本发明属于农业技术领域，具体地说，涉及一种培养籼稻愈伤组织的方法。
背景技术：
随着大规模的水稻基因组测序的结束和水稻序列图谱的绘制，基因组数据库中积累了大量的数据，功能基因组的研究已经被提上议事日程。基因工程将会成为后基因组时代基因功能验证的必须手段，而不仅仅只是应用研究的工具。因此，如何建立一套稳定、高效的转化系统就显得非常重要。理想的外植体的获得是建立水稻高效转化系统的前提。近年来的研究表明，水稻的幼胚、幼穗、成熟胚以及花药等的愈伤组织都可以作为转基因的理想受体。其中，幼胚因为出愈率高、胚性好被认为是最理想的转化受体，但其取材受季节限制，操作复杂费时费力且易污染，从而限制了其在基因工程中应用的持续性。一般认为，成熟胚诱导效率不高、继代易褐化、胚性不好，尤以籼稻更甚。但已有的一些研究表明，对诱导和继代条件适当优化，来源于成熟胚的愈伤组织仍可获得良好的效果。而且成熟胚取材不受季节限制、操作简便，可以持续不断地提供转化受体，如果能摸索条件提高籼稻愈伤的诱导率和生活力，使其在基因工程中得到更广泛的应用，势必将会促进功能基因组学和基因工程本身的发展。
自1902年德国植物学家G1Haberlandt提出细胞全能性(Totipotency)理论之后，经过科学家们50余年的不断试验,植物细胞的全能性得到了充分论证,建立在此基础上的植物组织培养技术也得到了迅速发展。水稻的组织培养始于1955年Akio等进行的根尖培养,之后又相继进行了幼胚、节、种子、叶鞘、胚乳及叶片等离体再生培养研究。1968年日本科学家H1Niizeki等首次获得水稻花培植株,随后广大水稻育种工作者对花药培养技术进行了不断的探索研究。我国水稻花药培养研究始于1970年,于1975年育成水稻花培新品种新秀、花育1号和中花2号等水稻花培新品种并很快应用于生产,显示了花培育种在农业上应用的潜力。“七五”计划期间,在中国科学院和中国农业科学院的共同主持下,有组织地开展全国协作,“七五”攻关结束时,协作组培育并通过种子部门审定的花培品种有5个,其中由中国农业科学院李梅芳等育成了中花系列,如“中花8号”和“中花9号”等粳稻品种,在京津唐地区推广万亩以上；北京市农林科学院育成的京花101,黑龙江省合江水稻所育成的合江21等花培品种也都分别作为当地推广品种。我国科学家在水稻花药培养、单倍体育种方面进行了大量的工作,不仅改进了培养技术,并对小孢子再生的花粉植株的细胞学与遗传学、雄核发育、细胞分化与形态发生以及一些机理问题作了研究,从而大幅度提高了花粉植株的诱导频率,为花药培养在水稻品种改良的应用打下了坚实的基础。近年来,水稻转基因研究取得了长足进展。然而,大部分已获得成功转化的品种均为粳稻,占整个水稻品种80％以上的籼稻品种,则因为愈伤组织诱导和植株再生率低而遗传转化困难。目前在籼稻组织培养技术中存在的问题是籼稻成熟胚诱导效率不高、继代易褐化、胚性不好，因而影响了其在水稻育种的应用。
水稻作为中国最主要的粮食作物，而现有水稻品种的产量与品质还不能满足人们日益提高的生活水平需要，因而改进与提高现有水稻品种的产量与品质仍是育种工程的主要课题。传统的作物遗传育种方法为水稻产量的提高和品质的改善做出了重要贡献。而今后水稻的进一步遗传改良除了坚持常规的育种方法外，将细胞和组织培养技术、转基因育种技术等应用于水稻育种将是现代作物育种发展的必然趋势。成熟胚培养取材方便，不受季节的限制，水稻遗传育种中具有广阔的应用前景。但是到现在为止，对于占我国水稻种植面积80％的籼稻而言，适合不同籼稻品种的高效组织培养体系还未建立，特别是籼稻品种成熟胚的组织培养效果不佳，进行基因转化的难度明显大于粳稻。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种培养籼稻愈伤组织的方法，该方法以6种重要的籼稻品种为材料，研究了不同培养条件对其愈伤诱导力及分化力的影响，以期为建立高效的籼稻成熟胚受体系统奠定基础。
其具体技术方案为：
一种培养籼稻愈伤组织的方法，包括以下步骤：
步骤1、籼稻成熟种子的消毒
将水稻籼稻品种沪旱1B、沪旱11B、旱恢3号、旱恢7号、沪旱15中饱满成熟的种子经手工去壳或机器脱粒，选择色白、色纯、饱满的米粒用75％的酒精消毒一分钟，再用1.5％的次氯酸钠消毒20-25分钟，放在摇床上摇，用无菌水冲洗4-5次；
步骤2、不同光照培养条件下诱导籼稻初生愈伤及其分化
①将沪旱1B、旱恢7号、沪旱15的种子经消毒后，分别放在加有滤纸的无菌培养皿中置于超净工作台上吹干，然后分别接种到NB的诱导培养基上，每个培养瓶接10-12粒，接好的种子一部分放在30℃的暗箱中培养，另一部分放在30℃的光培室中培养，光培的时间为每天8:00-22:00，10天后分别统计各水稻品种各处理的出愈率；
②统计完出愈率后，将诱导成功的愈伤组织分离出来直接转移到分化培养基上，每瓶转移愈伤组织6块并置于25℃的光照条件下进行分化，分化期间的光照强度为2000Lx,光照时间为每天14h，25-30天后分别统计各种水稻品种各处理的分化率；
步骤3、不同诱导培养基条件下诱导籼稻初生愈伤及其分化
①将沪旱11B、旱恢3号的种子经消毒后分别放在加有滤纸的无菌培养皿中置于超净工作台上吹干，然后每个品种分别接到NB、MB、JAJB的诱导培养基上，每瓶接10粒，并放在30℃的光照条件下培养，光照时间为每天8:00-22:00，培养10天后分别统计各品种各处理的出愈率；
②统计完出愈率后，将诱导成功的愈伤组织分离出来直接转移到分化培养基上，每瓶转移愈伤组织8块并置于25℃的光照条件下进行分化，分化期间的光照强度为2000Lx,光照时间为每天14h，25-30天后分别统计各种水稻品种各处理的分化率。
步骤4、方差分析
利用Excel软件中数据分析功能，进行无重复双因素方差分析和显著性检验。
进一步，所述出愈率的计算具体为：
出愈率＝(产生愈伤组织的种胚数/接种的种胚数)×100％；
每种处理初生愈伤的重量统计具体为：
初生愈伤的重量统计用的是Excel软件统计，统计各籼稻品种愈伤组织的总块数和愈伤组织的总鲜重，然后计算各品种愈伤组织重量的平均值；
所述分化率的计算具体为：
绿苗分化率＝(产生绿苗的愈伤组织块数/转移的愈伤组织块数)×100％。
进一步，诱导培养基：沪旱1B、旱恢7号、沪旱15用NB培养基+2，4-D 2.5mg/L，
旱恢3号、沪旱11B每种均用三种培养基，分别为NB培养基+2，4-D 2.5mg/L，MB培养基+2，4-D 2.5mg/L，JAJB培养基+2，4-D 2.5mg/L，这三种培养基除了母液不同外，其他成分均按照JAJB的来配；
分化培养基：MS+NAA 0.2mg/L+IAA 0.2mg/L+KT 2mg/L+6-BA 2mg/L；
预培养基：1/2MS+2，4-D 3mg/L+水解酪蛋白0.6g/L+麦芽糖20g/L+琼脂6.8g/L；
筛选培养基：H7-1C、1B-2A用MB培养基+2，4-D 2.0mg/L，灭菌后加抗生素Carb 500mg/L和Basta 20mg/L；HH15用NB培养基+2，4-D 2.0mg/L，灭菌后加抗生素。
进一步，NB基本培养基配方：N6大量Ⅰ(50倍)20ml/L+N6大量Ⅱ(50倍)20ml/L+B5微量(1000倍)1ml/L+B5有机(100倍)10ml/L+Fe-EDTA(100倍)10ml/L+2,4-D 2/2.5mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+脯氨酸0.5g/L+谷氨酰胺0.5g/L+肌醇0.1g/L+麦芽糖30g/L+琼脂6.8g/L；
MB基本培养基配方：MS大量Ⅰ(50倍)20ml/L+MS大量Ⅱ(50倍)20ml/L+B5微量(1000倍)1ml/L+B5有机(100倍)10ml/L+Fe-EDTA(100倍)10ml/L+2,4-D 2/2.5mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+脯氨酸0.5g/L+谷氨酰胺0.5g/L+肌醇0.1g/L+麦芽糖30g/L+琼脂6.8g/L；
JAJB基本培养基配方：JA(20倍)50ml/L+JB(100倍)10ml/L+Fe-EDTA(100倍)10ml/L+MS有机(100倍)10ml/L+2,4-D 2.5mg/L+水解酪蛋白0.8g/L+脯氨酸0.6g/L+谷氨酰胺0.5g/L+麦芽糖30g/L+琼脂6.8g/L；
MS基本培养基配方：MS大量Ⅰ(50倍)20ml/L+MS大量Ⅱ(50倍)20ml/L+MS微量(100倍)10ml/L+MS有机(100倍)10ml/L+Fe-EDTA(100倍)10ml/L+2,4-D 2.5mg/L+水解酪蛋白0.8g/L+脯氨酸0.6g/L+谷氨酰胺0.5g/L+麦芽糖30g/L+琼脂6.8g/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明以6种重要的籼稻品种为材料，研究了不同培养条件对其愈伤诱导力及分化力的影响，以期为建立高效的籼稻成熟胚受体系统奠定基础；使用该培养方案中的技术体系，籼稻的出愈率光下可达92％以上，暗下也达85％以上，比一般培养方案的出愈率20-30％高出2-3倍。
具体实施方式
下面结合具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1材料与方法
1.1实验材料
沪旱1B(简称1B)；沪旱11B(简称11B)；旱恢3号(简称H3)；旱恢7号(简称H7)；沪旱15(简称HH15)
本实验在上海市农业生物基因中心完成，实验材料、仪器设备、药品和试剂均由上海市农业生物基因中心提供。
1.2培养基
①诱导培养基：沪旱1B、旱恢7号、沪旱15用NB培养基+2，4-D 2.5mg/L，旱恢3号、沪旱11B每种均用三种培养基，分别为NB培养基+2，4-D 2.5mg/L，MB培养基+2，4-D 2.5mg/L，JAJB培养基+2，4-D 2.5mg/L，这三种培养基除了母液不同外，其他成分均按照JAJB的来配。
②分化培养基：MS+NAA 0.2mg/L+IAA 0.2mg/L+KT 2mg/L+6-BA 2mg/L
③预培养基：1/2MS+2，4-D 3mg/L+水解酪蛋白0.6g/L+麦芽糖20g/L+琼脂6.8g/L。
④筛选培养基：H7-1C、1B-2A用MB培养基+2，4-D 2.0mg/L，灭菌后加抗生素Carb500mg/L和Basta 20mg/L；HH15用NB培养基+2，4-D 2.0mg/L，灭菌后加抗生素同上。
1.3实验方法
1.3.1籼稻成熟种子的消毒
将上述各水稻品种中饱满成熟的种子经手工去壳或机器脱粒，选择色白、色纯、饱满的米粒用75％的酒精消毒一分钟，再用1.5％的次氯酸钠消毒20-25分钟(放在摇床上摇)，用无菌水冲洗4-5次。
1.3.2不同光照培养条件下诱导籼稻初生愈伤及其分化
①将沪旱1B、旱恢7号、沪旱15的种子经消毒后，分别放在加有滤纸的无菌培养皿中置于超净工作台上吹干，然后分别接种到NB的诱导培养基上，每个培养瓶接10-12粒。接好的种子一部分放在30℃的暗箱中培养，另一部分放在30℃的光培室中培养。光培的时间为每天8:00-22:00。10天后分别统计各水稻品种各处理的出愈率。
②统计完出愈率后，将诱导成功的愈伤组织分离出来直接转移到分化培养基上，每瓶转移愈伤组织6块并置于25℃的光照条件下进行分化。分化期间的光照强度为2000Lx,光照时间为每天14h。25-30天后分别统计各种水稻品种各处理的分化率。
1.3.3不同诱导培养基条件下诱导籼稻初生愈伤及其分化
①将沪旱11B、旱恢3号的种子经消毒后分别放在加有滤纸的无菌培养皿中置于超净工作台上吹干，然后每个品种分别接到NB、MB、JAJB的诱导培养基上，每瓶接10粒，并放在30℃的光照条件下培养。光照时间为每天8:00-22:00。培养10天后分别统计各品种各处理的出愈率。
②统计完出愈率后，将诱导成功的愈伤组织分离出来直接转移到分化培养基上，每瓶转移愈伤组织8块并置于25℃的光照条件下进行分化。分化期间的光照强度为2000Lx,光照时间为每天14h。25-30天后分别统计各种水稻品种各处理的分化率。
1.4统计方法
1.4.1出愈率的计算
出愈率＝(产生愈伤组织的种胚数/接种的种胚数)×100％
1.4.2每种处理初生愈伤的重量统计
初生愈伤的重量统计用的是Excel软件统计。即统计各籼稻品种愈伤组织的总块数和愈伤组织的总鲜重，然后计算各品种愈伤组织重量的平均值。
1.4.3分化率的计算
绿苗分化率＝(产生绿苗的愈伤组织块数/转移的愈伤组织块数)×100％
1.4.4方差分析
利用Excel软件中数据分析功能，进行无重复双因素方差分析和显著性检验。
2结果与分析
2.1不同光照培养条件对籼稻出愈率的影响
结果表明:相同培养条件下，各籼稻品种之间出愈率差异显著(F值10.53*)；不同光照培养条件下，相同籼稻品种的出愈率差异极显著(F值39.68*)。说明在相同培养条件下，不同籼稻品种对籼稻初生愈伤的诱导力有影响；相同培养基条件下，光照条件对籼稻品种初生愈伤的诱导力也有影响，且光照条件对其影响要大。
表1.培养基相同不同光照条件下各籼稻品种的出愈率
注：以上品种均在NB培养基上培养
从表1统计结果中可以看出光照条件比黑暗条件有利于各籼稻品种的初生愈伤诱导，而愈伤诱导率情况为沪旱15>沪旱1B>旱恢7号。由此可见对于本实验中籼稻品种，沪旱15最容易诱导，沪旱1B其次，再次是旱恢7号。
2.2不同光照培养条件对籼稻初生愈伤生长量的影响
结果表明：相同培养条件下，各籼稻品种之间的初生愈伤生长量差异极显著(F值
15.97**)；不同的光照条件下，相同籼稻品种的初生愈伤生长量差异显著(F值13.48*)。说明基因型和光照条件都对籼稻初生愈伤的生长量有影响，且相同培养条件下基因型对各籼稻品种初生愈伤生长量的影响要大。
表2.相同培养基不同光照条件下各籼稻品种初生愈伤生长量
注：以上品种均在NB培养基上培养
根据表2统计结果可以看出：光照条件下，各籼稻品种的愈伤生长量要大于黑暗条件下；相同培养条件下，愈伤生长量情况为沪旱1B>沪旱15>旱恢7号。由此可见1B的愈伤生长力最强，其次是HH15，再次是H7。.
2.3不同光照培养条件下诱导的籼稻初生愈伤的分化情况
结果表明：在相同培养条件下诱导，各籼稻品种之间初生愈伤的分化率差异极显著(F值443.59**)；在不同光照诱导条件下，各籼稻品种的初生愈伤分化率差异显著(F值28.65*)。说明基因型和诱导的光照条件都对籼稻初生愈伤的分化率有影响，且相同培养条件下基因型对各籼稻品种初生愈伤分化率的影响要大。
表3.相同培养基不同光照诱导条件下各籼稻品种初生愈伤的分化率
注：以上品种均在NB培养基上培养
表3统计结果显示：相同诱导培养基不同光照诱导条件下，各籼稻品种的分化率为暗培高于光培率；相同诱导条件下，品种之间分化率为沪旱1B>沪旱15>旱恢7号。
2.4不同诱导培养基对籼稻出愈率的影响
结果表明：在相同诱导培养基相同诱导条件下，各籼稻品种之间的出愈率差异显著(F值26.84*)；不同培养基相同培养条件下，各籼稻品种的出愈率差异不显著(F值5.48)。说明基因型对各籼稻品种的出愈率有影响，而诱导培养基对各籼稻的出愈率无明显影响。
表4.不同培养基相同培养条件下出愈率统计表
注：以上品种在光照条件下培养
表4统计结果显示:相同培养条件相同培养基条件下，各籼稻品种之间的出愈率为11B>H3；相同品种在相同培养条件不同培养基条件下，11B的出愈率为JAJB>NB>MB，H3的出愈率为JAJB>MB>NB。
2.5不同诱导培养基对籼稻初生愈伤生长量的影响
结果表明：在相同培养基相同培养条件下，各籼稻品种之间的愈伤生长量差异显著(F值9.25*)；不同培养基相同培养条件下，各籼稻品种的愈伤生长量差异显著(F值7.67*)。说明籼稻品种的基因型和培养基均对籼稻的愈伤生长量有影响。
表5.不同培养基相同培养条件下各籼稻品种出愈率统计表
注：以上品种在光照条件下培养
表5统计结果显示：相同培养基相同培养条件下，各籼稻品种的愈伤生长量为11B>H3；不同培养基相同培养条件下，各籼稻的愈伤生长量为NB>JAJB>MB。
上述分析结果显示的出愈率、愈伤生长量及分化率差异主要是由于不同的籼稻品种其基因型不同，从而决定了其成熟胚的胚性不同，导致其愈伤诱导力及生活力的不同。因此，不同的籼稻品种即使在相同的诱导培养条件下，其出愈率、愈伤生长量及分化率也会有很大的差异。而光照条件和培养基作为环境因素，也会在一定程度上影响籼稻愈伤诱导力和生活力。因而，相同培养基不同光照培养条件下，相同的籼稻品种的初生愈伤诱导力和生活力也会不同，从而导致其诱导率、愈伤生长量及分化率差异很大。同样，在不同培养基相同光照条件下，相同的籼稻品种的初生愈伤诱导率、愈伤生长量及分化率也会有差异，只是差异的程度不同。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。