专利名称：一种固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的方法
技术领域：
本发明涉及一种固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株(Bucillus Subtilis sp.)的方法，确切说，涉及一种通过固体发酵过程批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株1#、2#、3#和4#的方法，属生物材料培养技术领域。
背景技术：
水产养殖池的池水主要受到二种污染大量人类生活污水，如人畜粪尿、洗涤水等排入河、湖，使河、湖水中含有大量氨氮和硝基氮以及有机物，上述池水汲自河、湖，该池水中也含有大量氨氮和硝基氮以及有机物；上述池水还受到喂养水产品的残存饲料和水产品排泄物的污染，污染物所含的大分子有机化合物造成水体的富营养化和有毒藻类及细菌大量繁殖。上述二种污染导致水产品，如鱼、虾、蟹生病死亡。
众所周知，在自然界的土壤、干草等中有一类枯草芽孢杆菌。该类杆菌既能分解残存饲料和水产排泄物的大分子有机物，又能转化水产养殖池池水中的氨氮和硝基氮。尤其是从该杆菌中优选出的四株变异菌株(Bucillus Subtilis sp.)枯草芽孢杆菌变异菌株1#、2#、3#和4#，更有生命力强，繁殖快的优点。上述变异菌株显然是理想的制备复合型活菌生物净水剂的菌种来源。本发明人在申请号和发明名称分别为01112787.2和“一种枯草芽孢杆菌变异菌株的批量培养方法”的发明专利申请中提出通过液体发酵过程批量培养上述变异菌株的方法，利用该法能制备大量上述变异菌株，即枯草芽孢杆菌变异菌株1#、2#、3#和4#的湿菌体，为批量生产复合型活菌生物净水剂奠定了基础。但该法仍有以下缺点收获上述的湿菌体时需用专门的高速离心机，设备投资大；在收获湿菌体后的废液中，仍有大量的活菌未被分离出来，即湿菌体得率损失较大，致使生产成本上升；收获湿菌体后的废液处理难，排入环境会造成新的污染。
发明内容
本发明要解决的技术问题是推出一种通过固体发酵过程批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的方法。利用该方法培养上述变异菌株时，在收获上述变异菌株枯草芽孢杆菌变异菌株1#、2#、3#和4#的湿菌体时，不需要高速离心机；湿菌体得率高；整个发酵过程不产生废液，不存在废液排放和环境污染的问题。
本发明通过采用以下技术方案解决上述技术问题一种固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的方法，其特征在于，操作步骤第1步配制固体培养基，按该培养基的重量百分比配方，黄豆并粉2～60％、玉米并粉2～60％、米糠2～40％、麸皮2～40％、硫酸铵0.4％和氯化铵0.2％，称取固体原料，将硫酸铵和氯化铵溶于重量为固体原料总重量的30～40％的水中，再与其余固体原料混和，搅拌均匀，均分为四份，分别投入四个固体发酵罐，制成相同的固体培养基四罐；第2步灭菌，在压力、温度和发酵罐转速分别为1.05～1.3kg/cm2、121～125℃和6～60rph，即转/小时的条件下，对四罐固体培养基进行高压灭菌处理，处理时间为30～60分钟；第3步接种培养，罐温降至40～50℃时，在发酵罐旋转的情况下，向每罐喷入重量为每罐中固体原料重量的30～40％的无菌水，当罐温降至30～40℃时，将预先经二级培养成的处于对数生长期的枯草芽孢杆菌变异菌株1#、2#、3#4#的细菌种子分别接入上二步所述的四个发酵罐，每罐的接种量为每罐固体原料重量的2～3％，在罐压、通风量、发酵罐转速和罐温分别为0.2～0.8kg/cm2、1600～2000L/h、6～60rph和30～40℃的条件下，对四罐变异菌株连续发酵培养20～50小时；第4步收获活菌，经上步处理，上述变异菌株大量繁殖，从四个发酵罐分别收获大量枯草芽孢杆菌变异菌株1#、2#、3#和4#的湿菌体，每种湿菌体的重量大致与投入每罐内固体原料和水的重量相等，每克湿菌体含活菌数20亿～50亿个。
与背景技术相比，本发明具有以下突出效果1.每罐收获的湿菌体的重量大致与投入每罐中的固体原料和水的重量相等，不仅湿菌体得率高，而且湿菌体不需要专门的离心机就能收集到，有助于大幅度减少设备投资。
2.收获的活菌数多，如用500L液体培养罐采用液体培养法培养，仅能获得湿菌体30～35kg，如改用本发明的方法培养，收获湿菌体以210kg计，那末用本发明的方法培养，收获的湿菌体约是液体培养法的6～7倍；3.发酵培养过程不产生废液，无废液排放和环境污染问题。
具体实施例方式
实施例1。一种固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的方法，其特征在于，操作步骤第1步配制固体培养基，为四个容量为500L的固体发酵罐配制固体培养基，向每罐投入重量为120kg的固体原料，其中黄豆并粉36kg、玉米粉36kg、米糠24kg、麸皮23.28kg、硫酸铵0.48kg和氯化铵0.24kg，将硫酸铵和氯化铵溶于42kg的水，注入每罐，搅拌均匀，配制成相同的固体培养基四罐；第2步灭菌，在压力、温度和发酵罐转速分别为1.3kg/cm2、125℃和60rph条件下，对四罐固体培养基进行高压灭菌处理，处理时间为55分钟；第3步接种培养，罐温降至40℃时，在发酵罐旋转的情况下，向每罐喷入42kg的无菌水，当罐温降至37℃时，将预先经二级培养成的处于对数生长期的枯草芽孢杆菌变异菌株1#、2#、3#和4#的细菌种子分别接入上二步所述的四个发酵罐，每罐的接种量为3kg，在罐压、通风量、发酵罐转速和罐温分别为0.7kg/cm2、2000L/h、60rph和37℃的条件下，对四罐变异菌株连续发酵培养48小时；第4步收获活菌，经上步处理后，上述变异菌株大量繁殖，从四个发酵罐分别收获枯草芽孢菌变异菌株1#、2#、3#和4#的湿菌体210kg，每克湿菌体含活菌数20亿～50亿个。
实施例2。一种固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的方法，其特征在于，操作步骤第1步配制固体培养基，为四个容量为500L的固体发酵罐配制固体培养基，向每罐投入重量为60kg的固体原料，其中黄豆并粉3kg、玉米粉33kg、米糠20.64kg、麸皮3kg、硫酸铵0.24kg和氯化铵0.12kg，将硫酸铵和氯化铵溶于19.2kg的水，注入每罐，搅拌均匀，配制成相同的固体培养基四罐；第2步灭菌，在压力、温度和发酵罐转速分别为1.05kg/cm2、121℃和6rph条件下，对四罐固体培养基进行高压灭菌处理，处理时间为35分钟；
第3步接种培养，罐温降至40℃时，在发酵罐旋转的情况下，向每罐喷入19.2kg的无菌水，当罐温降至37℃时，将预先经二级培养成的处于对数生长期的枯草芽孢杆菌变异菌株1#、2#、3#和4#的细菌种子分别接入上二步所述的四个发酵罐，每罐的接种量为1.2kg，在罐压、通风量、发酵罐转速和罐温分别为0.3kg/cm2、1600L/h、6rph和37℃的条件下，对四罐变异菌株连续发酵培养24小时；第4步收获活菌，经上步处理后，上述变异菌株大量繁殖，从四个发酵罐分别收获枯草芽孢菌变异菌株1#、2#、3#和4#的湿菌体100kg，每克湿菌体含活菌数20亿～50亿个。
实施例3。一种固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的方法，其特征在于，操作步骤第1步配制固体培养基，为四个容量为500L的固体发酵罐配制固体培养基，向每罐投入重量为90kg的固体原料，其中黄豆并粉4.5kg、玉米粉49.5kg、米糠4.5kg、麸皮30.96kg、硫酸铵0.36kg和氯化铵0.18kg，将硫酸铵和氯化铵溶于28.8kg的水，注入每罐，搅拌均匀，配制成相同的固体培养基四罐；第2步灭菌，在压力、温度和发酵罐转速分别为1.05kg/cm2、121℃和30rph条件下，对四罐固体培养基进行高压灭菌处理，处理时间为40分钟；第3步接种培养，罐温降至40℃时，在发酵罐旋转的情况下，向每罐喷入28.8kg的无菌水，当罐温降至37℃时，将预先经二级培养成的处于对数生长期的枯草芽孢杆菌变异菌株1#、2#、3#和4#的细菌种子分别接入上二步所述的四个发酵罐，每罐的接种量为2.7kg，在罐压、通风量、发酵罐转速和罐温分别为0.5kg/cm2、1800L/h、30rph和37℃的条件下，对四罐变异菌株连续发酵培养36小时；第4步收获活菌，经上步处理后，上述变异菌株大量繁殖，从四个发酵罐分别收获枯草芽孢菌变异菌株1#、2#、3#和4#的湿菌体150kg，每克湿菌体含活菌数20亿～50亿个。
实施例4。一种固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的方法，其特征在于，操作步骤第1步配制固体培养基，为四个容量为500L的固体发酵罐配制固体培养基，向每罐投入重量为60kg的固体原料，其中黄豆并粉33kg、玉米粉3kg、米糠20.64kg、麸皮3kg、硫酸铵0.24kg和氯化铵0.12kg，将硫酸铵和氯化铵溶于22.8kg的水，注入每罐，搅拌均匀，配制成相同的固体培养基四罐；第2步灭菌，在压力、温度和发酵罐转速分别为1.3kg/cm2、125℃和6rph条件下，对四罐固体培养基进行高压灭菌处理，处理时间为35分钟；第3步接种培养，罐温降至40℃时，在发酵罐旋转的情况下，向每罐喷入22.8kg的无菌水，当罐温降至37℃时，将预先经二级培养成的处于对数生长期的枯草芽孢杆菌变异菌株1#、2#、3#和4#的细菌种子分别接入上二步所述的四个发酵罐，每罐的接种量为1.2kg，在罐压、通风量、发酵罐转速和罐温分别为0.3kg/cm2、1600L/h、6rph和37℃的条件下，对四罐变异菌株连续发酵培养24小时；第4步收获活菌，经上步处理后，上述变异菌株大量繁殖，从四个发酵罐分别收获枯草芽孢菌变异菌株1#、2#、3#和4#的湿菌体107kg，每克湿菌体含活菌数20亿～50亿个。
实施例5。一种固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的方法，其特征在于，操作步骤第1步配制固体培养基，为四个容量为500L的固体发酵罐配制固体培养基，向每罐投入重量为90kg的固体原料，其中黄豆并粉49.5kg、玉米粉4.5kg、米糠4.5kg、麸皮30.96kg、硫酸铵0.36kg和氯化铵0.18kg，将硫酸铵和氯化铵溶于34.2kg的水，注入每罐，搅拌均匀，配制成相同的固体培养基四罐；第2步灭菌，在压力、温度和发酵罐转速分别为1.3kg/cm2、125℃和30rph条件下，对四罐固体培养基进行高压灭菌处理，处理时间为40分钟；第3步接种培养，罐温降至40℃时，在发酵罐旋转的情况下，向每罐喷入34.2kg的无菌水，当罐温降至37℃时，将预先经二级培养成的处于对数生长期的枯草芽孢杆菌变异菌株1#、2#、3#和4#的细菌种子分别接入上二步所述的四个发酵罐，每罐的接种量为2.7kg，在罐压、通风量、发酵罐转速和罐温分别为0.5kg/cm2、1800L/h、30rph和37℃的条件下，对四罐变异菌株连续发酵培养36小时；第4步收获活菌，经上步处理后，上述变异菌株大量繁殖，从四个发酵罐分别收获枯草芽孢菌变异菌株1#、2#、3#和4#的湿菌体161kg，每克湿菌体含活菌数20亿～50亿个。
本发明特别适于用来批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株1#、2#、3#和4#的湿菌体，为工业化生产复合型活菌生物净水剂提供活菌原料，是一项能促进水产养殖的、能产生巨大经济效益的和便于推广使用的新技术。
权利要求
1.一种固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的方法，其特征在于，操作步骤第1步配制固体培养基，按该培养基的重量百分比配方，黄豆并粉2～60％、玉米并粉2～60％、米糠2～40％、麸皮2～40％、硫酸铵0.4％和氯化铵0.2％，称取固体原料，将硫酸铵和氯化铵溶于重量为固体原料总重量的30～40％的水中，再与其余固体原料混和，搅拌均匀，均分为四份，分别投入四个固体发酵罐，制成相同的固体培养基四罐；第2步灭菌，在压力、温度和发酵罐转速分别为1.05～1.3kg/cm2、121～125℃和6～60rph，即转/小时的条件下，对四罐固体培养基进行高压灭菌处理，处理时间为30～60分钟；第3步接种培养，罐温降至40～50℃时，在发酵罐旋转的情况下，向每罐喷入重量为每罐中固体原料重量的30～40％的无菌水，当罐温降至30～40℃时，将预先经二级培养成的处于对数生长期的枯草芽孢杆菌变异菌株1#、2#、3#和4#的细菌种子分别接入上二步所述的四个发酵罐，每罐的接种量为每罐固体原料重量的2～3％，在罐压、通风量、发酵罐转速和罐温分别为0.2～0.8kg/cm2、1600～2000L/h、6～60rph和30～40℃的条件下，对四罐变异菌株连续发酵培养20～50小时；第4步收获活菌，经上步处理，上述变异菌株大量繁殖，从四个发酵罐分别收获大量枯草芽孢杆菌变异菌株1#、2#、3#和4#的湿菌体，每种湿菌体的重量大致与投入每罐内固体原料和水的重量相等，每克湿菌体含活菌数20亿～50亿个。
2.根据权利要求1所述的固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的方法，其特征在于，操作步骤第1步配制固体培养基，为四个容量为500L的固体发酵罐配制固体培养基，向每罐投入重量为120kg的固体原料，其中黄豆并粉36kg、玉米粉36kg、米糠24kg、麸皮23.28kg、硫酸铵0.48kg和氯化铵0.24kg，将硫酸铵和氯化铵溶于42kg的水，注入每罐，搅拌均匀，配制成相同的固体培养基四罐；第2步灭菌，在压力、温度和发酵罐转速分别为1.3kg/cm2、125℃和60rph条件下，对四罐固体培养基进行高压灭菌处理，处理时间为55分钟；第3步接种培养，罐温降至40℃时，在发酵罐旋转的情况下，向每罐喷42kg的无菌水，当罐温降至37℃时，将预先经二级培养成的处于对数生长期的枯草芽孢杆菌变异菌株1#、2#、3#和4#的细菌种子分别接入上二步所述的四个发酵罐，每罐的接种量为3kg，在罐压、通风量、发酵罐转速和罐温分别为0.7kg/cm2、2000L/h、60rph和37℃的条件下，对四罐变异菌株连续发酵培养48小时；第4步收获活菌，经上步处理后，上述变异菌株大量繁殖，从四个发酵罐分别收获枯草芽孢菌变异菌株1#、2#、3#和4#的湿菌体210kg，每克湿菌体含活菌数20亿～50亿个。
3.根据权利要求1所述的固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的方法，其特征在于，操作步骤第1步配制固体培养基，为四个容量为500L的固体发酵罐配制固体培养基，向每罐投入重量为60kg的固体原料，其中黄豆并粉3kg、玉米粉33kg、米糠20.64kg、麸皮3kg、硫酸铵0.24kg和氯化铵0.12kg，将硫酸铵和氯化铵溶于19.2kg的水，注入每罐，搅拌均匀，配制成相同的固体培养基四罐；第2步灭菌，在压力、温度和发酵罐转速分别为1.05kg/cm2、121℃和6rph条件下，对四罐固体培养基进行高压灭菌处理，处理时间为35分钟；第3步接种培养，罐温降至40℃时，在发酵罐旋转的情况下，向每罐喷入19.2kg的无菌水，当罐温降至37℃时，将预先经二级培养成的处于对数生长期的枯草芽孢杆菌变异菌株1#、2#、3#和4#的细菌种子分别接入上二步所述的四个发酵罐，每罐的接种量为1.2kg，在罐压、通风量、发酵罐转速和罐温分别为0.3kg/cm2、1600L/h、6rph和37℃的条件下，对四罐变异菌株连续发酵培养24小时；第4步收获活菌，经上步处理后，上述变异菌株大量繁殖，从四个发酵罐分别收获枯草芽孢菌变异菌株1#、2#、3#和4#的湿菌体100kg，每克湿菌体含活菌数20亿～50亿个。
4.根据权利要求1所述的固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的方法，其特征在于，操作步骤第1步配制固体培养基，为四个容量为500L的固体发酵罐配制固体培养基，向每罐投入重量为90kg的固体原料，其中黄豆并粉4.5kg、玉米粉49.5kg、米糠4.5kg、麸皮30.96kg、硫酸铵0.36kg和氯化铵0.18kg，将硫酸铵和氯化铵溶于28.8kg的水，注入每罐，搅拌均匀，配制成相同的固体培养基四罐；第2步灭菌，在压力、温度和发酵罐转速分别为1.05kg/cm2、121℃和30rph条件下，对四罐固体培养基进行高压灭菌处理，处理时间为40分钟；第3步接种培养，罐温降至40℃时，在发酵罐旋转的情况下，向每罐喷入28.8kg的无菌水，当罐温降至37℃时，将预先经二级培养成的处于对数生长期的枯草芽孢杆菌变异菌株1#、2#、3#和4#的细菌种子分别接入上二步所述的四个发酵罐，每罐的接种量为2.7kg，在罐压、通风量、发酵罐转速和罐温分别为0.5kg/cm2、1800L/h、30rph和37℃的条件下，对四罐变异菌株连续发酵培养36小时；第4步收获活菌，经上步处理后，上述变异菌株大量繁殖，从四个发酵罐分别收获枯草芽孢菌变异菌株1#、2#、3#和4#的湿菌体150kg，每克湿菌体含活菌数20亿～50亿个。
5.根据权利要求1所述的固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的方法，其特征在于，操作步骤第1步配制固体培养基，为四个容量为500L的固体发酵罐配制固体培养基，向每罐投入重量为60kg的固体原料，其中黄豆并粉33kg、玉米粉3kg、米糠20.64kg、麸皮3kg、硫酸铵0.24kg和氯化铵0.12kg，将硫酸铵和氯化铵溶于22.8kg的水，注入每罐，搅拌均匀，配制成相同的固体培养基四罐；第2步灭菌，在压力、温度和发酵罐转速分别为1.3kg/cm2、125℃和6rph条件下，对四罐固体培养基进行高压灭菌处理，处理时间为35分钟；第3步接种培养，罐温降至40℃时，在发酵罐旋转的情况下，向每罐喷入22.8kg的无菌水，当罐温降至37℃时，将预先经二级培养成的处于对数生长期的枯草芽孢杆菌变异菌株1#、2#、3#和4#的细菌种子分别接入上二步所述的四个发酵罐，每罐的接种量为1.2kg，在罐压、通风量、发酵罐转速和罐温分别为0.3kg/cm2、1600L/h、6rph和37℃的条件下，对四罐变异菌株连续发酵培养24小时；第4步收获活菌，经上步处理后，上述变异菌株大量繁殖，从四个发酵罐分别收获枯草芽孢菌变异菌株1#、2#、3#和4#的湿菌体107kg，每克湿菌体含活菌数20亿～50亿个。
6.根据权利要求1所述的固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的方法，其特征在于，操作步骤第1步配制固体培养基，为四个容量为500L的固体发酵罐配制固体培养基，向每罐投入重量为90kg的固体原料，其中黄豆并粉49.5kg、玉米粉4.5kg、米糠4.5kg、麸皮30.96kg、硫酸铵0.36kg和氯化铵0.18kg，将硫酸铵和氯化铵溶于34.2kg的水，注入每罐，搅拌均匀，配制成相同的固体培养基四罐；第2步灭菌，在压力、温度和发酵罐转速分别为1.3kg/cm2、125℃和30rph条件下，对四罐固体培养基进行高压灭菌处理，处理时间为40分钟；第3步接种培养，罐温降至40℃时，在发酵罐旋转的情况下，向每罐喷入34.2kg的无菌水，当罐温降至37℃时，将预先经二级培养成的处于对数生长期的枯草芽孢杆菌变异菌株1#、2#、3#和4#的细菌种子分别接入上二步所述的四个发酵罐，每罐的接种量为2.7kg，在罐压、通风量、发酵罐转速和罐温分别为0.5kg/cm2、1800L/h、30rph和37℃的条件下，对四罐变异菌株连续发酵培养36小时；第4步收获活菌，经上步处理后，上述变异菌株大量繁殖，从四个发酵罐分别收获枯草芽孢菌变异菌株1#、2#、3#和4#的湿菌体161kg，每克湿菌体含活菌数20亿～50亿个。
全文摘要
一种固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的方法，属生物材料培养技术领域，操作包括配制固体培养基、灭菌、接种培养，收获活菌四个步骤，有收集湿菌体不需专门的离心机，即设备投资低、收获的活菌数多和无废液排放和环境污染问题的优点，适于用来批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的湿菌体，为工业化生产复合型活菌生物净水剂提供活菌原料，是一项能促进水产养殖的新技术。
文档编号C12N1/20GK1412296SQ01126980
公开日2003年4月23日 申请日期2001年10月9日 优先权日2001年10月9日
发明者吴自荣, 郭大磊, 黄静 申请人:华东师范大学, 昆山科新环境生物工程有限公司