因此，培养的人肝细胞 代表了用于评价药物代谢和药物毒性的生理学相关模型。为获得肝细胞，从肝脏组织分离 所述细胞并随后利用冷冻保存来存放。
[0020] 本发明的其他方面之一是从不同个体收集肝细胞。这些肝细胞从已获准肝移植但 因缺乏合适受者而尚未使用的肝脏组织。在美国，有若干机构，例如，先进医药国际研宄会 (HAM)和国家发展研宄院（NDRI)专门负责将人肝脏分配至研宄实验室。
[0021] 肝细胞被贮存在冷冻保存库中，所述冷冻保存的细胞可后续被解冻用于实验。已 知在肝细胞性质（由其是药物代谢能力）上存在本质个体差异。为能够产生代表"标准化 的"人群的结果，采用来自多个个体的肝细胞（汇集的肝细胞）的混合物。传统操作包括使 先前冷冻保存的来自个体供者的肝细胞解冻，稀释以使冷冻保存毒性最小化，离心以收集 肝细胞，密度梯度分离活力和非活力细胞/细胞碎片，使纯化的细胞在冷冻保存物中悬浮， 在冷冻用小瓶中分配，和重新冷冻保存。因为多重稀释和离心步骤，这些步骤是耗时且费力 的。
[0022] 本发明提供用于制备冷冻保存的汇集的人肝细胞的新方法。采用该新方法，使个 体的冷冻保存的人肝细胞解冻、汇集、分配至冷冻用小瓶中，并重新冷冻保存。避免了多重 离心步骤、密度梯度和新冷冻保存物的应用。
[0023] 用于制备汇集的冷冻保存的来自多个个体的人肝细胞的方法示于图1并进行如 下操作：
[0024] 1.通过浸在维持于37°C下的水浴内的水中，使来自多个个体患者的冷冻保存人 肝细胞的小瓶解冻。一旦冰晶消失，即将小瓶置于维持在4°C的冰浴中。
[0025] 2.通过将肝细胞从小瓶移出并置入维持在4°C冰浴中的玻璃烧杯内来将所述肝 细胞重新合并（汇集）。
[0026] 3.采用移液器将重新分配的汇集的肝细胞吸入多个小瓶用于第二次冷冻保存。不 进行离心或细胞纯化。
[0027] 4.汇集的肝细胞的小瓶冷冻保存在可程序控制冰箱中以恒定速率冷冻，具体以 约-1°C /分钟降温直至达到合适的低温，具体为约-70°C或更低。采用合适设备，具体是液 氮冷冻贮存系统，使冷冻保存的细胞在合适温度（具体是约_150°C或更低）下贮存。
[0028] 对于采用所述冷冻保存的汇集的肝细胞的实验而言，将各小瓶肝细胞移出液氮冷 冻贮存环境，在37 °C水浴解冻，并在50mL冷冻保存肝细胞回收培养基（CHRM ;马里兰州哥伦 比亚的APSciences公司）中以IOOx g离心10分钟。所得沉淀可重悬并用于实验。
[0029] 实施例
[0030] 1.使分离并冷冻保存的来自六个个体的人肝细胞在水浴中解冻直至冰晶消失并 立即放置于维持在约4°c的冰浴中。采用控制速率冰箱以约-1度/分钟的程序降至-90°c 将解冻的肝细胞冷冻保存第二段时间。将肝细胞在液氮中贮存7天。使来自初始冷冻 保存和第二次冷冻保存的肝细胞在37°C水浴中解冻，通过冷冻保存肝细胞回收培养基 (APSciences公司）离心回收，重悬于培养基中，并通过台盼蓝拒染法测定活力。观察到以 下结果：
[0031]
【主权项】
1. 一种制备冷冻保存的人肝细胞而无需离心的方法，所述人肝细胞由来自多个个体的 肝细胞组成，所述方法包括： 在针对多个个体各自分开的器皿内冷冻保存肝细胞悬液中来自所述多个个体的肝脏 的肝细胞； 使所述来自多个个体的肝细胞的器皿在37°C水浴中解冻直至所述肝细胞悬液达到约 4°C的温度，仅至所述肝细胞悬液中的冰晶刚刚消失为止； 将多个器皿的来自多个个体的肝细胞汇集在一个容器中，其中所述肝细胞悬液维持约 4°C的温度； 将汇集的肝细胞分配进入多个器皿；和 将汇集的肝细胞的多个器皿冷冻保存而无需稀释或更换所述肝细胞悬液。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝细胞悬液包含冷冻保护剂。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述冷冻保护剂包含Dulbecco改良型伊格 尔培养基：补充有1〇%胎牛血清和1〇%二甲亚砜（〇1^0)的营养混合物？-12(01^11/^12)培 养基。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝细胞的冷冻保存包括以约-rc/分 钟的速率冷冻保存所述肝细胞至约-70°C。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在冷冻贮存系统中贮存所 述冷冻保存的汇集的肝细胞。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述肝细胞的贮存包括在约-150°C或更低 的温度下贮存。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从多个个体的肝脏分离肝 细胞。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括解冻所述冷冻保存的汇集 的肝细胞用于实验。
【专利摘要】描述了使冷冻保存的人肝细胞解冻并将所述肝细胞第二次冷冻保存而不损失活力的方法。其允许通过如下方式制备冷冻保存的汇集自多个供者的人肝细胞：使获自多个个体供者的肝细胞解冻，合并所述细胞形成汇集的肝细胞，和将所述汇集的肝细胞重新冷冻保存。该方法涉及使来自多个个体供者的肝细胞解冻，使该解冻的肝细胞维持在高于冷冻温度的低温下(例如，4℃)，并重新冷冻所述解冻的细胞而无需其它操作。所述方法允许所述人肝细胞在解冻后第二次冷冻保存，其活力与单次冷冻保存后相似。该高效方法可用于制备高活力的汇集的人肝细胞以用于使个体差异最小化的实验。
【IPC分类】A01N1-02, C12N5-071
【公开号】CN104797134
【申请号】CN201380060122
【发明人】阿尔伯特·P·李
【申请人】阿尔伯特·P·李
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2013年9月17日
【公告号】US9078430, US20150072423, US20150259643, WO2014045202A2, WO2014045202A3