一种含三株菌的复合芽孢杆菌制剂及其制备方法和在生态养殖中的应用的制作方法

一种含三株菌的复合芽孢杆菌制剂及其制备方法和在生态养殖中的应用的制作方法
【专利摘要】一种含三株菌的复合芽孢杆菌制剂及其制备方法和在生态养殖中的应用，属于微生物和饲料添加剂【技术领域】。本发明分别用凝结芽孢杆菌、酪酸梭状芽孢杆菌及巨大芽孢杆菌作发酵菌种，逐级放大进行芽孢的大规模低成本高密度发酵生产；含芽孢的菌泥与干淀粉混合制备三种活菌制剂；把三种活菌制剂按重量等比配伍，得复合芽孢杆菌制剂，芽孢浓度达1×108-109cfu/g以上；作为微生物饲料添加剂按0.02％-0.5％的质量比添加至养殖动物饲料中。本发明工艺简单稳定、成本低廉，芽孢含量高、环境耐受性强、易贮藏、存活率高；不同芽孢杆菌在调节微生态方面的协同互补作用达到复配增效的目的，促进养殖动物生长，提高饲料利用率和饲料报酬，预防和降低腹泻，改善养殖生态环境。CGMCC No.804520130819CGMCC No.164720060310CGMCC No.260220080728
【专利说明】一种含三株菌的复合芽孢杆菌制剂及其制备方法和在生态 养殖中的应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高活菌含量、高芽孢含量、高保存期的复合芽孢杆菌制剂，及其生 产制备方法和作为微生物饲料添加剂在动物生态养殖中的应用，属于微生物和饲料添加剂

【技术领域】。

【背景技术】
[0002] 近年来，随着高密度集约化人工养殖技术的推广应用，我国的养殖生产规模获得 了迅猛发展，已成为世界畜、禽、水产品的生产和贸易大国。但是，高密度集约化养殖方式使 动物疾病呈高发态势，人们不得不大量广泛地使用抗生素等药物，造成抗药性和耐药性菌 株增加，破坏动物肠道正常微生态平衡，降低动物免疫功能，使机体抗病能力下降，更易受 到外源性和内源性感染的侵害。此外，抗生素等药物会在动物产品中残留，带来二次污染直 接危害人类的免疫和健康。因此，世界各国特别是发达国家纷纷采取官方强硬措施，对饲用 药物的种类、使用方法、剂量和配伍等进行了严格限制。
[0003] 建立在微生态调控理论基础上的各种微生物添加剂具有安全、高效的特点，近年 来发展迅速，正逐渐成为抗生素等药物的替代品被广泛应用于动物养殖中，取得了较为可 观的生态效益、社会效益和经济效益，有力地促进了绿色生态健康养殖新模式的发展。
[0004] 2009年，我国农业部公告第1231号正式批准丁酸梭菌(又称酪酸梭状芽孢杆菌） 和地衣芽孢杆菌为新饲料添加剂，商品名分别为酪肠生和地肠生。在我国农业部公告第 2045号发布的《饲料添加剂品种目录（2013)》中，正式将凝结芽孢杆菌列为饲料微生物添 加剂品种。巨大芽孢杆菌目前虽还未被我国农业部正式批准，但已有许多关于该菌种用于 动物养殖的研宄报道。迄今为止，我国正式批准的饲用微生物品种已达34种，包括了乳酸 菌类、芽孢杆菌类、霉菌类和酵母类等。
[0005] 凝结芽孢杆菌属于肠道乳酸菌，又称为"有孢子性乳酸菌"，是一种"普遍认为安 全"的杆菌类乳酸菌。凝结芽孢杆菌的功能特点是：①有效抑制有害菌的生长，改良肠道微 生态环境，促进肠道发育，增强肠道功能；②提高饲料品质，促进饲料的消化吸收，降低饲料 系数；③有效改善由于应激和过敏反应引起的菌群失调性腹泻；④无任何毒副作用，使用 安全；⑤可降低环境中的氨气、硫化氢等有害气体，改善养殖环境。
[0006] 酪酸梭状芽孢杆菌(又称酪酸菌、丁酸梭菌或酪酸梭菌）为革兰氏阳性厌氧杆菌， 是调节肠道微生态平衡的有益菌，其主要生物特性表现为：①促进肠道有益菌群(双歧杆 菌、乳酸杆菌）的增殖，抑制肠道内有害菌和腐败菌的生长，纠正肠道菌群紊乱，减少肠毒素 的发生；②在肠道内产生B族维生素和维生素 K等物质，对机体具有保健作用；③主要代谢 产物丁酸是肠道上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质，提高饲料消化吸收率。
[0007] 巨大芽孢杆菌为产芽孢的革兰氏阳性好氧菌，农业上用于制造磷细菌肥料，工业 上用于生产葡萄糖异构酶，环保上用于制作水体处理剂。作为微生态制剂，巨大芽孢杆菌 的特点和作用机理是：①生物夺氧能力强，进入动物肠道后首先繁殖，迅速消耗肠道内的氧 气，为肠道内有益厌氧菌的生长提供良好的厌氧环境，通过支持有益厌氧菌的生长，间接抑 制好氧致病菌的增殖，恢复肠道功能；②具有丰富的胞外酶系，在肠道内繁殖过程中能产生 淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶等多种消化酶，尤其是纤维素酶活力较强，可有效地促进 饲料组分的消化吸收，提高饲料利用率，降低饲料系数；③能有效降低养殖过程中氨气和硫 化氢等臭味气体的产生，起到改善养殖生态环境的作用。
[0008] 最新研宄表明，不同的菌种在动物体内的作用机制不同；动物体内的生物环境在 不断变化，不同的作用机制所适应的最佳环境也不同。多菌种产品能在变化的生物环境中 充分利用不同菌种之间的协同机制和竞争抑制效应，达到比单菌种产品更好的效果。因此 由两种或两种以上不同菌种组成的复合制剂成为当前微生态产品的开发热点。
[0009] 目前国内已有多个关于复合微生物制剂用作饲料添加剂的专利，其中专门由芽孢 杆菌复配而成、与本发明相近的专利如下：中国专利CN102389032公开了一种由乳酸芽孢 杆菌和枯草芽孢杆菌组成的替代抗生素的饲料添加剂；CN101816378公开了一种由乳酸芽 孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组成的养殖饲料添加剂；CN1089442公开了由地衣 芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌组成的 微生物添加剂用于肉鸭的饲养；CN103461650公开了由枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌组成 的饲料添加剂用于饲喂生长育肥猪；CN102429096公开了一种由地衣芽孢杆菌、枯草芽孢 杆菌和酪酸菌组成的饲料添加剂用于饲喂乳仔猪；CN103349153公开了一种由凝结芽孢杆 菌、丁酸梭菌和地衣芽孢杆菌中的任意两种或三种复配而成的菌体复合物，用于动物肠道 的保护和修复。
[0010] 根据以上国内已公开的专利文献，到目前为止，关于复合芽孢杆菌制剂的专利仍 偏少，使用的微生物品种单一，主要集中于乳酸芽孢杆菌(又称凝结芽孢杆菌)、酪酸梭状芽 孢杆菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等少数几种微生物。尤其是关于巨大 芽孢杆菌复配制剂的专利仅有1项，而且仅用于肉鸭的饲养。众所周知，乳酸菌、酵母菌和 霉菌类等微生物因不能形成芽孢，造成制剂产品稳定性差、不耐储藏、不耐胃酸，在动物胃 肠道内易失活而降低其益生功效；而芽孢杆菌能产生内生孢子，环境抗逆性强，能耐酸、碱 和高温、高压，在饲料加工和储存过程中不易失活，在动物肠道内容易定植，保持较高的活 菌数而充分发挥其生理功效。因此目前市场上更倾向于使用芽孢杆菌及其复合制剂产品。


【发明内容】

[0011] 本发明的主要目的是针对当前国内养殖业大量使用抗生素的弊端以及现有技术 和产品的不足，提供一种更高效地促进动物生长、预防动物消化道疾病、提高饲料消化率、 改善养殖生态环境的新型复合芽孢杆菌制剂产品。
[0012] 本发明的进一步目的是提供一种含三株菌的新型复合芽孢杆菌制剂及其制备方 法，该方法具有简化生产工艺、高密度活菌总数、高芽孢含量和低生产成本的优点。
[0013] 本发明的更进一步目的是提供一种含三株菌的复合芽孢杆菌制剂在动物生态养 殖中的应用方法，包括添加方式、添加剂量、饲喂周期、养殖技术模式和养殖管理操作规程 等。
[0014] 为达到本发明目的，本发明采用的技术方案是： 一种含三株菌的复合芽孢杆菌制剂，由产L-乳酸的凝结芽孢杆菌活菌制剂、产丁酸的 酪酸梭状芽孢杆菌活菌制剂和好氧的巨大芽孢杆菌活菌制剂配伍组成。其中凝结芽孢杆菌 选择保藏编号为CGMCC No. 2602的菌株、酪酸梭状芽孢杆菌选择保藏编号为CGMCC No. 1647 的菌株、巨大芽孢杆菌选择保藏编号为CGMCC No. 8045的菌株。各菌株采用单独发酵方式， 分别经摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐培养、离心收集菌泥，与干淀粉混合、低温干燥、粉碎、 过筛，再与辅料混合均匀，得到三种活菌制剂。最后以1 : 1 : 1的重量比例混合均匀而制 备得到含三株菌的复合芽孢杆菌制剂产品，芽孢含量达lX 108-109cfu/g以上。
[0015] 所述含三株菌的复合芽孢杆菌制剂的制备方法，其制备步骤如下： (1)凝结芽孢杆菌活菌制剂的制备 ①菌体活化 无菌开启凝结芽孢杆菌菌株（AaciBw1S CGMCC No. 2602的冻干保藏菌 种，划线接种于麸皮营养琼脂试管斜面，斜面培养基组成以g/L计为：蛋白胨10、牛肉膏3、 NaCL5、麸皮10、琼脂15-20,用自来水配制，pH7. 0-7. 2 ;30-36°C培养24-48h ;然后划线转接 于麸皮营养琼脂茄子瓶斜面，30-36°C培养24-48h，镜检，当90%以上菌体形成芽孢时，即 为成熟，准备移种。
[0016] ②摇瓶及种子罐培养 准备一个内装玻璃珠的无菌三角瓶，用无菌水将茄子瓶斜面上的成熟菌泥刮洗下来， 装入三角瓶，振荡分散菌泥，获得均匀的菌悬液。将菌悬液在80°C水浴中加热10 min，以体 积比1 % -10%的接种量接入250mL三角瓶，装液量为15mL ;或接入500mL三角瓶，装液量 为30mL ;摇瓶培养。
[0017] 将摇瓶液体培养液在80°C水浴中加热10 min，以体积比1%-10%的接种量 转接入种子罐培养，种子罐体积选用l〇L、20L、50L或100L，种子罐装量系数体积比为 60% -70%。镜检，当90 %以上菌体形成芽孢时，即为成熟，准备移种。
[0018] 培养基组成以g/L计：麸皮5-20、酵母膏5-10、豆柏粉5-10、K2HPO 4 3、NaCl 5、 MnSO4 · H2O 0· 3，用自来水配制，ρΗ7· 0。
[0019] 培养条件为：摇瓶转速200r/min、种子罐搅拌转速彡150r/min、通气量l-2m3/h、 培养温度为30-60°C、培养时间为18-48h。
[0020] ③发酵罐培养 种子培养液以体积比1% _1〇%的接种量接入发酵罐，发酵罐选用I T、2T、或3T体积的 发酵罐，发酵罐装量系数体积比为60 % -70 %。
[0021] 发酵培养基由碳源、氮源和无机盐组成，以g/L计：碳源5-20、氮源5-20、K2HPO 4 3、NaCl 5、MnSO4 · H2O 0. 3、碳酸钙2-10,用自来水配制，pH6. 0-8. 0。碳源选用麸皮、葡萄 糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖、阿拉伯糖、玉米糖、大米糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、 小麦淀粉、红薯淀粉或马铃薯淀粉的一种或几种；氮源选用蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米浆 粉、豆柏粉、大豆肽、棉籽蛋白、黄豆饼粉或花生饼粉中的一种或几种。
[0022] 发酵罐培养条件为：搅拌转速彡150r/min、通气量l-2m3/h、培养温度为30-60°C、 培养时间为18_48h。在培养过程中根据泡沫的高涨情况加豆油或泡敌进行消泡，防止因泡 沫逃逸出发酵罐而引起杂菌污染。取发酵液进行镜检，当90%以上的菌体已形成芽孢时，即 可放罐结束培养，取样测总活菌数和芽孢数。
[0023] 活菌及芽孢检测用番茄汁琼脂计数培养基，以g/L计：酵母膏10、蛋白胨10、 番茄汁200mL、CaCO3 5、琼脂15-20,蒸馏水800mL，pH7. 0-7. 2 ;测得发酵液芽孢数量达 lX109cfu/mL 以上。
[0024] ④芽孢收集及菌粉制备 将培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，获得芽孢，将芽孢与干淀 粉以重量比1 : 1-5混合，在40-50°C干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，加入辅料石粉、 麸皮或玉米芯粉中的一种或几种，辅料加入量为总重量的60%-80%，混合后制成微生态凝结 芽孢杆菌活菌制剂，芽孢含量达lX10 9cfu/g以上。
[0025] (2)酪酸梭状芽孢杆菌活菌制剂的制备 ①菌体活化 无菌开启酪酸梭状芽孢杆菌菌株Zwijric腫）CGMCC No. 1647的冻干 保藏菌种，接入装有活化培养基的试管中，进行静置厌氧培养，30-37?培养18-24h。然后 以体积比1% -10%的接种量转接于装有新鲜活化培养基的试管中，30-37?静置厌氧培养 20-24h，镜检，超过90 %菌体形成芽孢时，即成熟。反复活化2-3次。
[0026] 活化培养基由下述原料及重量配比组成，以g/L计：酵母膏3-5、牛肉膏5-20、蛋白 胨5-20、葡萄糖5-10、可溶性淀粉1-2、NaCl 5、乙酸钠3-5、盐酸半胱氨酸0. 5-1、CaCO3 3， 用自来水配制，pH 6. 0-7. 5。
[0027] ②摇瓶及种子罐培养 将活化后的菌悬液在80°C水浴中加热lOmin，以体积比1%-10%的接种量转接入装有种 子培养基的250mL三角瓶中，装液量为体积比的80 % -90 %，30-37 °C 恒温培养箱中静置厌氧培养20-24h。
[0028] 将摇瓶液体培养液在80°C水浴中加热lOmin，以体积比1%-10%的接种量转接入 种子罐培养，种子罐体积选用l〇L、20L或50L，种子罐的装量系数体积比为60 % -70%， 30-37°C恒温静置厌氧培养20-48h。镜检，当90%以上菌体形成芽孢时，即为成熟，准备移 种。
[0029] 种子培养基组成以g/L计：酵母膏3、牛肉膏10、胰蛋白胨10、葡萄糖5、可溶性淀 粉UNaCl 5、乙酸钠3、盐酸半胱氨酸0. 5,用自来水配制，pH7. 0。
[0030] ③发酵罐培养 种子培养液以体积比1% -10%的接种量接入发酵罐，发酵罐选用l〇〇L、200L或500L 体积的发酵罐，发酵罐装量系数体积比为60% -70%，30-37°C恒温静置厌氧培养20-48h。 取发酵液进行镜检，当90%以上的菌体已形成芽孢时，即可放罐结束培养，取样测总活菌数 和芽孢数。
[0031] 发酵培养基组成以g/L计：葡萄糖10、牛肉蛋白胨10、酵母膏5、NaCl 5、乙酸钠3、 K2HPO4 2、MgSO4 · 7H20 0· 5、CaCO3 1，用自来水配制，pH 7. 0〇
[0032] 总活菌数的测定采用MPN法。将菌液于80°C下水浴热处理IOmin后，采用MPN法 测定的活菌数即为芽孢数。计数培养基采用国药集团化学试剂有限公司生产的生化试剂级 硫乙醇酸盐液体培养基。测得发酵液芽孢数量达lX10 8cfu/mL以上。
[0033] ④芽孢收集及菌粉制备 将培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，获得芽孢，将 芽孢与干淀粉以重量比1 : 1-5混合，在40-50°C干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目 筛，加入辅料石粉、麸皮或玉米芯粉中的一种或几种，辅料加入量为总重量的60%-80%，混合 后制成微生态酪酸梭状芽孢杆菌活菌制剂，芽孢含量达IX 108cfu/g以上。
[0034] (3)巨大芽孢杆菌活菌制剂的制备 ①菌体活化 无菌开启巨大芽孢杆菌菌株W(^aieriaw)CGMCC No. 8045的冻干保藏菌种， 划线接种于LB琼脂试管斜面上，28-37?培养36-48h。然后划线转接于LB琼脂茄子瓶斜面 上，28-37 °C培养36-48h，镜检，当90%以上菌体形成芽孢时，即为成熟。
[0035] ②摇瓶及种子罐培养 用无菌水将茄子瓶斜面上的成熟菌泥刮洗下来，放入内装无菌玻璃珠的灭菌三角 瓶中，振荡分散菌泥，制成均匀的菌悬液。将菌悬液在80°C水浴中加热lOmin，以体积比 1% -10 %的接种量接入装有种子培养基的250mL或500mL三角瓶中，装液量为体积比的 10%，摇瓶培养。
[0036] 将摇瓶液体培养液在80°C水浴中加热10 min，以体积比1% -10%的接种量 转接入种子罐培养，种子罐体积选用l〇L、20L、50L或100L，种子罐的装量系数体积比为 60% -70%。镜检，当90 %以上菌体形成芽孢时，即为成熟，准备移种。
[0037] 种子培养基组成以g/L计：玉米淀粉10、蛋白胨5、酵母膏5、NaCl 5、CaCO3 1、 MgSO4 · 7H20 0· 5，用自来水配制，pH7. 0。
[0038] 培养条件为：摇瓶转速200r/min、种子罐搅拌转速多200r/min、通气量l-2m3/h、 溶氧控制在30%以上，培养温度为28-37°C、培养时间为36-48h。
[0039] ③发酵罐培养 将成熟的种子培养液经80°C水浴IOmin后，以体积比1% -10%的接种量接入发酵罐， 确保接种后起始芽孢浓度多106cfu/mL，发酵罐选用I T、2T或3T体积的发酵罐，发酵罐装 量系数体积比为70 % -80 %。
[0040] 发酵培养基组成以g/L计：玉米淀粉10、蛋白胨5、酵母膏5、NaCl 5、CaCO3 1、 MgSO4 · 7H20 0· 5，用自来水配制，pH7. 0。
[0041] 发酵罐培养条件为：搅拌转速彡20〇1'/11^11、通气量1-2111 3/11、溶氧控制在30%以 上、培养温度为28-37°C、培养时间为36-48h。在培养过程中根据泡沫的高涨情况加豆油或 泡敌进行消泡，防止因泡沫逃逸出发酵罐而引起杂菌污染。取发酵液进行镜检，当90%以上 的菌体已形成芽孢时，即可放罐结束培养，取样测总活菌数和芽孢数。
[0042] 总活菌数的测定采用系列稀释法。将菌液于80°C下水浴热处理IOmin后，采用系 列稀释法测定的活菌数即为芽孢数。测得发酵液芽孢数量达IX 109cfu/mL以上。
[0043] ④芽孢收集及菌粉制备 将培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，获得芽孢，将芽孢与干淀 粉以重量比1 : 1-5混合，在40-50°C干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，加入辅料石粉、 麸皮或玉米芯粉中的一种或几种，辅料加入量为总重量的60%-80%，混合后制成微生态巨大 芽孢杆菌活菌制剂，芽孢含量达lX10 9cfu/g以上。
[0044] (4)复合芽孢杆菌制剂的制备 将步骤（1)制得的凝结芽孢杆菌活菌制剂、步骤（2)制得的酪酸梭状芽孢杆菌活菌制 剂与步骤（3)制得的巨大芽孢杆菌活菌制剂以I : I : 1的重量比例混合均匀，即得到产 品含三株菌的复合芽孢杆菌制剂，芽孢含量达IXlO8-IO9CfVg以上。
[0045] 3.成品指标 产品芽孢数：凝结芽孢杆菌多IX IO9CfVg ;酪酸梭状芽孢杆菌多IX IO8CfVg ;巨大芽 孢杆菌彡IX 109cfu/g。感观指标：产品为灰白色粉齐I」，色泽均一。粒度：制剂能通过40目 筛；水分：含水量< 8%。
[0046] 4.复合芽孢杆菌制剂在动物养殖中的用法如下： (1)用于牲畜饲料，添加量为饲料干重的0. 02% -0. 5%。用于禽类饲料，添加量为饲料 干重的0. 02% -0. 2%。用于水产饲料，添加量为饲料干重的0. 02% -0. 2%。
[0047] (2)所述牲畜包括猪、牛、羊、兔等大型食草类和非食草类动物。所述禽类包括鸡、 鸭、鹅等动物。水产类包括甲鱼、虾、蟹等甲壳类水生动物和其它各种淡水鱼、海水鱼等。
[0048] 本发明的有益效果： 1.本发明采用的凝结芽孢杆菌为兼性厌氧的芽孢杆菌，酪酸梭状芽孢杆菌为严格厌氧 的芽孢杆菌。一方面凝结芽孢杆菌在动物肠道内能产生大量L-乳酸、抗菌凝固素、氨基酸、 维生素和多种消化酶，改良肠道微生态平衡，促进肠道发育和增强肠道功能，促进饲料消化 吸收；另一方面酪酸梭状芽孢杆菌能产生对机体具有保健作用的丁酸、B族维生素和维生 素 K等物质，促进肠道上皮组织细胞再生和修复，减少肠毒素发生，提高饲料利用率。此外， 凝结芽孢杆菌产生的L-乳酸具有较强的酸性，强酸性环境使得酪酸梭状芽孢杆菌产生的 丁酸不易离解，只有未离解的分子态丁酸才能更好地给肠上皮细胞组织提供能量，促进受 损细胞的修复。因此，这两种菌同时进入动物体内后，能分别通过不同的途径和机制来调节 微生态平衡，两者相互协同补充，对提高益生效果产生合力作用。
[0049] 2.本发明同时采用了两种产酸的芽孢杆菌，即凝结芽孢杆菌产生的L-乳酸和酪 酸梭状芽孢杆菌产生的丁酸能使动物肠道PH值更低，以及它们之间在其它生理功效方面 的互补和累加效应，从而能更有效地抑制大肠杆菌等病原菌的生长，降低腹泻率和促进有 益菌的增殖。
[0050] 3.本发明的复合芽孢杆菌制剂还包含了巨大芽孢杆菌。该菌为严格好氧的芽孢杆 菌，进入动物体内后首先繁殖，发挥其较强的生物夺氧能力，迅速消耗肠道内残留的氧气， 为凝结芽孢杆菌与酪酸梭状芽孢杆菌提供了良好的微生态环境，促进它们的定植和生长。 此外，巨大芽孢杆菌能有效降低养殖过程中粪便氨气和硫化氢的排放，起到除臭和改善养 殖生态环境的作用。
[0051 ] 4.本发明的复合芽孢杆菌制剂同时采用了三种芽孢杆菌，它们在肠道生长繁殖过 程中能产生多种酶、有机酸、维生素和大量生物活性物质。尤其是巨大芽孢杆菌具有丰富的 酶系，能产生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶等。三种菌在动物肠道内相互协同，互为补 充，共同构成了一个高效的、完善的酶系统，从而起到防病治病、促进消化和提高饲料利用 率的作用。
[0052] 5.本发明采用的三种芽孢杆菌活菌制剂的制备方法，为专门的高密度芽孢发酵生 产工艺。该工艺采用的培养基原材料价格低廉，培养条件粗放，操作简单，培养时间短(最长 不超过48小时)，节约能耗，生产成本低，总菌数和芽孢形成率均较高。
[0053] 6.本发明采用的均是产芽孢的微生物，制备的复合芽孢杆菌制剂芽孢含量达 I X 108-109cfu/g以上，因而环境耐受性强，在饲料加工过程中不易失活，产品稳定性高，保 质期长，在动物体内活性不受胃酸、消化酶、胆汁酸的影响，能充分发挥对动物的益生效果。
[0054] 生物材料样品保藏：一种凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07,保藏 编号为CGMCC No. 2602,保藏日期2008年7月28日；一种酪酸梭状芽孢杆菌（C/osirii/iw? JSM-MCB20040312,保藏编号为 CGMCC No. 1647,保藏日期 2006 年 3 月 10 日； 一种巨大芽孢杆菌ffiegateri腫)JSSW-ID-2F5,保藏编号为CGMCC No. 8045,保藏 日期2013年8月19日；三株菌均已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所。

【具体实施方式】
[0055] 以下结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明 作任何限定。
[0056] 实施例1 所述含三株菌的复合芽孢杆菌制剂的制备方法，制备步骤如下： (1)凝结芽孢杆菌活菌制剂的制备 ①菌体活化 无菌开启凝结芽孢杆菌菌株（AaciBw1S )CGMCC No. 2602的冻干保藏菌种， 划线接种于麸皮营养琼脂试管斜面，30°C培养24h ;然后划线转接于麸皮营养琼脂茄子瓶 斜面，30°C培养24h。镜检，当90%以上菌体形成芽孢时，即为成熟，准备移种。
[0057] 斜面培养基组成以g/L计为：蛋白胨10、牛肉膏3、NaCl 5、麸皮10、琼脂20,用自 来水配制，PH7. 0。
[0058] ②摇瓶种子培养 准备一个内装玻璃珠的无菌三角瓶，用无菌水将茄子瓶斜面上的成熟菌泥刮洗下来， 装入三角瓶，振荡分散菌泥，获得均匀的菌悬液。将菌悬液在80°C水浴中加热10 min，以 体积比10%的接种量接入25个500mL三角瓶，装液量为30mL，摇瓶培养。摇瓶转速200r/ min、培养温度为30°C、培养时间为18h。
[0059] ③种子罐培养 合并摇瓶种子培养液，在80°C水浴中加热10 min，以体积比1 %的接种量接入100L种 子罐，种子罐的装量系数体积比为70%。种子罐搅拌转速150r/min、通气量2m3/h、培养温 度为30°C、培养时间为18h。镜检，当90 %以上菌体形成芽孢时，即为成熟，准备移种。
[0060] 种子培养基组成以g/L计：麸皮5、酵母膏5、豆柏粉5、K2HP04 3、NaCl 5、MnS04，H20 〇. 3,用自来水配制，pH7. 0。
[0061] ④发酵罐培养 种子培养液以体积比3. 5 %的接种量接入发酵罐，发酵罐选用3T体积的发酵罐，发酵 罐装量系数体积比为65%。发酵罐搅拌转速150r/min、通气量2m3/h、培养温度为30°C、培 养时间为48h。在培养过程中根据泡沫的高涨情况加泡敌进行消泡，防止因泡沫逃逸出发 酵罐而引起杂菌污染。取发酵液进行镜检，当90%以上的菌体已形成芽孢时，即可放罐结 束培养。取样测定总活菌数达6. 0 X 109cfu/mL，芽孢数量达5. 8 X 109cfu/mL，芽孢形成率为 96. 7%〇
[0062] 发酵培养基组成以g/L计：玉米淀粉5、玉米浆粉5、K2HPO4 3、NaCl 5、MnSO4 · H2O 0. 3、碳酸钙2,用自来水配制，pH7. 0。
[0063] 活菌及芽孢检测用番茄汁琼脂计数培养基，以g/L计：酵母膏10、蛋白胨10、番茄 汁 200mL、CaCO3 5、琼脂 15,蒸馏水 800mL，ρΗ7· 0。
[0064] ⑤芽孢收集及菌粉制备 将培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，获得芽孢，将芽孢与干淀 粉以重量比1 : 2混合，在50°C干燥20h，粉碎机粉碎，过40目筛，加入重量百分比70%的 玉米芯粉辅料，混合均匀，使芽孢含量达IX l〇9cfu/g以上，即得到凝结芽孢杆菌活菌制剂。
[0065] (2)酪酸梭状芽孢杆菌活菌制剂的制备 ①菌体活化 无菌开启酪酸梭状芽孢杆菌菌株Zwijric腫）CGMCC No. 1647的冻干 保藏菌种，接入装有活化培养基的试管中，进行静置厌氧培养，30°C培养18h。然后以体积 比10 %的接种量转接于装有新鲜活化培养基的试管中，30°C静置厌氧培养20h，镜检，超过 90%菌体形成芽孢时，即成熟。如此反复活化3次。
[0066] 活化培养基组成以g/L计：酵母膏3、牛肉膏5、蛋白胨5、葡萄糖5、可溶性淀粉1、 NaCl 5、乙酸钠3、盐酸半胱氨酸0.5、CaCO3 3,用自来水配制，pH 7.0。
[0067] ②摇瓶种子培养 将活化后的菌悬液在80°C水浴中加热10 min，以体积比10%的接种量接入装有种子 培养基的15个250mL三角瓶中，装液量为体积比的80%，30°C恒温培养箱中静置厌氧培养 20h〇
[0068] ③种子罐培养 合并摇瓶种子培养液，在80°C水浴中加热10 min，以体积比10%的接种量接入种子罐 培养，种子罐体积选用50L，种子罐的装量系数体积比为60%，30°C恒温静置厌氧培养20h。 镜检，当90%以上菌体形成芽孢时，即为成熟，准备移种。
[0069] 种子培养基组成以g/L计：酵母膏3、牛肉膏10、胰蛋白胨10、葡萄糖5、可溶性淀 粉UNaCl 5、乙酸钠3、盐酸半胱氨酸0. 5,用自来水配制，pH7. 0。
[0070] ④发酵罐培养 种子培养液以体积比10%的接种量接入发酵罐，发酵罐选用500L体积的发酵罐，发酵 罐装量系数体积比为60%，30°C恒温静置厌氧培养48h。取发酵液进行镜检，当90%以上的 菌体已形成芽孢时，即可放罐结束培养。取样测定总活菌数达8.5X10 8cfu/mL、芽孢数量达 8. I X 108cfu/mL，芽孢形成率为 95. 3 %。
[0071] 发酵培养基组成以g/L计：葡萄糖10、牛肉蛋白胨10、酵母膏5、NaCl 5、乙酸钠3、 K2HPO4 2、MgSO4 · 7H20 0· 5、CaCO3 1，用自来水配制，pH 7. 0〇
[0072] 总活菌数的测定采用MPN法。将菌液于80°C下水浴热处理IOmin后，采用MPN法 测定的活菌数即为芽孢数。计数培养基采用国药集团化学试剂有限公司生产的生化试剂级 硫乙醇酸盐液体培养基。
[0073] ⑤芽孢收集及菌粉制备 将培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，获得芽孢，将芽孢与干淀 粉以重量比1 : 3混合，在45°C干燥24h，粉碎机粉碎，过40目筛，加入重量百分比70%的 玉米芯粉辅料，混合均匀，使芽孢含量达lX10 8cfu/g以上，即得到酪酸梭状芽孢杆菌活菌 制剂。
[0074] (3)巨大芽孢杆菌活菌制剂的制备 ①菌体活化 无菌开启巨大芽孢杆菌菌株W(^aieriaw)CGMCC No. 8045的冻干保藏菌种， 划线接种于LB琼脂试管斜面上，28°C培养36h。然后划线转接于LB琼脂茄子瓶斜面上，28°C 培养36h，镜检，当90%以上菌体形成芽孢时，即为成熟。
[0075] ②摇瓶种子培养 用无菌水将茄子瓶斜面上的成熟菌泥刮洗下来，放入内装无菌玻璃珠的灭菌三角瓶 中，振荡分散菌泥，制成均匀的菌悬液。将菌悬液在80°C水浴中加热lOmin，以体积比10% 的接种量接入装有种子培养基的12个500mL三角瓶中，装液量为体积比的10%，摇瓶培养。 摇瓶转速200r/min、培养温度为28°C、培养时间为36h。
[0076] ③种子罐培养 合并摇瓶种子培养液，在80°C水浴中加热10 min，以体积比1 %的接种量接入种子罐 培养，种子罐体积选用1〇〇1^，种子罐的装量系数体积比为60%。种子罐搅拌转速20〇1·/!^!!、 通气量2m3/h、溶氧控制在30%以上，培养温度为28°C、培养时间为36h。镜检，当90%以上 菌体形成芽孢时，即为成熟，准备移种。
[0077] 种子培养基组成以g/L计：玉米淀粉10、蛋白胨5、酵母膏5、NaCl 5、CaCO3 1、 MgSO4 · 7H20 0· 5，用自来水配制，pH7. 0。
[0078] ④发酵罐培养 将成熟的种子培养液经80°C水浴IOmin后，以体积比2. 5%的接种量接入发酵罐，确保 接种后起始芽孢浓度多106cfu/mL，发酵罐选用3T体积的发酵罐，发酵罐装量系数体积比为 80%。发酵罐搅拌转速200r/min、通气量2m 3/h、溶氧控制在30%以上、培养温度为28°C、 培养时间为48h。在培养过程中根据泡沫的高涨情况加泡敌进行消泡，防止因泡沫逃逸出发 酵罐而引起杂菌污染。取发酵液进行镜检，当90%以上的菌体已形成芽孢时，即可放罐结 束培养。取样测定总活菌数达3. 5 X 109cfu/mL，芽孢数量达3. 4X 109cfu/mL，芽孢形成率为 97. 1% 〇
[0079] 发酵培养基组成以g/L计：玉米淀粉10、蛋白胨5、酵母膏5、NaCl 5、CaCO3 1、 MgSO4 · 7H20 0· 5，用自来水配制，pH7. 0。
[0080] 总活菌数的测定采用系列稀释法。将菌液于80°C下水浴热处理IOmin后，采用系 列稀释法测定的活菌数即为芽孢数。
[0081] ⑤芽孢收集及菌粉制备 将培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，获得芽孢，将芽孢与干淀 粉以重量比I : 1混合，在50°C干燥20h，粉碎机粉碎，过40目筛，加入重量百分比70%的 玉米芯粉辅料，混合均匀，使芽孢含量达IX l〇9cfu/g以上，即得到巨大芽孢杆菌活菌制剂。
[0082] (4)复合芽孢杆菌制剂的制备：将步骤（1)制得的凝结芽孢杆菌活菌制剂、步 骤（2)制得的酪酸梭状芽孢杆菌活菌制剂与步骤（3)制得的巨大芽孢杆菌活菌制剂以 1 : 1 : 1的重量比例混合均匀，即得到产品含三株菌的复合芽孢杆菌制剂，芽孢含量达 I X 108-109cfu/g以上，其中凝结芽孢杆菌多I X 109cfu/g ;酪酸梭状芽孢杆菌多I X IO8Cfu/ g;巨大芽孢杆菌彡lX109cfu/g。产品为灰白色粉剂，色泽均一，粒度能通过40目筛，含水 量< 8% ο
[0083] 应用实施例I :含三株菌的复合芽孢杆菌制剂饲喂断奶仔猪 试验在无锡市南洋农畜业有限公司洛社镇双庙村养殖基地内完成。选取发育良好、食 欲旺盛、健康、遗传基础相似、初始体质量10-13±0. 08 kg、45±2日龄的壮X长X大三元 杂交断奶仔猪共60头，随机分为2组，每组30头，公母各半。对照组只饲喂基础日粮，试验 组在基础日粮中添加0. 2% (重量百分比)的含三株菌的复合芽孢杆菌制剂。整个试验期间 的饲养管理、卫生消毒及免疫防疫程序均按猪场常规进行；各组的免疫、用药、通风、饮水、 喂料方式和时间等均一致。正式试验期为43天，在试验开始第1日和试验结束日，称量每栏 试验猪的总重，以计算各项生长指标。每日早上定时记录腹泻头数，观察每栏的粪便情况， 计算腹泻率和腹泻指数。于试验结束日的当天清晨，从每组选6头接近平均体质量的仔猪， 肛门采集新鲜粪样，测定大肠杆菌和乳酸菌含量；并参照国家标准，测定饲料主要营养成分 的表观消化率。试验数据采用单因子方差分析进行差异显著性检验，结果如下： 表1含三株菌的复合芽孢杆菌制剂对断奶仔猪生长和饲料利用率的影响

【权利要求】
1. 一种含三株菌的复合芽孢杆菌制剂，其特征在于所述制剂由产L-乳酸的凝结芽孢 杆菌活菌制剂、产丁酸的酪酸梭状芽孢杆菌活菌制剂和好氧的巨大芽孢杆菌活菌制剂配伍 组成； 其中凝结芽孢杆菌活菌制剂由保藏编号为CGMCC No. 2602的凝结芽孢杆菌菌株经摇瓶 培养、种子罐培养、发酵罐培养、离心收集菌泥，与干淀粉混合、低温干燥、粉碎、过筛，再与 辅料混合均匀得到； 酪酸梭状芽孢杆菌活菌制剂由保藏编号为CGMCC No. 1647的酪酸梭状芽孢杆菌菌株经 摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐培养、离心收集菌泥，与干淀粉混合、低温干燥、粉碎、过筛， 再与辅料混合均匀得到； 巨大芽孢杆菌活菌制剂由保藏编号为CGMCC No. 8045的巨大芽孢杆菌菌株经摇瓶培 养、种子罐培养、发酵罐培养、离心收集菌泥，与干淀粉混合、低温干燥、粉碎、过筛，再与辅 料混合均匀得到。
2. 根据权利要求1所述的含三株菌的复合芽孢杆菌制剂，其特征在于所述制剂由凝结 芽孢杆菌活菌制剂、酪酸梭状芽孢杆菌活菌制剂和巨大芽孢杆菌活菌制剂以1 : 1 : 1的 重量比例混合均匀而得，制剂的芽孢含量达1 X 108-109cfu/g以上。
3. 权利要求1及权利要求2所述的含三株菌的复合芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征 在于制备步骤如下： (1)凝结芽孢杆菌活菌制剂的制备 ① 菌体活化 无菌开启凝结芽孢杆菌菌株)CGMCC No. 2602的冻干保藏菌种， 划线接种于麸皮营养琼脂试管斜面，斜面培养基组成以g/L计为：蛋白胨10、牛肉膏3、NaCl 5、麸皮10、琼脂15-20,用自来水配制，pH 7. 0-7. 2 ;30-36°C培养24-48h ;然后划线转接于 麸皮营养琼脂茄子瓶斜面，30_36°C培养24-48h，镜检，当90%以上菌体形成芽孢时，即为成 熟，准备移种； ② 摇瓶及种子罐培养 准备一个内装玻璃珠的无菌三角瓶，用无菌水将茄子瓶斜面上的成熟菌泥刮洗下来， 装入三角瓶，振荡分散菌泥，获得均匀的菌悬液；将菌悬液在80°C水浴中加热10min，以体 积比1%-10%的接种量接入250mL三角瓶，装液量为15mL ;或接入500mL三角瓶，装液量为 30mL ;摇瓶培养； 将摇瓶液体培养液在80°C水浴中加热10 min，以体积比1%-10%的接种量转接入种子 罐培养，种子罐体积选用l〇L、20L、50L或100L，种子罐装量系数 体积比为60%-70%，镜检，当90%以上菌体形成芽孢时，即为成熟，准备移种； 培养基组成以g/L计：麸皮5-20、酵母膏5-10、豆柏粉5-10、K2HP04 3、NaCl 5、 MnS04 ? H20 0? 3,用自来水配制，pH 7. 0 ; 培养条件为：摇瓶转速200r/min、种子罐搅拌转速多150r/min、通气量l-2m3/h、培养 温度为30-60°C、培养时间为18-48h ; ③ 发酵罐培养 种子培养液以体积比1%_1〇%的接种量接入发酵罐，发酵罐选用1 T、2T、或3T体积的发 酵罐，发酵罐装量系数体积比为60%-70% ; 发酵培养基由碳源、氮源和无机盐组成，以g/L计：碳源5-20、氮源5-20、K2HP04 3、NaCl 5、MnS04，H20 0.3、碳酸1? 2-10,用自来水配制，pH 6.0-8. 0;碳源选用麸皮、葡萄糖、鹿糖、 乳糖、麦芽糖、果糖、阿拉伯糖、玉米糖、大米糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀 粉、红薯淀粉或马铃薯淀粉的一种或几种；氮源选用蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米浆粉、豆 柏粉、大豆肽、棉籽蛋白、黄豆饼粉或花生饼粉中的一种或几种； 发酵罐培养条件为：搅拌转速彡150r/min、通气量l-2m3/h、培养温度为30-60°C、培养 时间为18_48h ;在培养过程中根据泡沫的高涨情况加豆油或泡敌进行消泡，防止因泡沫逃 逸出发酵罐而引起杂菌污染；取发酵液进行镜检，当90%以上的菌体已形成芽孢时，即可放 罐结束培养，取样测总活菌数和芽孢数； 活菌及芽孢检测用番茄汁琼脂计数培养基，以g/L计：酵母膏10、蛋白胨10、番茄汁 200mL、CaC03 5、琼脂15-20,蒸馏水800mL，pH 7.0-7.2 ;测得发酵液芽孢数量达lX109cfu/ mL以上； ④芽孢收集及菌粉制备 将培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，获得芽孢，将芽孢与干淀 粉以重量比1 : 1-5混合，在40-50°C干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，加入辅料石粉、 麸皮或玉米芯粉中的一种或几种，辅料加入量为总重量的60%-80%，混合后制成微生态凝结 芽孢杆菌活菌制剂，芽孢含量达lX109cfu/g以上； (2)酪酸梭状芽孢杆菌活菌制剂的制备 ① 菌体活化 无菌开启酪酸梭状芽孢杆菌菌株（^/〇5^/￡//?7?/?(_7_/^腫）06]\0^1^〇.1647的冻干 保藏菌种，接入装有活化培养基的试管中，进行静置厌氧培养，30-37°C培养18-24h ;然后 以体积比1%-1〇%的接种量转接于装有新鲜活化培养基的试管中，30-37°C静置厌氧培养 20-24h，镜检，超过90%菌体形成芽孢时，即成熟；反复活化2-3次； 活化培养基由下述原料及重量配比组成，以g/L计：酵母膏3-5、牛肉膏5-20、蛋白胨 5-20、葡萄糖5-10、可溶性淀粉1-2、NaCl 5、乙酸钠3-5、盐酸半胱氨酸0.5-1、CaC03 3，用 自来水配制，pH 6. 0-7.5 ; ② 摇瓶及种子罐培养 将活化后的菌悬液在80°C水浴中加热lOmin，以体积比1%-10%的接种量接入装有种子 培养基的250mL三角瓶中，装液量为体积比的80%-90%，30-37°C恒温培养箱中静置厌氧培 养 20-24h ; 将摇瓶液体培养液在80°C水浴中加热lOmin，以体积比1%-10%的接种量转接入种子罐 培养，种子罐体积选用l〇L、20L或50L，种子罐的装量系数体积比为60 % -70 %，30-37°C恒 温静置厌氧培养20-48h ;镜检，当90%以上菌体形成芽孢时，即为成熟，准备移种； 种子培养基组成以g/L计：酵母膏3、牛肉膏10、胰蛋白胨10、葡萄糖5、可溶性淀粉1、 NaCl 5、乙酸钠3、盐酸半胱氨酸0. 5,用自来水配制，pH7. 0 ; ③ 发酵罐培养 种子培养液以体积比1%_1〇%的接种量接入发酵罐，发酵罐选用l〇〇L、200L或500L体 积的发酵罐，发酵罐装量系数体积比为60%-70%，30-37°C恒温静置厌氧培养20-48h ;取发 酵液进行镜检，当90%以上的菌体已形成芽孢时，即可放罐结束培养，取样测总活菌数和芽 孢数； 发酵培养基组成以g/L计：葡萄糖10、牛肉蛋白胨10、酵母膏5、NaCl 5、乙酸钠3、 K2HP04 2、MgS04 ? 7H20 0? 5、CaC03 1，用自来水配制，pH 7. 0 ; 总活菌数的测定采用MPN法，将菌液于80°C水浴热处理lOmin后，采用MPN法测定的活 菌数即为芽孢数，计数培养基采用国药集团化学试剂有限公司生产的生化试剂级硫乙醇酸 盐液体培养基，测得发酵液芽孢数量达lX108cfu/mL以上； ④芽孢收集及菌粉制备 将培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，获得芽孢，将 芽孢与干淀粉以重量比1 : 1-5混合，在40-50°C干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目 筛，加入辅料石粉、麸皮或玉米芯粉中的一种或几种，辅料加入量为总重量的60%-80%，混合 后制成微生态酪酸梭状芽孢杆菌活菌制剂，芽孢含量达IX 108cfu/g以上； (3)巨大芽孢杆菌活菌制剂的制备 ① 菌体活化 无菌开启巨大芽孢杆菌菌株No. 8045的冻干保藏菌种， 划线接种于LB琼脂试管斜面上，28-37°C培养36-48h，然后划线转接于LB琼脂茄子瓶斜面 上，28-37°C培养36-48h，镜检，当90%以上菌体形成芽孢时，即为成熟； ② 摇瓶及种子罐培养 用无菌水将茄子瓶斜面上的成熟菌泥刮洗下来，放入内装无菌玻璃珠的灭菌三角 瓶中，振荡分散菌泥，制成均匀的菌悬液；将菌悬液在80°C水浴中加热lOmin，以体积比 1%-10%的接种量接入装有种子培养基的250mL或500mL三角瓶中，装液量为体积比的10%， 摇瓶培养； 将摇瓶液体培养液在80°C水浴中加热lOmin，以体积比1%-10%的接种量转接入种子罐 培养，种子罐体积选用l〇L、20L、50L或100L，种子罐的装量系数体积比为60%-70% ;镜检，当 90%以上菌体形成芽孢时，即为成熟，准备移种； 种子培养基组成以g/L计：玉米淀粉10、蛋白胨5、酵母膏5、NaCl 5、CaC03 1、 MgS04 ? 7H20 0? 5，用自来水配制，pH 7. 0 ; 培养条件为：摇瓶转速200r/min、种子罐搅拌转速多200r/min、通气量l-2m3/h、溶氧 控制在30%以上，培养温度为28-37°C、培养时间为36-48h ; ③ 发酵罐培养 将成熟的种子培养液经80°C水浴lOmin后，以体积比1%-10%的接种量接入发酵罐，确 保接种后起始芽孢浓度多106cfu/mL，发酵罐选用1T、2T或3T体积的发酵罐，发酵罐装量系 数体积比为70%-80% ; 发酵培养基组成以g/L计：玉米淀粉10、蛋白胨5、酵母膏5、NaCl 5、CaC03 1、 MgS04 ? 7H20 0? 5，用自来水配制，pH 7. 0 ; 发酵罐培养条件为：搅拌转速多200r/min、通气量l-2m3/h、溶氧控制在30%以上、培 养温度为28-37°C、培养时间为36-48h ;在培养过程中根据泡沫的高涨情况加豆油或泡敌 进行消泡，防止因泡沫逃逸出发酵罐而引起杂菌污染；取发酵液进行镜检，当90%以上的菌 体已形成芽孢时，即可放罐结束培养，取样测总活菌数和芽孢数； 总活菌数的测定采用系列稀释法；将菌液于80°C水浴热处理lOmin后，采用系列稀释 法测定的活菌数即为芽孢数；测得发酵液芽孢数量达IX 109cfU/mL以上； ④芽孢收集及菌粉制备 将培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，获得芽孢，将芽孢与干淀 粉以重量比1 : 1-5混合，在40-50°C干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，加入辅料石粉、 麸皮或玉米芯粉中的一种或几种，辅料加入量为总重量的60%-80%，混合后制成微生态巨大 芽孢杆菌活菌制剂，芽孢含量达lX109cfu/g以上； (4)复合芽孢杆菌制剂的制备 将步骤（1)制得的凝结芽孢杆菌活菌制剂、步骤（2)制得的酪酸梭状芽孢杆菌活菌制 剂与步骤（3)制得的巨大芽孢杆菌活菌制剂以1 : 1 : 1的重量比例混合均匀，即得到产 品含三株菌的复合芽孢杆菌制剂，芽孢含量达lX 108-109cfu/g以上。
4. 用权利要求3所述方法制备的含三株菌的复合芽孢杆菌制剂的应用，其特征在于用 于牲畜饲料，添加量为饲料干重的0. 02%-0. 5%。
5. 用权利要求3所述方法制备的含三株菌的复合芽孢杆菌制剂的应用，其特征在于用 于禽类饲料，添加量为饲料干重的〇. 〇2%-〇. 2%。
6. 用权利要求3所述方法制备的含三株菌的复合芽孢杆菌制剂的应用，其特征在于用 于水产饲料，添加量为饲料干重的0. 02%-0. 2%。
7. 根据权利要求4所述含三株菌的复合芽孢杆菌制剂的应用，其特征在于所述牲畜包 括猪、牛、羊、兔大型食草类和非食草类动物。
8. 根据权利要求5所述含三株菌的复合芽孢杆菌制剂的应用，其特征在于所述禽类包 括鸡、鸭、鹅。
9. 根据权利要求6所述含三株菌的复合芽孢杆菌制剂的应用，其特征在于所述水产类 包括甲鱼、虫下、蟹甲壳类水生动物和其它各种淡水鱼、海水鱼。
【文档编号】A23K1/16GK104480052SQ201510001428
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2015年1月5日 优先权日:2015年1月5日
【发明者】张一平, 华洵璐, 匡群, 邹三元, 孙梅, 钱仁界, 张宪中, 叶进, 秦海萍 申请人:江苏省苏微微生物研究有限公司, 无锡市南洋农畜业有限公司, 无锡市水产畜牧技术推广总站, 宜兴市天石饲料有限公司