专利名称：9m－阴性ehv突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及马疱疹病毒(Equine Herpes Viruses，EHV)，其中蛋白gM基本缺失或其中gM被修饰，并且其免疫调节能力无功能。本发明进一步的方面涉及编码所述病毒的核酸，包含这些病毒或核酸的药物组合物及其用途。本发明也涉及增强由EHV疫苗所诱发的抗野生型EHV感染的免疫应答的方法，涉及EHV感染的预防和治疗方法以及将野生型EHV感染的动物与用本发明EHV处理的动物区分的方法。
背景技术：
马疱疹病毒1(EHV-1)是α-疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)的一个成员，是马的病毒诱导性流产的主要原因，并能引起呼吸和神经病症。EHV-1毒株Ab4p的完整DNA序列已被确定(Telford，E.A.R.等，1992)；然而，仅确定有少数几个基因和基因产物与EHV的毒性相关。
采用了两种不同的方式以控制EHV-1的感染。首先，开发了经修饰的活疫苗(MLVs)，包括在欧洲和美国广泛使用的病毒株RacH(Mayr，A.等，1968；Hubert，P.H.等，1996)。其次，评估灭活疫苗和独立表达的病毒糖蛋白的免疫原性和保护潜能。用重组杆状病毒表达的糖蛋白中，糖蛋白(g)B，C，D和H在鼠模型中诱导对后续EHV-1攻击的部分保护(Awan，A.R.等，1990；Tewari，D.等，1994；Osterrieder，N.等，1995；Strokes，A.等，1996)。然而，使用MLVs比灭活疫苗和亚单位疫苗更有优势。MLVs对于诱导细胞介导的免疫应答是高效的，而细胞介导的免疫应答最有可能提供抗疾病的保护(Allen，G.P.等，1995；Mumford，J.A.等，1995)。
疱疹病毒糖蛋白主要涉及感染的早期，病毒粒子从细胞中的释放，以及通过相邻细胞间融合导致的病毒粒子的直接细胞到细胞传播。目前已确立了11种单纯疱疹病毒1型(HSV-1)编码的糖蛋白，定名为gB，gC，gD，gE，gG，gH，gI，gJ，gK，gL，和gM。缺乏gC，gE，gG，gI，gJ和gM的HSV-1突变体是具活性的，显示这些基因对培养细胞的复制是非必需的。HSV-1和马疱疹病毒1的核苷酸序列对比表明，所有已知的HSV-1糖蛋白在EHV-1中都是保守的。根据目前的命名法，这些糖蛋白都根据其HSV-1同系物定名。已知EHV-1的gC，gE，和gI不是细胞培养物生长所必需的，而gB和gD对于病毒在培养细胞中的生长是必需的。其他EHV-1糖蛋白对于病毒在培养细胞中复制的作用仍未知(Flowers，C.C.等，1992)。利用λgt11表达文库和抗纯化EHV-1的单克隆抗体(MAbs)对EHV-1的六种包膜糖蛋白进行作图(Allen，G.P.等，1987)。此外，转录分析和蛋白分析表明糖蛋白gB，gC，gD，gG，gH和gK在EHV-1感染的细胞中表达。糖蛋白gM是最近被详细分析的HSV-1糖蛋白(由基因UL10编码，Braines，J.D.等，1991；Baines，J.D.等，1993)。其是被报道的唯一的在所有疱疹病毒亚科中都保守的非必需糖蛋白，对人和鼠巨细胞病毒以及γ-疱疹病毒亚科(Gammaherpesvirinae)成员EHV-2，herpesvirus saimiri，和Epstein-Barr病毒中的这种糖蛋白已有描述。如同许多疱疹病毒糖蛋白一样，HSV-1的gM存在于病毒粒子和被感染细胞的膜中。只缺少gM的HSV-1突变体的效价比野生型病毒效价降低约10倍，并且在鼠模型中表现出毒性降低(Baines，J.D.等，1991；MacLean，C.A.等，1993)。EHV-1的gM同系物(gp21/22a；从现在起作为EHV-1 gM)最初由Allen和Yeargan说明(Allen，G.P.等，1987)，证明是一种病毒包膜的主要组分。进一步的研究表明基因52，即与HSV-1 UL10同源的基因，编码450个氨基酸的EHV-1 gM多肽(Pilling，A.等，1994；Telford，E.A.R.等，1992)。EHV-1 gM代表一种多疏水蛋白，其包含8个预期的跨膜结构域，并有报道表明其作为Mr45000蛋白存在于感染的细胞和纯化的病毒粒子中(Pilling，A.等，1994；Telford，E.A.R.等，1992)。
1996年Osterrieder等将大肠杆菌lac Z基因插入到EHV-1毒株RacL11的gM基因(开放阅读框52)中，把带有这种基因的病毒突变体(L11ΔgM)的穿透特性与亲本EHV-1 RacL11的穿透特性相比，从实验中得出结论EHV-1gM对于病毒穿透进入靶细胞以及所述病毒在细胞到细胞的传播有重要作用。1997年，Neubauer等通过对被免疫小鼠脾脏中的病毒中和抗体和EHV-1特异性T细胞的检验，表明上述EHV-1的gM插入突变体是减毒的，并诱导保护性免疫。
本发明要解决的技术问题是提供新的修饰的马疱疹病毒，当用于预防和治疗EHV感染时，所述马疱疹病毒表现显著增强的免疫原性。
发明公开对于上述技术问题的解答通过权利要求中定义的说明和实施方案实现。
我们惊讶地发现如果蛋白gM基本缺失或所述蛋白被修饰，从而使其本可能具有的免疫调节能力无功能，则对于马疱疹病毒的保护性免疫力会有显著的增强。因此，这是首次表明蛋白gM调节EHV的免疫原性。有意思的是，先前讨论的病毒突变体L11ΔgM和HΔgM-Ins也诱导亲本毒株RacL11和RacH的免疫原性。尽管Osterrieder等，1996和Neubauer等，1997的作者没有用当时可得的抗体检测HΔgM-Ins病毒的gM，但HΔgM-Ins突变体仍表现与产生gM的亲本毒株相似的免疫调节潜能。其原因可能是，尽管在公开的实验中Western印迹证明了lacZ的插入，但HΔgM-Ins中gM的残留部分得以表达。因此gM的这一残留部分一定与gM的免疫调节活动有关。因此，本发明首次提供了一种EHV，其蛋白gM基本缺失或所述蛋白被修饰，从而其在病毒宿主中的免疫调节能力无功能。
一个方面，本发明涉及马疱疹病毒，其中蛋白gM基本缺失。
另一个同样重要的方面，本发明涉及马疱疹病毒，其中所述蛋白被修饰并且无功能。
此处所用术语“基本缺失”是因为相邻必需蛋白UL9同系物基因(基因53)的位置，其方向以及与编码gM蛋白的基因的重叠，因此需要保留最短的gM基因的核苷酸序列以使基因53能够表达，从而保留病毒活性。一个优选的实施方案涉及EHV，其中gM基因的至少70％缺失，而一个更优选的实施方案中对一种EHV要求了权利，其中gM基因的至少80％缺失，而一个更优选的实施方案中对一种EHV要求了权利，其中gM基因的至少90％缺失。
术语“无功能”蛋白gM应被理解是所述蛋白相关于病毒-宿主间相互作用的免疫调节力。本发明的EHV与其他表达功能性gM的EHV毒株间免疫原性的差异，可通过兽医病毒学现有领域普通专家可得的标准动物模型进行确定。确定EHV表达功能性或非功能性gM的一个可能方法在实施例1中给出。所述方法提供了一种精确并且直接的实验方案，用于确定修饰的目的EHV毒株与其他毒株之间免疫调节能力的差异，所述其他毒株与目的毒株相比，差异仅在于其他毒株表达完整的未修饰的功能性gM蛋白。实施例1中所述方法特别合适，因为在BALB/c小鼠中EHV毒株的行为与天然宿主中单个病毒的相一致(Mayr，A.等，1968；van Woensel，P.A.M.等，1995；Colle，C.F.等，1996；Hubert，P.H.等，1996；Matsumura，T.等，1996)。
对于从EHV中缺失蛋白gM或使其无功能，可有多种方法(Sambrook，J.等，1989)。非限制性例子包括在编码蛋白gM的基因中的缺失、突变或插入。所述病毒中相应的完整或部分核苷酸序列的缺失可能导致gM蛋白的完全缺失或无功能表达。通过在该基因或其调节区域中突变核苷酸序列或插入额外的核苷酸，也可获得同样的结果。在上述两个方面的一个优选实施方案中，本发明涉及EHV，其根据本发明在编码蛋白gM的基因中因缺失、突变或插入而改变。
gM ORF与UL9 ORF和启动子序列重叠(位置94389到97052，Ori结合蛋白，Telford等，1992)。由UL9 ORF编码的蛋白对于病毒生长是必需的，如在HSV-1中例示(Carmichael等，1988；Malik等，1992)。因此，一个更优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的EHV，其特征在于编码蛋白gM的基因被缺失或修饰，并且编码UL9同系物的基因(基因53)的表达不受影响。术语“不受影响”并不涉及UL9的特定数量或质量特征，而仅仅指该基因的表达不受影响，只要病毒表达所述蛋白，并且所述蛋白以对于病毒活性基本足够的量存在。
本发明公开了一种实施本发明最优选的EHV，其中病毒株EHV-1 Ab4p的核苷酸93254到94264(Telford，E.A.R等，1992)或其他毒株中相应位置被缺失，其中的核苷酸编号仅为举例。共有1352个核苷酸的gM ORF上这1010个核苷酸的缺失，导致任何可检测的gM多肽的基本缺失。这种gM基因核苷酸的几乎完全缺失仍然产生活病毒，所述活病毒基本不表达gM蛋白衍生物，因此所有其他EHV-1基因的表达不受影响。这种部分的缺失不影响UL9 ORF的表达。
上述核苷酸的位置参照Telford等，1992(GenBank/EMBL数据库(接入号M86664))针对EHV-1毒株Ab4p的编号。这些核苷酸位置决不仅限于Ab4pEHV-1毒株中定义的确切位置，而只以举例的方式用来指出在这些位置的核苷酸或其他EHV毒株中相应于gM基因这些位置的核苷酸。对于不同的EHV病毒，优选核酸的位置编号可能有所不同，但对于α-疱疹病毒科的病毒分子生物学领域专家可通过其相对于所述序列的其他核苷酸的位置，容易地识别这些优选的核苷酸。与gM基因相邻的基因的功能性表达对于病毒的活性是重要的。
根据本发明最优选的EHV毒株是EHV-1毒株HΔgM-3b1，其保藏在ECACC(欧洲细胞培养物保藏中心，Salisbury，UK)，保藏号99101536。
本发明特别适用于EHV的1型和4型，因为这二者亲源关系极近(Telford，E.A.R.等，1992和1998)。
本发明的EHV特别适用于基因治疗，适用于携带一般性的异源物质，尤其适合于携带外源抗原用于活疫苗(对于EHV作为异源载体，参见EP507179，WO 9827216，WO 9400587，WO 9827216)。当本发明的EHV在动物中表达异源物质时，对于与gM相关的免疫特性没有影响。将针对其它病原体具有相关免疫特性的相应核苷酸序列插入本发明EHV病毒的基因组后，该抗原被表达时，EHV特别适用于针对所述其他病原体进行免疫。疱疹病毒载体疫苗属于现有技术(参见Schmitt，J.等，1999；Peeters，B.等，1997，Yoloyama等，1998)。因此，在优选实施方案中本发明也涉及携有一或多种异源基因的本发明EHV。
本发明另一方面也涉及编码本发明EHV的核酸。所述核酸适用于进一步改变EHV或用于重组产生本发明的EHV。它们也可用于产生基于核酸的疫苗。
由于表达修饰的无功能gM或根本不表达gM的EHV具有增强的免疫特性，本发明的EHV特别适合作为预防和治疗EHV感染的药物组合物的活性成分。因此，另一方面，本发明涉及包含本发明EHV的药物组合物。
本发明的核苷酸也可用于制备DNA载体疫苗。这些疫苗中，核苷酸直接给予动物或通过除起始病毒以外的其他载体间接给予。核苷酸疫苗和载体疫苗是现有技术中众所周知的，因此不进一步地详述。
一个实施方案中，本发明涉及一种包含本发明核酸的药物组合物。本发明还涉及一种包含本发明EHV的药物组合物。
包含本发明EHV的药物组合物一个非限制性实例可通过以下方法制备将感染的细胞培养物上清与一种稳定剂(如亚精胺和/或BSA(牛血清白蛋白))混合，接着通过其他方法使该混合物冻干或脱水。接种之前，所述混合物在水相(如盐水，PBS(磷酸缓冲盐溶液))或非水相溶液(如油乳液，基于铝的佐剂)中重新水合。
EHV和其核苷酸特别适合用于制备药物组合物。
“药物组合物”基本上包含一种或多种下述成分，所述成分可修饰用其给药的生物，或在其表面内或表面上生活但不受制于抗生素或抗寄生虫剂的生物的生理功能(如免疫功能)，还包含用于其它目的的其他组分，所述目的例如但不限于，加工特性，无菌性(sterility)，稳定性，通过胃肠或胃肠外途径(如口服、鼻内、静脉、肌内、皮下、经皮或其他适当的途径)给药的便利性，给药后的耐受性，控释特性。
其他实施方案中，本发明涉及增强马疱疹病毒疫苗所诱导的抗野生型病毒感染的免疫应答的方法，其特征在于所述疫苗包含本发明的马疱疹病毒。
另一方面涉及一种预防和/或治疗动物的方法，其特征在于本发明的一种药物组合物被给予所述动物。
现有EHV活疫苗的另一方面是其与野生型病毒区分的能力。本发明的EHV至少在一个重要的特性上不同于野生型分离株。其提供一种显著改变的gM蛋白。gM基本缺失或者被修饰到一定程度，使得该特异性抗原靶与野生型病毒的gM显著不同。
一个优选实施方案涉及区分野生型马疱疹病毒感染的动物和用本发明修饰的马疱疹病毒处理的动物的方法，其特征在于确认病毒野毒株的gM蛋白或在修饰病毒中表达的gM蛋白或所述蛋白的基本缺失。
一个更优选的实施方案涉及上述提及的方法，其特征在于a)目的样品被加入一种分离的gM或其经修饰的衍生物中，b)加入特异于所述分离的gM或其经修饰的衍生物的抗体，c)确定所述抗体的结合。
一种更优选的实施方案涉及区分野生型马疱疹病毒感染的动物和用本发明改变的马疱疹病毒处理的动物的方法，其特征在于确认编码病毒野毒株的gM蛋白的核酸与编码修饰的gM蛋白的核酸或所述核酸的缺失之间的差异。
本发明另一个方面涉及试剂盒，所述试剂盒可实施区分野生型马疱疹病毒感染的动物和本发明改变的马疱疹病毒处理的动物的优选方法。一个方便使用的试剂盒优选包含一种或多种必需的分析工具，缓冲液，标记和解读工具，溶剂以及机械装置。优选的特异性分析工具是分离的野生型蛋白gM，分离的修饰蛋白gM，特异于野生型蛋白gM的抗体，特异于分离的修饰蛋白gM的抗体，以及与编码野生型蛋白gM的核苷酸结合的核苷酸特异性探针和与编码修饰蛋白gM的核苷酸结合的核苷酸特异性探针。
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图1平均体重分析图1是平均体重分析，以相对于感染攻击当天组的平均体重的百分比表示。
HΔgM-3b1免疫组(第7到9组)与其他所有的免疫组比较，以分析该病毒与其他两种病毒相比的潜在优势，因为该病毒的糖蛋白M基本上完全的缺失(氨基酸70到406被缺失)，而对于HΔgM-Ins(第4到6组)，gM开放阅读框因LacZ盒的插入而被破坏。然而，这种病毒突变体仍能表达gM开放阅读框的羧基末端部分(可能开始于226位的甲硫氨酸残基)。RacH(组1到组3)是HΔgM-3b1和HΔgM-Ins的亲本病毒，代表一种广泛使用的疫苗株。
接种了HΔgM-3b1的动物在以103PFU接种的小鼠(第9组)中，与接种103PFU HΔgM-Ins(第6组)或103PFU RacH(第3组)相比，有最低的暂时体重下降。与接种HΔgM-Ins(第4-6组)或RacH(第1-3组)相比，接种HΔgM-3b1的组(第7-9组)预防攻击后体重降低的剂量依赖性降低。
图2病毒效价分析对每组中感染后(p.i.)1天的2只动物、感染后3天的3只动物、和感染后5天的2只动物进行尸检。制备鼠肺，用海沙匀浆，用1ml的DMEM-10％FCS重悬。通过Neubauer等，1997年所述的噬斑试验确定肺匀浆物中的病毒效价。数据表明用HΔgM-3b1免疫后(第7-9组)，从肺组织(每个肺单独制备，每个肺的平均病毒效价如图所示)中重新分离的EHV病毒的量，与HΔgM-Ins(第4-6组)或RacH(第1-3组)免疫的组相比，是降低的。这种效果在各种病毒各自的最低接种剂量(103PFU)比较高接种剂量(104或105PFU)时更强烈。与HΔgM-Ins或RacH免疫的小鼠相比，病毒血症的持续时间也缩短，表现为5天后从HΔgM-3b1免疫的动物中重新分离的病毒量显著降低，特别是在用103PFU剂量接种的组中。
图3Western印迹分析利用抗gB单克隆抗体3F6(Allen和Yeargan，由Dr.G.Allen，Lexington，Ky，U.S.A.惠赠)(A)或抗gM单克隆抗体A8(由Dr.R.A.Killington，Leeds，UK惠赠)(B)对被感染细胞的裂解物进行Western印迹分析。将细胞裂解物悬浮在样品缓冲液中，并立即用SDS-10％-PAGE分离。将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，与单抗一同孵育，如材料和方法一节所述进行检测。1泳道RacH感染的细胞；2泳道HΔgM-Ins(插入突变体)感染的细胞；3泳道HΔgM-3b1感染的细胞；4泳道用HΔgM-3b1在Rk13细胞中生长的第二代感染的细胞。A组中，被RacH，HΔgM-Ins和HΔgM-3b1感染的细胞中gB的特异性识别清楚地表明感染细胞中病毒蛋白的表达和病毒的复制。gB的二聚体和寡聚体清晰可见，表明进行了适当的糖蛋白加工。B组中，单克隆抗体A8识别RacH感染的细胞中具有预期表观分子量的gM蛋白(1泳道)。HΔgM-Ins中，开放阅读框因插入LacZ基因而被中断。相应地，被特异性识别的gM蛋白的表观分子量更低(2泳道)。HΔgM-Ins表达的gM蛋白的Western印迹信号强度与在RacH感染的细胞中获得的信号相当，这清楚地表明这种截短并不能导致gM蛋白在感染细胞中表达的失败或所述蛋白的立即降解。此外，gM的羧基末端部分似乎在HΔgM-Ins的情况下表达，因为A8抗体直接靶向gM羧基末端的亲水部分。在3和4泳道，如上所述在HΔgM-3b1中缺失相应核苷酸序列后并未如预期那样检测出gM蛋白。
材料和方法(Western印迹分析)Western印迹分析中，感染细胞的裂解物用BCATM分析(Pierce)调整到相同的蛋白浓度，悬浮于样品缓冲液(终浓度50mM Tris-Cl，pH6.8；3.2％十二烷基磺酸钠(SDS)；5％2-巯基乙醇；10％甘油)中。整个过程中都将样品放置在冰上，不能受热。通过不连续的SDS-10％-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(Laemmli，1970)分离蛋白，通过半干法(Kyhse-Andersen，1984)转移到硝酸纤维素膜(Schleicher & Schull)上。转膜后，将膜温育于10％脱脂乳的磷酸缓冲盐溶液(含0.05％ Tween20，PBS-T))中，4℃ C 16小时。室温(RT)下用PBS-T洗膜两次，每次10分钟，接着以在PBS-T中指定的稀释度加入抗gB单克隆抗体(mab)3F6(Allen和Yeargan，1987)或抗gM mab A8(Day，1999)，硝酸纤维素膜与单克隆抗体在室温下温育1小时，然后用PBS-T洗膜两次(室温，10分钟)。用过氧化物酶偶联的抗小鼠免疫球蛋白G抗体(Sigma)，按照供应商的说明，在室温下作用1小时以检测结合的单克隆抗体。两次最后的洗膜步骤(PBS-T，10分钟)后，通过增强的化学发光(ECLTM，Amersham-Pharmacia)按照供应商的说明使反应性条带可见。
图4HΔgM-3b1基因组的图示EHV-1 RacH病毒的gM区的BamHI限制性酶切图谱和基因组组构(organization)，以及gM阴性RacH病毒HΔgM-3b1的结构。给出了克隆中使用的限制性酶切位点，并且是按比例的。
实施例实施例1检测gM对于病毒免疫原性的影响实验设计将3-4周龄BALB/c小鼠(Charles River)随机分为10组，各组包含14只动物，鼻内(i.n.)分别免疫接种RacH(第1到第3组)，gM阴性插入突变体HΔgM-Ins(Neubauer等，1997)(第4到第6组)或缺少几乎整个gM开放阅读框的HΔgM3b1病毒(第7到第9组)。小鼠被一次性给予20μl溶液进行免疫，所述溶液中分别含有1×105噬斑形成单位(PFU)(第1，4，7组)，1×104PFU(第2，5，8组)，或1×103PFU(第3，6，9组)，如所示。用20μl的DMEM-10％FCS对小鼠进行模拟物感染(第10组)。免疫29天后，用悬浮于20μl溶液中的1×104PFU的RacL11毒株鼻内感染小鼠。从感染当天(0天)到第13天，每日对各小鼠的体重进行评分。根据以下公式计算第0天到第13天的相对体重(以％表示)第n天的体重/第0天的体重×100％。感染后(p.i.)第一天的2只动物、感染后第3天的3只动物、和感染后第5天的2只动物进行尸检。制备鼠肺，用海沙匀浆，用1ml的DMEM-10％FCS(Meindl & Osterrieder，1999)重悬。鼠肺中的病毒效价在Rk13细胞中测定(Neubauer等，1997)。如下所述对每日记录的体重进行统计学分析。
研究目的本研究的主要目的是表明HΔgM-3b1免疫(第7-9组)与RacH(第1-3组)或HΔgM-Ins(第4-6组)免疫相比，保护潜力的差异，这种比较是通过用毒性EHV-1株感染攻击后的体重参数来确定的。第二个目的是将第1到9组与模拟物感染的组(组10)进行比较。HΔgM-3b1免疫的组(第7-9组)与所有其他免疫组进行比较，以分析这种病毒与其他两种病毒相比的有利效果，因为这种病毒的糖蛋白M几乎完全缺失，而对于HΔgM-Ins(第4-6组)，gM开放阅读框仅因为LacZ盒的插入而被中断。然而，这种病毒突变体仍可表达gM开放阅读框的羧基末端部分。RaeH(第1-3组)是HΔgM-3b1和HΔgM-Ins二者的亲本病毒，并且代表一种广泛使用的疫苗株。
统计学方法使用SAS(Heidelberg)软件包Win Version 6.12在个人电脑上进行统计学分析。
为了评估初级终点，用SAS的PROC GLM重复方差分析，使用CONTRAST声明(statement)以便在选定组间进行针对性比较。为了将不平衡的情况考虑在内(在不同天数时动物的数量不同)，使用PROC GLM(概括性(Generalized)线性模式)替代PROC ANOVA。程序proc glm data＝maus.obser；class group；model coll--coll4＝group；repeated time 14(1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14)/summary；contrast′group 10 vs others′group -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -19；contrast′group 7 vs group 4′group 0 0 0 -1 0 0 1 0 00；contrast′group 7 vs group 1′group -1 0 0 0 0 0 1 0 00；contrast′group 8 vs group 2′group 0 -1 0 0 0 0 0 1 00；contrast′group 8 vs group 5′group 0 0 0 0 -1 0 0 1 00；contrast′group 9 vs group 3′group 0 0 -1 0 0 0 0 0 10；contrast′group 9 vs group 6′group 0 0 0 0 0 -1 0 0 10；means group/waller；run；quit；体重评估的结果
1、模拟物感染的动物(第10组)与免疫动物的对比下表证实，用模拟物免疫的动物的平均体重与所有其他的组相比，在攻击感染后有统计学上显著的降低(第3天)或统计学上极其显著的降低(第4到13天)。
表1
1＝检验统计2＝从第1天到第13天的统计；第0天时，所有计算都相同(重量设定为100％)*＝为统计学显著的(＜0.05)**＝为统计学上极其显著的(＜0.0001)2、HΔgM-3b1免疫的动物(第7组，105PFU/每只动物)与RacH(第1组，105PFU)和HΔgM-Ins(第4组，105PFU)免疫的动物，在感染攻击后阻止体重降低的效力参数方面的比较下表中给出的结果表明，无论免疫使用的是何种病毒，在高剂量病毒免疫的组中，平均体重没有统计学上显著的差异。
表2
1＝检验统计
2＝从第1天到第13天的统计；第0天时，所有计算都相同(重量设定为100％)*＝为统计学显著的(＜0.05)**＝为统计学上极其显著的(＜0.0001)3、HΔgM-3b1免疫的动物(第8组，104PFU/每只动物)与RacH(第2组，105PFU)和HΔgM-Ins(第5组，104PFU)免疫的动物，在感染攻击后阻止体重降低的效力参数方面的比较。下表显示了对接受104PFU/每只动物的小鼠组的统计学分析，显示第8组动物(104PFU HΔgM-3b1)和第5组动物(HΔgM-Ins)在第1天和第11到第13天，其平均体重的差异在统计学上显著。但RacH免疫的动物(第2组)与HΔgM-3b1免疫的动物(第8组)相比，在感染之后所有的天中，其平均体重差异都有显著或极其显著的降低。
表3
1＝检验统计2＝从第1天到第13天的统计；第0天时，所有计算都相同(重量设定为100％)*＝为统计学显著的(＜0.05)**＝为统计学上极其显著的(＜0.0001)4、HΔgM-3b1免疫的动物(第9组，103PFU/每只动物)与RacH(第3组，103PFU)和HΔgM-Ins(第6组，103PFU)免疫的动物，在感染攻击后阻止体重降低的效力参数方面的比较下表显示了用最低剂量免疫的结果。总结来说，接种最低剂量HΔgM-3b1的动物与接种相同剂量的HΔgM-Ins或RacH的动物相比，在第4天到第9天表现(极其)显著的较高平均体重。此外，在感染攻击后第1天到第3天，RacH免疫的动物与HΔgM-3b1免疫的动物相比，其体重有显著的降低。
表4
1＝检验统计2＝从第1天到第13天的统计；第0天时，所有计算都相同(重量设定为100％)*＝为统计学显著的(＜0.05)**＝为统计学上极其显著的(＜0.0001)
权利要求
1.一种马疱疹病毒，其中蛋白gM基本缺失。
2.一种马疱疹病毒，其中蛋白gM被修饰并且无功能。
3.一种权利要求1或2的马疱疹病毒，其特征是蛋白gM通过编码蛋白gM的基因中的缺失、突变或插入而被基本缺失或修饰。
4.权利要求1到3中任一项的马疱疹病毒，其特征是编码蛋白gM的基因被缺失或修饰，并且编码UL9同系物的基因(基因53)的表达未受到影响。
5.权利要求1到4中任一项的马疱疹病毒，其中病毒株EHV-1 Ab4p的核苷酸93254到94264或其他EHV毒株中相应区段被缺失，其中的核苷酸编号仅为举例。
6.马疱疹病毒HΔgM-3b1株，其保藏号为EACC 99101536。
7.权利要求1到6中任一项的马疱疹病毒，其中所述病毒是1型或4型马疱疹病毒。
8.权利要求1到7中任一项的马疱疹病毒，所述马疱疹病毒带有一个或多个异源基因。
9.一种核酸，其编码权利要求1到8中任一项的马疱疹病毒。
10.一种药物组合物，其包含权利要求1到8中任一项的马疱疹病毒。
11.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求9的核酸。
12.权利要求1到8中任一项的马疱疹病毒的用途，其用于制备一种药物组合物。
13.权利要求9的核酸的用途，其用于制备一种药物组合物。
14.一种方法，所述方法可增强马疱疹病毒疫苗所诱导的抗野生型感染的免疫应答，该方法的特征是所述疫苗包含权利要求1到7中任一项的马疱疹病毒。
15.一种预防和/或治疗动物的方法，所述方法的特征是给予所述动物以权利要求10或11的药物组合物。
16.一种方法，所述方法用于区分野生型马疱疹病毒感染的动物和权利要求1到7中任一项的经修饰的马疱疹病毒处理的动物，其特征是确认野生型病毒的蛋白gM或经修饰病毒中表达的蛋白gM或经修饰病毒中蛋白gM的基本缺失。
17.权利要求16的方法，其特征是a)目的样品被加入一种分离的gM或其修饰的衍生物中，b)加入特异于所述分离的gM蛋白或其修饰的衍生物的抗体，c)确定所述抗体的结合。
18.一种用来实施权利要求16和17的方法的试剂盒，其特征是所述试剂盒包含分离的蛋白gM或其分离的修饰衍生物和/或抗体，所述抗体或者特异于野生型gM蛋白或者特异于经修饰的蛋白gM。
19.一种方法，所述方法用于区分野生型马疱疹病毒感染的动物和权利要求1到7中任一项的修饰的马疱疹病毒处理的动物，其特征是确认编码病毒野毒株蛋白gM的核酸和编码经修饰的gM蛋白的核酸或其基本缺失之间的差异。
20.一种用于实施权利要求19的方法的试剂盒，其特征是所述试剂盒包含一或多种核苷酸序列特异性探针，所述探针或者结合编码野生型蛋白gM的核苷酸，或者结合编码经修饰的gM蛋白的核苷酸。
全文摘要
本发明涉及马疱疹病毒(Equine Herpes Viruses，EHV)，其中蛋白gM被基本缺失或修饰，并且其免疫调节能力无功能。本发明进一步的方面涉及编码所述病毒的核酸，包含这些病毒或核酸的药物组合物及其用途。本发明也涉及增强由EHV疫苗所诱发的抗野生型EHV感染的免疫应答的方法，涉及EHV感染的预防和治疗方法以及将野生型EHV感染的动物与用本发明EHV处理的动物区分的方法。
文档编号C12N7/01GK1400907SQ01805141
公开日2003年3月5日 申请日期2001年2月15日 优先权日2000年2月17日
发明者克里斯琴·西博尔特, 尼古劳斯·奥斯特里德, 克努特·埃尔伯斯 申请人:贝林格尔·英格海姆维特梅迪卡有限公司