卵孢菌素在制备生物农药中的应用的制作方法

技术领域：

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及卵孢菌素在制备生物农药中的应用。

背景技术：
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农作物病虫害是我国的主要农业灾害之一，它具有种类多、影响大、并时常暴发成灾的特点，其发生范围和严重程度对我国农业生产常造成重大损失。目前农作物病虫害仍以有机合成的化学农药防治为主，但化学农药的长期使用容易引起人畜中毒、污染环境、杀伤有益生物、破坏生态平衡、虫害容易产生抗药性等。生物防控是利用有益微生物及其代谢产物和基因产品等控制病虫害的方法，具有对人畜安全，不污染环境，不会或较少产生抗性，而且仅杀伤或抑制防治对象，因此，生物防治逐渐成为病虫害防治研究中的主要领域，从微生物资源中寻找新的天然活性物质代替化学农药保护作物已成为当前研究的重点。

卵孢菌素(oosporein，2,2′,5,5′-四羟基-4,4′-双甲苯醌)是一种多羰基强酸性化合物，1994年首次从真菌oosporacolorans的发酵液中分离得到。随后，分别从白僵菌属bearveria、枝顶孢属acremonium、轮枝孢属verticillium、毛壳属chaetomium、附球菌属epicoccum等真菌的代谢产物中分离得到。卵孢菌素具有抗细菌、抑制ⅰ型单纯疱疹病毒dna聚合酶和单胺氧化酶等活性。对水稻枯萎病真菌rhizotoniasolani、灰霉菌botrytiscinerea、鸡冠花猝倒病菌pytiumultimum、致病疫霉phytophthorainfestans等植物病原真菌有较强的抑制效果，在防治植物病害方面具有良好的应用前景。

本发明所涉及的卵孢菌素，其化学名为2,2′,5,5′-四羟基-4,4′-双甲苯醌，结构式如(ⅰ)所示：

本发明所涉及的卵孢菌素制备方法公开于专利“一种深红虫草及利用其制备卵孢菌素的方法和其用途.李冬利等，2011，中国专利，zl201010594470.7”。但到目前为止，尚没有卵孢菌素在防治害虫方面的报道。

技术实现要素：
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本发明的第一个目的是提供卵孢菌素在制备生物农药中的应用。

利用卵孢菌素(oosporein)对斜纹夜蛾spodopteralitura或甜菜夜蛾spodopteraexigua进行拒食活性实验。通过实验发现，当卵孢菌素在5000或10000ppm浓度时对斜纹夜蛾或甜菜夜蛾均表现出明显的拒食效果(图1、图2)。选择78.12、312.50、2500、5000ppm4个浓度分别对斜纹夜蛾进行选择性和非选择性拒食率和拒食中浓度测定，选择250、500、2000、4000ppm4个浓度分别对甜菜夜蛾进行选择性和非选择性拒食率和拒食中浓度测定，确定卵孢菌素对斜纹夜蛾的选择性和非选择性拒食率随浓度升高而提高，拒食中浓度分别为2907.17、1419.38ppm，对甜菜夜蛾的选择性和非选择性拒食率也随浓度升高而提高，拒食中浓度分别为1541.35ppm、2055.63ppm。实验结果表明：卵孢菌素对斜纹夜蛾或甜菜夜蛾具有较好的拒食活性，能防止害虫对农作物的危害，因此，卵孢菌素可用于制备生物农药。

因此，本发明提供卵孢菌素在制备生物农药中的应用。

本发明的第二个目的是提供卵孢菌素在防止鳞翅目害虫危害中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种生物农药，其特征在于，含有有效量的卵孢菌素作为活性成分。

优选，所述的生物农药为防止害虫危害的农药。

进一步优选，所述的害虫为鳞翅目害虫。

再进一步优选，所述的鳞翅目害虫为斜纹夜蛾或甜菜夜蛾。

本发明发现卵孢菌素对农作物害虫斜纹夜蛾和甜菜夜蛾具有较好的拒食活性，表明卵孢菌素具有较好的防止害虫危害作用，具有良好的应用开发前景。因此，本发明为研究与开发新的防虫农药提供了候选农药，为虫生真菌在害虫生物防治上的应用提供科学依据。

附图说明：

图1是卵孢菌素对斜纹夜蛾的拒食效果。

图2是卵孢菌素对甜菜夜蛾的拒食效果。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：卵孢菌素对斜纹夜蛾spodopteralitura或甜菜夜蛾spodopteraexigua的拒食活性测定

1、卵孢菌素对斜纹夜蛾spodopteralitura的拒食活性测定

将卵孢菌素用dmso溶解配制成10000ppm浓度，用0.5％(w/w)的吐温80水溶液稀释至浓度为5000ppm浓度，将苋菜叶分别在5000ppm、10000ppm浓度药剂中浸泡3s，取出晾干，平放在垫有湿润滤纸的培养皿中，在培养皿中放置5头二龄初斜纹夜蛾，将培养皿平放于28±1℃的观测室中，24h后观察卵孢菌素对斜纹夜蛾的拒食效果。

2、卵孢菌素对甜菜夜蛾spodopteraexigua的拒食活性测定

卵孢菌素对甜菜夜蛾spodopteraexigua的拒食活性测定方法同步骤1卵孢菌素对斜纹夜蛾的实验方法，24h后观察卵孢菌素对斜纹夜蛾的拒食效果。

实施例2：不同浓度的卵孢菌素对斜纹夜蛾spodopteralitura或甜菜夜蛾spodopteraexigua的拒食率和拒食中浓度测定

1、不同浓度的卵孢菌素对斜纹夜蛾spodopteralitura的拒食率和拒食中浓度测定

1.1采用叶蝶浸液法测定不同浓度的卵孢菌素对斜纹夜蛾进行非选择性拒食率和拒食中浓度：

将卵孢菌素用dmso溶解配制成10000ppm浓度母液。将母液用0.5％(w/w)的吐温80水溶液稀释至浓度为78.12、312.50、2500、5000ppm。将苋菜叶剪成相似大小的叶蝶，实验组叶蝶分别在上述4个浓度药剂中浸泡3s，阴性对照组用吐温80水浸泡3s，取出晾干，称重。在垫有湿润滤纸的不同培养皿中呈一字状排列分别放置8片实验组和阴性对照组称重后的叶碟，在培养皿中放置二龄初斜纹夜蛾5头，并设置一组不放置试虫的空白对照，用以矫正水分挥发引起的叶碟重量变化。将培养皿平放于28±1℃的观测室中，每处理重复3次。24h后将残存叶碟取出，分别称量实验组和对照组叶碟剩余重量，计算取食量。用以下公式计算非选择性拒食率，根据卵孢菌素浓度和拒食率之间的线性关系计算拒食中浓度。

非选择性拒食率(％)＝(阴性对照组取食量－实验组取食量)/阴性对照组取食量×100％

1.2采用叶蝶浸液法测定不同浓度的卵孢菌素对斜纹夜蛾进行选择性拒食率和拒食中浓度：

将卵孢菌素用dmso溶解配置成10000ppm浓度母液。将母液用0.5％(w/w)的吐温80水溶液稀释至浓度为78.12、312.50、2500、5000ppm。将苋菜叶剪成相似大小的叶蝶，实验组叶蝶分别在上述4个浓度药剂中浸泡3s，阴性对照组用0.5％(w/w)吐温80水浸泡3s，取出晾干，称重。在垫有湿润滤纸的培养皿中呈十字交叉状排列同时放置8片实验组和阴性对照组称重后的叶碟，在培养皿中间放置二龄初斜纹夜蛾5头，并设置一组不放置试虫的空白对照，用以矫正水分挥发引起的叶碟重量变化。将培养皿平放于28±1℃的观测室中，每处理重复3次。24h后将残存叶碟取出，分别称量实验组和阴性对照组叶碟剩余重量，计算取食量。用以下公式计算选择性拒食率，根据卵孢菌素浓度和拒食率线性关系计算拒食中浓度。

选择性拒食率(％)＝(阴性对照组取食量－实验组取食量)/(阴性对照组取食量+实验组取食量)×100％

2、不同浓度的卵孢菌素对甜菜夜蛾spodopteraexigua的拒食率和拒食中浓度测定

2.1采用叶蝶浸液法测定不同浓度的卵孢菌素对甜菜夜蛾进行非选择性拒食率和拒食中浓度：

采用非选择性试验方法对甜菜夜蛾进行非选择性拒食率和拒食中浓度测定，方法同实施例2步骤1.1对斜纹夜蛾非选择性试验方法，用以下公式计算非选择性拒食率，根据卵孢菌素浓度和拒食率之间的线性关系计算拒食中浓度。

非选择性拒食率(％)＝(阴性对照组取食量－实验组取食量)/阴性对照组取食量×100％

2.2采用叶蝶浸液法测定不同浓度的卵孢菌素对甜菜夜蛾进行选择性拒食率和拒食中浓度：

采用选择性试验方法对甜菜夜蛾进行选择性拒食率和拒食中浓度测定，方法同实施例2步骤1.2对斜纹夜蛾选择性试验方法，用以下公式计算选择性拒食率，根据卵孢菌素浓度和拒食率线性关系计算拒食中浓度。

选择性拒食率(％)＝(阴性对照组取食量－实验组取食量)/(阴性对照组取食量+实验组取食量)×100％

3、结果

卵孢菌素对斜纹夜蛾和甜菜夜蛾的拒食效果分别见图1和图2。

不同浓度的卵孢菌素对斜纹夜蛾和甜菜夜蛾的拒食的拒食率和拒食中浓度结果如表1、表2、表3所示。

表1卵孢菌素对斜纹夜蛾的拒食率

注：选择性实验回归方程：y＝0.0099x+21.219，r²＝0.9237；非选择性实验回归方程：y＝0.0144x+29.561，r²＝0.8901

表2卵孢菌素对甜菜夜蛾的拒食率

注：选择性实验回归方程：y＝0.0148x+27.188，r²＝0.9561；非选择性实验回归方程：y＝0.0103x+28.827；r²＝0.9375

表3卵孢菌素对斜纹夜蛾、甜菜夜蛾的拒食中浓度

从图1、图2可以看出：卵孢菌素对斜纹夜蛾和甜菜夜蛾具有明显的拒食效果。从表1～3的结果可知：卵孢菌素对斜纹夜蛾或甜菜夜蛾拒食率均随浓度升高而提高。当卵孢菌素浓度为312.5～5000ppm时，对斜纹夜蛾的拒食效果较好，选择性拒食率达30.9％～68.52％，非选择性拒食率达39.43％～94.72％；当卵孢菌素浓度为2000～4000ppm时，对甜菜夜蛾的拒食效果较好，选择性拒食率达64.89％～82.93％，非选择性拒食率达52.77％～67.97％。卵孢菌素对斜纹夜蛾的选择性和非选择性拒食中浓度分别为2907.17、1419.38ppm，对甜菜夜蛾的选择性和非选择性拒食中浓度分别为1541.35ppm、2055.63ppm。

综合所述，卵孢菌素对农作物害虫斜纹夜蛾和甜菜夜蛾具有较好的拒食活性，表明卵孢菌素具有较好的防止害虫危害作用，具有良好的应用开发前景。因此，本发明为研究与开发新的防虫农药提供了候选农药，为虫生真菌在害虫生物防治上的应用提供科学依据。