专利名称：获得天然芳香族羧酸、脂肪族羧酸和硫代羧酸的发酵方法及其所用微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过用醇氧化酶把相应的酶促氧化来以非常高的产率制备不同羧酸的生物方法。醇氧化酶是由葡糖杆菌属(Gluconobacter)细菌、优选葡糖杆菌sp.HR 101(DSM 12884)形成的。因此，例如苯甲酸是用苯甲醇制得的，丁酸是用正丁醇制得的，异丁酸是用异丁醇制得的，异戊酸是用异戊醇制得的，2-甲基丁酸是用2-甲基丁醇制得的，3-甲基硫代丙酸是用3-甲基硫代丙醇制得的，苯乙酸是用苯乙醇制得的，丙酸是用丙醇制得的，肉桂酸是用肉桂醇制得的。
除了通过用醋杆菌属(Acetobacter)细菌将乙醇氧化成乙酸来制备醋的长久以来就已知的方法外，还有几种用醋杆菌属或葡糖杆菌属细菌或酵母来制备几种羧酸的方法。
例如，DE 3713668描述了通过用玫瑰葡糖杆菌(Gluconobacterroseus)种细菌将脂肪醇通过微生物氧化来制备脂肪族羧酸的方法。在该方法中，24小时以上的生长期之后，把醇直接加到具有微生物的培养基中。所指出的优选pH范围是4-4.5。仅获得了正丁酸13g/l、异丁酸21g/l、2-甲基丁酸7g/l和3-甲基丁酸17g/l发酵溶液的低产量。
DE 19503598描述了制备丙酸或丁酸或其盐的方法。其中使用了氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)细菌。培养9-10小时后，将正丙醇或正丁醇作为pO2值的函数分多次重复加入。通过该方法，所获得的产量是正丙酸43.7g/l和丁酸49g/l。
EP 0563346描述了通过用糖酵母属(Saccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、或克鲁维氏酵母属(Kluyvermyces)酵母菌将相应的醇或醛氧化来制备羧酸的方法。该方法的缺点是，使用这些酵母菌，仅能获得低的产物浓度，必须采用非常高的生物质浓度和长的处理时间。例如，4天后，仅获得了不到0.6g/l 3-甲基硫代丙酸，并且要使0.01％异戊醇转化90％，需要6天。
J.Chem.Tech.Biotechnol.1997，68，214-218描述了使用乙酸醋杆菌(Acetobacter aceti)细菌将几种脂肪醇和2-苯基乙醇生物转化成相应的酸。该方法的缺点也是获得的产物浓度很低。例如，其中描述，对于将丁醇氧化成丁酸，60分钟后获得的最大产物浓度是39.3g/l。
J.Chem.Tech.Biotechnol.1997，70，294-298描述了巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)用于氧化制备一些羧酸。该方法的缺点是需要使用注气生物反应器，因为充气和将培养物充分混合所需的高气流会导致挥发性原料和产物遗失。出于该原因而在下游连接的含液氮冷阱在工业规模上是不实用的。
我们已经发明了在生物反应器中制备脂肪族羧酸、芳香族羧酸和硫代羧酸的方法，其特征在于，使用含有葡糖杆菌属细菌的培养物。
令人惊奇的是，通过使用新的葡糖杆菌属微生物，不仅能以非常高的产率制得脂肪族羧酸，而且也能以非常高的产率制得芳香族羧酸和硫代羧酸。这不仅可从溶液中产物浓度、原料的摩尔转化百分比、还能从时空产率获得认证。其中，除了培养基组成和维持在pH6.4的pH以外，对于本发明方法特别重要的参数是连续加入底物的方式。
用于本发明方法的优选细菌是葡糖杆菌sp.HR 101(DSM12884)。
优选在纯培养物中使用细菌。
依据本发明使用的生物合适营养培养基是合成、半合成或复合培养基。这些培养基可含有含碳和含氮化合物、无机盐、以及任选含有微量元素和维生素。
合适的含碳化合物是碳水化合物、碳氢化合物、或标准有机化学品。可优选使用的化合物的实例是糖、醇、糖醇、有机酸或复合混合物。
糖优选为葡萄糖。可优选使用的有机酸是柠檬酸或乙酸。复合混合物包括例如麦芽汁、酵母浸出物、酪蛋白或酪蛋白水解产物。
合适的含氮底物是无机化合物。其实例是硝酸盐和铵盐。也可使用有机含氮源。有机含氮源包括酵母浸出物、大豆粉、酪蛋白、棉籽粉、酪蛋白水解产物、小麦麸质和玉米浆。
可使用的无机盐的实例是硫酸盐、硝酸盐、氯化物、碳酸盐和磷酸盐。在所述盐中优选存在的金属是钠、钾、镁、锰、钙、锌和铁。
培养温度优选为10-40℃。更优选为20-35℃。
培养基的pH优选为4-8。更优选为6.2-6.5。
原则上讲，可使用本领域技术人员已知的所有生物反应器来实施本发明方法。优选使用适于浸没处理的任意装置。这表示，根据本发明，可使用具有或不具有机械混合装置的容器。不具有机械混合装置的容器的实例包括震动器、和鼓泡塔反应器或环流反应器。具有机械混合装置的容器优选包括装配有任意设计搅拌器的所有已知器具。
本发明方法可连续或间歇进行。获得最大量产物所需的发酵时间取决于所用的微生物的具体性质。然而，大体来说，发酵时间为2-200小时。
可用本发明方法制备的脂肪族羧酸是丁酸、异丁酸、异戊酸、2-甲基丁酸和丙酸。
可用本发明方法制备的芳香族羧酸是苯甲酸、苯乙酸和肉桂酸。
可用本发明方法制备的硫代羧酸是3-甲基硫代丙酸。
根据本发明方法，优选制备得到丁酸、异丁酸、异戊酸、2-甲基丁酸、丙酸、苯乙酸和3-甲基硫代丙酸。
根据本发明方法，特别优选制备得到异丁酸、异戊酸、2-甲基丁酸和苯乙酸。
通过下述实施例更详细地举例说明本发明。
实施例实施例1-制备预培养物用由1.25g D-甘露糖醇和0.75g酵母浸出物组成且pH为6.5的100ml无菌培养基和0.9ml葡糖杆菌sp.HR 101(DSM 12884)的甘油培养基给具有挡板的500ml锥形瓶接种。将该锥形瓶在旋转震动器上于30℃和140rpm转速下培养16小时。该预培养物中的微生物数目是约2×109CFU/ml。
实施例2-由天然正丁醇制备天然正丁酸在10升发酵器中将125g甘露糖醇和75g酵母浸出物溶于9.91水中，加入10ml止泡剂，将pH调节至6.3。将由此制备的培养基在121℃灭菌30分钟。
搅拌器速度为500rpm；充气速度为5升/分钟；温度为30℃。将所有这些参数设定完毕后，使用实施例1预培养物进行接种。
发酵17小时后，开始通过泵加入正丁醇。通过流量控制器控制该底物的计量加入。依据下表加入正丁醇表1 在进料期间，用NH4+将pH恒定地维持在6.2-6.4。
74小时后发酵完成。通过HPLC分析测定的正丁酸的终浓度为95g/l。摩尔转化率为刚好低于90％。
实施例3-由天然异丁醇制备天然异丁酸在10升发酵器中将125g甘露糖醇和75g酵母浸出物溶于9.9升水中，加入10ml止泡剂，将pH调节至6.3。将由此制备的培养基在121℃灭菌30分钟。
搅拌器速度为500rpm；充气速度为5升/分钟；温度为30℃。将所有这些参数设定完毕后，使用实施例1预培养物进行接种。
发酵22.5小时后，开始通过泵加入异丁醇。通过流量控制器控制该底物的计量加入。依据下表加入异丁醇表2 在进料期间，用NH4+将pH恒定地维持在6.2-6.4。
74小时后发酵完成。通过HPLC分析测定的异丁酸的终浓度为92.7g/l。摩尔转化率为刚好低于88％。
实施例4-由天然2-甲基丁醇制备天然2-甲基丁酸在10升发酵器中将125g甘露糖醇和75g酵母浸出物溶于9.9升水中，加入10ml止泡剂，将pH调节至6.3。将由此制备的培养基在121℃灭菌30分钟。
搅拌器速度为500rpm；充气速度为5升/分钟；温度为30℃。将所有这些参数设定完毕后，使用实施例1预培养物进行接种。
发酵17小时后，开始通过泵加入2-甲基丁醇。通过流量控制器控制该底物的计量加入。依据下表加入2-甲基丁醇
表3 在进料期间，用NH4+将pH恒定地维持在6.2-6.4。
通过HPLC分析测定的2-甲基丁酸的终浓度为80g/l。摩尔转化率为刚好低于89％。
实施例5-由天然异戊醇制备天然异戊酸在10升发酵器中将125g甘露糖醇和75g酵母浸出物溶于9.9升水中，加入10ml止泡剂，将pH调节至6.3。将由此制备的培养基在121℃灭菌30分钟。
搅拌器速度为500rpm；充气速度为5升/分钟；温度为30℃。将所有这些参数设定完毕后，使用实施例1预培养物进行接种。
发酵17小时后，开始通过泵加入异戊醇。通过流量控制器控制该底物的计量加入。依据下表加入异戊醇
表4 在进料期间，用NH4+将pH恒定地维持在6.2-6.4。
70.5小时后发酵完成。将发酵溶液后处理后，异戊酸的终浓度为82g/l。摩尔转化率为刚好低于85％。
实施例6-由天然正丙醇制备天然丙酸在10升发酵器中将125g甘露糖醇和75g酵母浸出物溶于9.9升水中，加入10ml止泡剂，将pH调节至6.3。将由此制备的培养基在121℃灭菌30分钟。
搅拌器速度为500rpm；充气速度为51/分钟；温度为30℃。将所有这些参数设定完毕后，使用实施例1预培养物进行接种。
发酵17小时后，开始通过泵加入正丙醇。通过流量控制器控制该底物的计量加入。依据下表加入正丙醇
表5 在进料期间，用NH4+将pH恒定地维持在6.2-6.4。
92小时后发酵完成。通过HPLC分析测定的丙酸的终浓度为94g/l。摩尔转化率为88.3％。
实施例7-由天然苯乙醇制备天然苯乙酸在10升发酵器中将125g甘露糖醇和75g酵母浸出物溶于9.9升水中，加入10ml止泡剂，将pH调节至6.3。将由此制备的培养基在121℃灭菌30分钟。
搅拌器速度为500rpm；充气速度为5升/分钟；温度为30℃。将所有这些参数设定完毕后，使用实施例1预培养物进行接种。
发酵17小时后，开始通过泵加入苯乙醇。通过流量控制器控制该底物的计量加入。依据下表加入苯乙醇
表6 在进料期间，用NH4+将pH恒定地维持在6.2-6.4。
48小时后达到最大产物浓度。通过HPLC分析测定的苯乙酸的终浓度为54g/l。摩尔转化率为88.5％。
以200升规模重复该操作，获得了52g/l的产物浓度；摩尔转化率为95％。
实施例8-由苯甲醇制备天然苯甲酸在10升发酵器中将125g甘露糖醇和75g酵母浸出物溶于9.9升水中，加入10ml止泡剂，将pH调节至6.3。将由此制备的培养基在121℃灭菌30分钟。
搅拌器速度为500rpm；充气速度为5升/分钟；温度为30℃。将所有这些参数设定完毕后，使用实施例1预培养物进行接种。
发酵21.25小时后，开始通过泵加入苯甲醇。通过流量控制器控制该底物的计量加入。依据下表加入苯甲醇表7 在进料期间，用NH4+将pH恒定地维持在6.2-6.4。
68小时后发酵完成。通过HPLC分析测定的苯甲酸的终浓度为51g/l。事实上所有原料都转化了。
实施例9-由肉桂醇制备天然肉桂酸在10升发酵器中将125g甘露糖醇和75g酵母浸出物溶于9.9升水中，加入10ml止泡剂，将pH调节至6.3。将由此制备的培养基在121℃灭菌30分钟。
搅拌器速度为500rpm；充气速度为5升/分钟；温度为30℃。将所有这些参数设定完毕后，使用实施例1预培养物进行接种。
发酵17小时后，开始通过泵加入肉桂醇。为了使肉桂醇在液相中，将原料加热。依据下表加入肉桂醇
表8 44小时后发酵完成。通过HPLC分析测定的肉桂酸的终浓度为27g/l。事实上所有原料都转化了。
实施例10-由3-甲基硫代丙醇制备天然3-甲基硫代丙酸在10升发酵器中将125g甘露糖醇和75g酵母浸出物溶于10升水中，加入10ml止泡剂，将pH调节至6.3。将由此制备的培养基在121℃灭菌30分钟。
搅拌器速度为500rpm；充气速度为5升/分钟；温度为27℃。将所有这些参数设定完毕后，使用实施例1预培养物进行接种。
发酵16小时后，开始通过泵加入3-甲基硫代丙醇。依据下表计量加入底物
表9 在进料期间，用NH4+将pH恒定地维持在6.2-6.4。
65小时后发酵完成。通过HPLC分析测定的3-甲基硫代丙酸的终浓度为82.6 g/l。摩尔转化率几乎为100％。
实施例12-比较本发明方法与现有技术方法的时空产率在下述实施例(表9)中，为了证实本发明方法的优越性，比较使用葡糖杆菌sp.DSM 12884的新制备方法与已知方法的时空产率。表10
如表10所示，在已经描述过的醇氧化中依据本发明使用葡糖杆菌属sp.DSM 12884使得时空产率和绝对产物浓度都有很大增加。例如，对于丁酸，本发明方法(测试No.5)与现有技术方法的最佳结果(测试No.4)相比，时空产率提高了94％，产物浓度提高了58％。对于丙酸，时空产率提高了52％，产物浓度提高了57％。对于异丁酸，提高的幅度甚至更大，时空产率提高了150％，产物浓度提高了341％。对于异戊酸和2-甲基丁酸，二者的时空产率与产物浓度分别提高了132％和82％、与214％和82％。
虽然为了举例说明，上文已经详细地描述了本发明，但是应当理解，这种详细说明仅是为了举例说明本发明，本领域技术人员在不背离本发明实质和范围的情况下可作出各种改变，本发明保护范围由权利要求书限定。
权利要求
1．在生物反应器中制备脂肪族羧酸、芳香族羧酸和硫代羧酸的方法，其中将包含葡糖杆菌属细菌的培养物与营养培养基反应。
2．权利要求1的方法，其中使用由葡糖杆菌属细菌组成的纯培养物。
3．权利要求2的方法，其中所述葡糖杆菌属细菌是葡糖杆菌sp.HR 101(DSM 12884)。
4．权利要求1-3任一项的方法，其中所述营养培养基包含合成、半合成或复合底物。
5．权利要求1-4任一项的方法，其中所述底物选自含碳和含氮化合物、无机盐、微量元素和/或维生素或它们的混合物。
6．权利要求5的方法，其中所述含碳化合物选自糖、糖醇、醇、有机酸、复合混合物、油、或两种或两种以上这些物质的混合物。
7．权利要求6的方法，其中所述底物选自葡萄糖、甘油、甘露糖醇、柠檬酸、麦芽汁、酵母浸出物、酪蛋白、酪蛋白水解产物和蓖麻油或两种或两种以上这些物质的混合物。
8．权利要求1-7任一项的方法，其中所述底物包含无机化合物和/或有机化合物。
9．权利要求8的方法，其中所述底物选自硝酸盐、铵盐、酵母浸出物、大豆粉、棉籽粉、酪蛋白、酪蛋白水解产物、小麦麸质和玉米浆。
10．权利要求1-9任一项的方法，其中所述底物选自金属钠、钾、镁、锰、钙、锌和铁的硫酸盐、硝酸盐、氯化物、碳酸盐和磷酸盐或者两种或多种这些化合物的混合物。
11．权利要求1-10任一项的方法，其中所述营养培养基的培养温度为10-40℃。
12．权利要求1-11任一项的方法，其中所述营养培养基的pH为4-8。
13．称为葡糖杆菌sp.HR 101(DSM 12884)的菌株。
14．权利要求1的方法，其中所述底物的摩尔转化率大于60％。
15．权利要求1的方法，其中所述酸是脂肪酸。
16．权利要求15的方法，其中所述酸是天然丁酸。
17．权利要求15的方法，其中所述酸是异丁酸。
18．权利要求1-12任一项的方法，其中所述酸是异戊酸。
19．权利要求1-12任一项的方法，其中所述酸是2-甲基丁酸。
20．权利要求1-12任一项的方法，其中所述酸是丙酸。
21．权利要求1-12任一项的方法，其中所述酸是异戊酸。
22．权利要求1-12任一项的方法，其中所述酸是芳香族酸。
23．权利要求1-12任一项的方法，其中所述酸是苯甲酸。
24．权利要求1-12任一项的方法，其中所述酸是苯乙酸。
25．权利要求1-12任一项的方法，其中所述酸是肉桂酸。
26．权利要求1-12任一项的方法，其中所述酸是硫代羧酸。
27．权利要求1-12任一项的方法，其中所述酸是3-甲基硫代丙酸。
28．权利要求16-27任一项的方法，其中使用包含葡糖杆菌属细菌的细菌。
29．权利要求16-27任一项的方法，其中使用由葡糖杆菌属细菌组成的纯培养物。
30．权利要求16-27任一项的方法，其中所述属细菌是葡糖杆菌sp.HR 101(DSM 12884)。
全文摘要
本发明涉及制备脂肪族羧酸、芳香族羧酸、和硫代羧酸的方法,其中使用包含葡糖杆菌属细菌的培养物。
文档编号C12R1/01GK1286307SQ0012605
公开日2001年3月7日 申请日期2000年8月25日 优先权日1999年8月25日
发明者J·拉本霍尔斯特, I·L·加特菲尔德, J·M·希尔默 申请人:哈尔曼及赖默股份有限公司