专利名称：对外源基因进行正确分泌表达的多拷贝酵母表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酵母表达载体及其构建引物，特别是涉及一种对外源基因进行正确分泌表达的多拷贝酵母表达载体及其构建引物。
毕赤酵母表达系统包括胞内表达和分泌表达两种方式，其中分泌表达由于其表达量高，糖基化完全，二硫键和高级结构形成正确，尤其是后续分离纯化简单方便而备受青睐。蛋白的分泌表达需要有信号肽的参与。已经有包括某些外源蛋白自身的信号肽序列的若干种信号肽序列成功地用于外源蛋白的分泌表达，但其中最成功的是从酿酒酵母中分离得到的α因子的信号肽序列。
以下是信号肽α因子和多克隆位点的部分序列Xho I Kex2SnaB I EcoR IATG AGA TTT CCT … TCTCTC GAGAAA AGA↓GAG GCT GAA GCTTAC GTAGAA TTCCCT …Met Arg Phe Pro … Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala↑Glu Ala↑Tyr Val Glu Phe Pro …Ste13ATG为翻译起始密码子，Kex2负责信号肽的剪切，Glu-Ala-Glu-Ala重复序列并非Kex2剪切所必需，但其存在可以提高剪切效率；另一种蛋白酶Ste13可以继续对Glu-Ala-Glu-Ala重复序列进行剪切，但剪切往往并不完全。另外，至少还有两个氨基酸残基会留在表达蛋白的N端(Tyr和Val)。
由于上述原因，现有的酵母表达载体，对外源基因进行分泌表达时，表达蛋白往往存在着不正确的N端序列，这些多出的氨基酸残基会影响和改变所表达的蛋白的结构和功能(Goda S，Takano K，Yamagata Y，et al.Effect of extra N-terminal residueson the stability and folding of human lysozyme expressed in Pichia pastoris[J].Protein Eng，2000，13(4)299-307.)。
本发明所提供的一种多拷贝酵母表达载体，它的DNA序列为序列表中序列1的核苷酸序列。
本发明所提供的一种多拷贝酵母表达载体，含有大肠杆菌复制起点Col E1和氨苄青霉素及卡那霉素两个抗性基因，其中卡那霉素抗性基因可以使毕赤酵母对G418产生抗性，用于多拷贝插入的筛选。
本发明所提供的一种多拷贝酵母表达载体，以乙醇氧化酶基因的启动子(pAOX1)为诱导型启动子，受葡萄糖抑制，甲醇诱导后才开始转录、翻译，非常适合于外源基因的表达。
本发明的多拷贝酵母表达载体称为pMEX9K。
本发明的第二个目的是提供一种构建上述多拷贝酵母表达载体的专用引物。
本发明所提供的二对引物，它们是序列表中序列2、序列3和序列4、序列5的核苷酸序列。
利用本发明的载体，使外源蛋白N端第一个氨基酸紧连于Lys-Arg之后，外源蛋白能分泌表达正确，N端测序结果显示分泌表达的蛋白与天然蛋白结构一致。
图2为本发明表达载体的酶切鉴定。
图3-图9为外源基因(人ω-干扰素)在本发明表达载体pMEX9K分泌表达的重组蛋白的N端序列测定图
(3)以序列表中序列4和序列5为引物利用点突变试剂盒MutanBEST Kit对pGEMTXho进行突变以除去其中的Xho I酶切位点。操作按说明书进行。
(4)筛选并鉴定突变后的重组质粒pGEMTMuXho。
(5)用限制性内切酶Sma I和Sph I从重组质粒pGEMTMuXho切下突变的外源片段MuXho(0.6kb)，并连入同样用上述两种内切酶酶切pPIC9K后切胶回收的DNA片段(8.7kb)。
(6)转化大肠杆菌DH5α后，筛选阳性克隆pMEX9K并测序。测序结果表明序列是正确的。
实施例2、本发明表达载体的酶切鉴定如图2所示，经过限制性内切酶分析和序列测定证实载体构建正确，图中M1.DL15000 Marker；1.pPIC9K；2.pMEX9K；3.pPIC9K/Nae I；4.pPIC9K/Xho I；5.pMEX9K/Xho I；M2.DL2000 Marker。；转化大肠杆菌DH5α后，该载体使受体菌获得了氨苄青霉素及卡那霉素抗性，证实卡那霉素抗性基因功能正常。
实施例3、利用本发明载体使外源基因在毕赤酵母中正确分泌表达采用生物工程技术中的常规方法，利用本发明载体将外源基因人ω-干扰素(Interferonω)导入毕赤酵母中进行分泌表达，对表达的蛋白进行N端序列测定(利用PE公司的491蛋白序列分析仪，采用自动Edman降解法)，结果表明(图3)目的蛋白N端的前5个氨基酸残基，其序列为LGCDL，与天然蛋白N端氨基酸序列一致。
序列表<160>5<210>1<211>9276<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>序列号agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcgcca taccgtttgt 540cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt 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权利要求
1.一种多拷贝酵母表达载体，它的DNA序列为序列表中序列1的核苷酸序列。
2.构建权利要求1所述载体的二对引物，它们是序列表中序列2、序列3和序列4、序列5的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及一种酵母表达载体及其构建引物。本发明的目的是提供一种能够使外源基因在酵母中正确分泌表达的多拷贝酵母表达载体，它的DNA序列为序列表中序列1的核苷酸序列。本发明的第二个目的是提供二对构建上述表达载体的专用引物，它们是序列表中序列2、序列3和序列4、序列5的核苷酸序列。利用本发明的载体，将外源基因导入酵母中进行分泌表达，N端测序结果显示分泌表达的蛋白与天然蛋白结构一致。
文档编号C12N15/11GK1459507SQ0211790
公开日2003年12月3日 申请日期2002年5月20日 优先权日2002年5月20日
发明者陈薇, 齐连权, 于长明, 付玲, 来大志 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所