酸，50mg · I^L-天冬酰胺， 30011^171羧苄青霉素，双丙氨膦，3 % (w/v)蔗糖，3mmol .1^2-吗啉乙磺酸和 0· 8% (w/v)的琼脂，ρΗ5· 6)，芽伸长6-8周（图3D和3E)，每隔2周继代1次。
[0099] 3)半叶法转化体的筛选
[0100] 为尽早确定转化体，当有不定芽伸长时，采用半叶法进行GUS组织化学鉴定，先对 伸长的芽逐一编号，用无菌手术剪从每个芽上剪半张叶片进行GUS组织化学分析（图3F)。 GUS阳性的芽转移到新的芽伸长培养基中单独培养。
[0101] 4)生根
[0102] 当⑶S阳性的芽伸长至3-4cm时，用手术刀从基部切下，转入生根培养基（1/2Β5， 0. Smg·!/1!!引哚丁酸，3% (w/v)鹿糖，0. 8% (w/v)琼脂，pH5. 6)诱导生根。待有3-4条 健壮根长出后（图3G)，打开培养瓶瓶盖驯化2-3d，然后用镊子小心将幼苗取出，洗净根 部的培养基，移栽含有蛭石：草炭=1 :1的塑料盆中，开始3-4天用保鲜膜覆盖保湿，25°C 在光照培养箱中生长1周。1周后，逐渐将保鲜膜打开驯化，并移入温室中，在自然光下 生长，每隔2天浇一次1/4浓度的园试配方营养液，直至成熟收获（图3H)。所使用园 试配方营养液大量元素及含量分别为（mmol · Γ1) :Ca(N03)2 · 4H20(4.00)、KN03(8 . 00)、 ΝΗ4Η2Ρ04(1· 33)和MgS04 ·7Η20(2· 00);微量元素及其含量分别为（μ mol 七1) :H3B03(B140)、 CuS04 ·5Η20(αι100)、MnCl2 ·4Η20(Μη36)、ZnS04 ·7Η20(Ζη46)、Fe-EDTA(Fe30)和％]?〇02(]\1〇1)。
[0103] 3.转基因大豆植株的鉴定
[0104] 1)1；转基因大豆Basta抗性鉴定
[0105] 用棉棒蘸取0. 05% Basta均勻涂抹于健康的转基因大豆和未转化大豆半张叶片 表面，10天后观察叶片的症状，结果表明转基因植株具有抗Basta除草剂特性（图31)，而 非转基因植株叶片黄化（图3J)。
[0106] 2)转基因大豆⑶S组织化学分析
[0107] 取?；代转基因大豆和未转化大豆的叶片、茎段、花、豆荚，以及?\代种子分别置于 ⑶S 反应液[50mmol · I71 憐酸钠缓冲液（ρΗ7· 0)，1 % (v/v) Triton X100, 20% (v/v)甲醇， 50mmol · I71六氰合亚铁酸钾，50mmol · I71六氰合铁酸钾，lmmol · Ll-Gluc (Goldbio,货号： G1281C)]中，37°C反应12h。70%乙醇去除叶绿素后，拍照观察。结果如图4所示，gus基 因在I代转基因植株各器官中均有表达，并且在I\、T 2代种子以及T2代幼苗侧根中稳定地 表达，说明外源基因已经成功遗传到后代中。
[0108] 3)TQ代转基因大豆植株PCR鉴定
[0109] 取转基因大豆幼嫩叶片，以常规SDS法提取基因组DNA，然后以获得的基因组DNA 为模板进行PCR，分别检测gus、bar和StP5CS基因。结果显示转基因植株中含有清晰地gus 基因、bar基因和StP5CS基因目的条带，而未转化植株中没有扩增到相应的条带，说明外源 基因已经成功整合到大豆基因组中（图5A)。
[0110] 反应体系包含：10XPCR Buffer2. 0μ L，dNTP mixl. 6μ L(2. 5mmol · Γ1)， MgCl2l. 2 μ L(25mmol · I/1)，检测弓 | 物各 1. 0 μ L (20 μ mol · I/1)，Taq DNA Polymerase。· 2 μ L，cDNA 模板 1 μ L，ddH2012 μ L ;
[0111] gus基因 PCR扩增引物：
[0112] 正向引物gusF :如SEQ ID Ν0· 7所示
[0113] 反向引物gusR :如SEQ ID Ν0· 8所示
[0114] 反应程序：94°C 5min，（95°C 45sec，55°C 45sec，72°C lmin) X30 循环，72°C lOmin ;
[0115] bar基因 PCR扩增引物为：
[0116] 正向引物barF :如SEQ ID NO. 9所示
[0117] 反向引物barR :如SEQ ID Ν0· 10所示
[0118] 反应程序：94°C 5min，（95°C lmin，55°C lmin，72°C lmin) X30 循环，72°C lOmin ;
[0119] StP5CS基因 PCR扩增引物为：
[0120] 正向引物PF3 :如SEQ ID NO. 11所示
[0121] 反向引物PR3 :如SEQ ID NO. 12所示
[0122] 反应程序：94 °C 5min，（94 °C 30sec，50 °C 30sec，72 °C 45sec) X30 循环， 72。。 lOmin ;
[0123] 4) L代转基因大豆植株Southern杂交鉴定
[0124] 提取?；代转基因大豆植株的基因组DNA，纯化后用EcoRI进行酶切16h，0. 8% (w/ v)琼脂糖电泳分离，转膜用于杂交。杂交探针的制备采用地高辛随机引物标记法进行，选 用与大豆内源P5CS基因序列相似性较低的639bp StP5CS基因编码区片段用于探针标记。 探针的标记、杂交、显色使用罗氏公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (Roche, Germany)进行。Southern杂交结果确认StP5CS基因以低拷贝的形 式成功整合到大豆基因组中（图5B)。
[0125] 4.纯合体转基因大豆的筛选
[0126] 1)?\代转基因植株的鉴定
[0127] 将?；代转基因植株自交收获的种子置于去离子水中浸泡吸涨4_5h，种子完全膨胀 后转移至含有湿润滤纸的培养皿中，在25°C条件下催芽。待种子萌发后，分别播种于含有蛭 石和草炭（1:1，v/v)的塑料盆中[23(上直径）X13(下直径）X20cm(高）]，每盆播一粒 种子。真叶展开后每2天浇1/4浓度的园试配方营养液。当第一片三出复叶完全展开后， 剪取叶片进行⑶S组织化学分析和PCR鉴定。结果表明，外源基因在?\代中以3:1的比例 分离，符合孟德尔遗传定律。
[0128] 2) Τ2代纯合体转基因株系的筛选
[0129] 为筛选纯合的转基因株系，将GUS和PCR检测阳性的转基因 ?\代植株分别进行自 交，收获Τ2种子。收获的种子按照上述方法催芽并播种于温室。当第一片复叶完全展开后， 取叶片进行⑶S组织化学分析和PCR鉴定。经鉴定有两个株系，命名为Ζ1-3和Ζ2-7的后 代植株均显示⑶S阳性和StP5CS基因 PCR阳性，说明这两个株系为纯合体转基因株系。
[0130] 四、T2代和T3代纯合体转基因大豆耐盐性鉴定
[0131] 1. Τ2代纯合体转基因大豆盆栽法耐盐性鉴定
[0132] 采用盆栽法对筛选得到的Τ2代纯合转基因株系（Ζ1-3和Ζ2-7)进行耐盐性鉴定， 并以野生型大豆植株作为对照。试验在南京农业大学温室进行，采用完全随机设计，植株在 温室中随机排列。温室环境采用人工控制，昼夜温度：25/20°C，相对湿度：70 - 80%，光周 期：16/8h (光照/黑暗），光照强度：600 μ mol. πΓ2· s-1 (PPFD)，C02浓度：400ppm。植株栽培 于含有蛭石和草炭（1:1，v/v)的塑料盆中[23(上直径）X 13(下直径）X20cm(高）]，每2 天浇1/4浓度的园试配方营养液。当第五片三出复叶完全展开后，从每个株系随机选取生 长一致的6株植株进行200mM NaCl盐胁迫处理。为了防止盐激反应，NaCl处理的浓度从 50mM开始以50mM的梯度缓慢提高：前3天的处理浓度分别为50, 100, 150mM ;从第4天开始 在200mM NaCl浓度条件下连续处理10天。200mM NaCl盐处理10天后，进行盐害级别的统 计，测定株高、叶面积、相对叶绿素含量生长指标，然后常规管理直至植株结荚。
[0133] 盐害级别统计时，将大豆的盐害症状分为1到5五个级别，其中1 =无明显的黄化 失绿症状；2 =轻度黄化（25%的叶片黄化失绿）；3 =中度黄化（50%的叶片有黄化症状， 其中一部分叶片干枯）；4=严重黄化（75%以上的叶片黄化，并且叶片干枯死亡）；5=植 株死亡（叶片严重的干枯，萎蔫）。各株系平均盐害级别=Σ (该级别植株数X单株盐害 级别）/各株系植株总数。叶面积的测量使用自动叶面积测量仪（YMJ-C，浙江托普仪器有限 公司）进行。相对叶绿素含量使用SPAD_502Plus叶绿素仪（Minolta Camera Co.，Japan) 测定，以SPAD值表示，每株测量9次，取平均值代表该株的相对叶绿素含量。
[0134] 正常栽培条件下，转基因植株与对照植株没有明显地表型差异。然而，如表1所 示，盐胁迫条件下，转基因植株的耐盐性显著高于对照植株，纯合转基因株系Z1-3和Z2-7 的盐害级别分别为1. 67和1. 83,而非转基因株系的盐害级别为4. 17。盐胁迫处理10天后， 转基因植株生长表现良好，上部叶片生长正常仍然保持绿色，而对照植株叶片黄化萎蔫，植 株底部叶片出现焦枯症状（图6A)，生长指标测定结果显示转基因植株的株高、最大单叶叶 面积、叶绿素含量显著高于非转基因植株。此外，在鼓粒期，转基因植株的有效荚数显著多 于对照植株。
[0135] 2. T3代纯合体转基因大豆水培法耐盐性鉴定
[0136] Τ3代纯合体转基因株系由Τ2代纯合体转基因植株自交获得，采用水培法对筛选 得到的Τ 3代纯合转基因株系进行耐盐性鉴定，试验在南京农业大学温室进行，采用完全随 机设计，每个株系处理8株植株（8次重复），植株在温室中随机排列。温室环境采用人工 控制，昼夜温度：25/201：，相对湿度 ：70 - 80%，光周期：16/811(光照/黑暗），光照强度： 600 μ mol. m_2_ iT1 (PPFD)，C02浓度：400ppm。试验在水培条件下进行，营养液采用1/2浓度的 园试配方营养液。为保证处理条件的一致性，将T 3代Z1-3和Z2-7纯合转基因株系和野生 型对照大豆植株，每株系各一株栽培于同一个含有14L园试配方营养液（EC = 2. 40dS ?πΓ1) 的塑料桶中，植株用海绵固定于泡沫板上（图6Β)，对营养液进行通气供氧，每隔3天更换 一次营养液。当植株第五片三出复叶完全展开后，在营养液中添加 l〇〇mM NaCl胁迫处理， 为防止盐激，最初2天的处理浓度为50mM，从第3天开始NaCl浓度提高至100mM并维持10 天。盐处理期间，每隔2天更换一次营养液，EC值保持在11. 0-11. 5ds.Hr1之间，pH保持 在6. 0-6. 5之间。100mM NaCl处理10天后，进行盐害级别的统计，测定株高、叶面积、相对 叶绿素含量生长指标，然后常规管理直至植株结荚。生长指标统计方法同盆栽试验。
[0137] 如表2所示，盐胁迫条件下，转基因植株的耐盐性显著高于对照植株，纯合转基因 株系Z1-3和Z2-7的盐害级别分别为1. 75和1. 50,而非转基因株系的盐害级别为4. 13。盐 胁迫处理10天后，转基因植株生长表现良好，大部分叶片仍然保持绿色，而对照植株叶片 严重黄化萎蔫（图6B)，生长指标测定结果显示转基因植株的株高、最大单叶叶面积、叶绿 素含量显著高于非转基因植株。此外，在鼓粒期，T 3代转基因植株的有效荚数显著多于对照 植株。这些结果说明，转基因植株的耐盐特性顺利的遗传到了后代中。
[0138] 3. StP5CS基因在Τ3代纯合体中的表达分析
[0139] 采用荧光定量的方法检测1~3代纯合体转基因株系中StP5CS基因的表达；如图7所 示，在正常栽培和盐胁迫处理两种条件下，StP5CS基因在两个纯合体株系中均成功表达，且 盐处理后StP5CS基因的表达量提高；而对照植株没有检测到StP5CS基因的表达，具体定量 方法如下：
[0140] 提取T3代纯合体株系和对照植株的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA。根据 StP5CS基因序列设计一对的特异引物扩增128bp编码区：
[0141] 正向引物PF4:如SEQ ID N0. 13所示，
[0142] 反向引物PR4:如SEQ ID NO. 14所示；
[0143] 以大豆真核延伸因子基因 ELFlb作为内参基因，扩增引物为：
[0144] 正向引物 ELFlbF:如 SEQ ID N0. 15 所示，
[0145] 反向引物 ELFlbR:如 SEQ ID NO. 16 所示。
[0146] 荧光定量PCR在安捷伦Mx3005P荧光定量PCR仪上进行，将反转录的cDNA样品稀 释10倍作为荧光定量PCR扩增的模板，反应体系参照TaKaRaSYBFT Premix Ex Taq?说明 书。荧光定量PCR反应体系（25yL)包含：SYBir Premix Ex Taq?(2X)12. 5yL;正向和 反向引物各 〇· 5 μ L (20 μ mol · Γ1)，cDNA50ng，dd Η209· 5 μ L ;荧光定量 PCR 反应程序：95°C 预变性30s后，95 °C变性5s，60°C退火20s，40个循环，在每个循环结束后采集荧光信号进行 实时检测。以大豆真核延伸因子基因 ELFlb作为内参基因，StP5CS基因的相对表达量通过 公式 2_Δσ 来计算。Λ CT = CTstRTO-CTRI.F J，其中 CTstPsre :为 StP5CS 基因的 CT 值，CTRI.F1h :为 大豆真核伸长因子基因的CT值。
[0147] 表1盆栽试验200mM NaCl处理对T2代纯合体转基因大豆的耐盐性及生长的影 响
[0148]
【权利要求】
1. 一种野生茄子Λ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS，其特征在于：该基因序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
2. -种重组载体，其特征在于：该重组载体包含权利要求1所述的Λ1-吡咯啉-5-羧 酸合成酶基因 StP5CS。
3. 权利要求2所述的重组载体，其特征在于：该重组载体为植物表达载体 pCAMBIA3301-StP5CS，含有StP5CS基因和抗除草剂bar基因，将StP5CS基因的5'端和3' 端分别引入CaMV35S启动子和nos终止子，并克隆到基础载体pCAMBIA3301的T-DNA区得 到的。
4. 包含权利要求2或3所述重组载体的转化细胞。
5. -种StP5CS耐盐转基因大豆的培育方法，其特征在于：将野生茄子StP5CS基因构 建至PCAMBIA3301表达载体中，通过该表达载体将外源StP5CS基因导入大豆基因组中获得 耐盐转基因大豆。
6. 权利要求5所述的StP5CS耐盐转基因大豆的培育方法，其特征在于：包括如下步 骤： 1. StP5CS耐盐转基因大豆转化体的获得 将权利要求3所述的植物表达载体pCAMBIA3301-StP5CS导入大豆基因组，通过除草剂 筛选获得?；代转基因大豆植株； 2) 纯合体转基因大豆的筛选 利用⑶S组织化学分析法和PCR鉴定法检测?\代转基因大豆，获得阳性植株，进行自 交获得Τ2代种子；选取Τ2代种子萌发后的第一片完全展开叶，利用GUS组织化学分析法和 PCR鉴定法，选择均为阳性的株系，即为纯合体转基因株系。
7. 权利要求1所述基因或权利要求2或3所述重组载体在耐盐转基因植物中的应用， 优选地，为耐盐转基因大豆中的应用。
8. 权利要求4所述转化细胞在耐盐转基因植物中的应用，优选地，为耐盐转基因大豆 中的应用。
9. 一种耐盐转基因大豆StP5CS基因相对表达量的测定方法，其特征在于：设计特异性 引物，通过荧光定量PCR测定StP5CS基因在耐盐转基因大豆中的表达量； 其中，特异性引物： 上游引物PF4 :如SEQ ID No. 13所示， 下游引物PR4 :如SEQ ID No. 14所示。
10. -种耐盐转基因大豆StP5CS基因相对表达量测定的试剂盒，其特征在于：该试剂 盒包括如下序列： StP5CS基因检测引物，上游引物PF4:如SEQ ID No. 13所示，下游引物PR4:如SEQ ID No. 14所示； 大豆内参基因 ELFlb的检测引物，上游引物ELFlbF :如SEQ ID No. 15所示；下游引物 ELFlbR :如 SEQ ID No. 16 所示。
【文档编号】A01H5/00GK104099355SQ201410332153
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月11日 优先权日:2014年7月11日
【发明者】朱月林, 盖钧镒, 张功臣 申请人:南京农业大学