专利名称：抑制血管生成的化合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及海参共附生微生物发酵制备具有抑制血管生成作用的新的代谢产物 1 (4-乙酰基-5-羟基-3，6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮)以及化合物2 (4-乙酰基-5-甲氧 基-3，6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮)的制备及其抑制血管生成的用途。海洋微生物次级代谢产物的研究引起了越来越多的注意。海洋高盐、高压、贫营 养或者少光照等特殊的生态环境，造就了海洋生物的多样性和特殊性，其海洋微生物的种 类多达100余万种。据John教授2007年在《Natural ProductsR印ort》报道，2006年和 2007年对比1965-2005年，海洋微生物有了个非常大的增长。目前各国已经从海洋细菌、放 线菌、真菌等微生物中分离得到多种活性物质，并具有强烈的生物活性，例如抗菌、抗肿瘤、 抗病毒等，其中有些已经进入了临床研究。已有文献报道具有二氢苯并呋喃结构的化合物 具有抑制肿瘤血管生成的作用。某些苯并呋喃类化合物具有良好的抑制HUVEC (人脐带静 脉内皮细胞)增殖活性，而且对抑制内皮细胞增殖具有很好的选择性。肿瘤特别是恶性实体瘤是人类头号杀手。研究一直血管生成类抗肿瘤药物引起了 人们越来越多的重视。与大、小鼠等模式生物一样，近年来斑马鱼(Daniorerio)也逐渐被 用作人类疾病动物模型。其胚胎在发育Mh时，体节间血管开始由背动脉出芽形成于相邻 体节之间。此血管生成模式与肿瘤新生血管形成模式相近，因此斑马鱼胚胎可作为抑制血 管生成类抗肿瘤药物的评价模型。
发明内容
本发明涉及一种利用微生物发酵制备一种新的代谢产物1 (4-乙酰基-5-羟基-3， 6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮)以及化合物2 (4-乙酰基-5-甲氧基-3，6，7-三甲基苯并呋 喃-2-酮)的制备工艺、结构以及抑制血管生成的药理活性。本发明从海参的共附生微生物的发酵培养物中提取分离得到一种抑制血管生成 的化合物1和2，他是通式为
权利要求
1. 一种抑制血管生成的化合物，其特征是它是通式为
2.根据权利要求1所述的抑制血管生成的化合物，其特征是4-乙酰基-5-羟基-3，6， 7-三甲基苯并呋喃-2-酮的物化参数是Mp 113—115°C ；1H NMR 2. 31 (s)，2. 24 (s)，2. 21 (s)，1. 57 (d, 6) ,4. 3 (q, 7. 2)，10. 8 (s)；13C NMR 169. 4，167. 7，159. 2，148. 5，136. 6，125. 3，124. 5，102. 7,39. 1,29. 3，17. 3， 14. 5. 11. 7 ；IR :3385cm_1, 3208cm-1, 3005cm-1, 2963cm-1, 2935cm-1, 1800cm-1, 1699cm-1, 1601cm-1, 1577cm-1 ；EIMS :[M]+234, [M_C0]+206，[M-CH3CO]+191。
3.根据权利要求1所述的抑制血管生成的化合物，其特征是4-乙酰基-5-甲氧基-3， 6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮的物化参数是Mp :120--121 °C ；1H NMR 2. 31 (s)，2. 26 (s)，2. 22 (s)，1. 58 (d, 6)，3. 5 (s)，4. 3 (q, 7. 2)；13C NMR 169. 5，167. 8，159. 3，148. 7，136. 9，125. 3，124. 7，102. 7,50. 2,39. 1,29. 3， 17. 4，14. 6. 11. 9 ；IR :3000cm—1，2957cm—1，2920cm—1，1770cm—1，1659cm—1，1600cm—1，1520cm—1 ；EIMS :[M]+248。
4.根据权利要求1所述的抑制血管生成的化合物的制备方法，其特征是它包括如下步骤1)从海参中，利用PDA马铃薯葡萄糖琼脂进行培养，得到链格孢霉Alternaria sp. HS-3，2 菌株；2)制作种子培养基将菌株斜面接种于葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏培养基中pH: 6. 5-7. 5，在温度23-30°C、转速149rpm、培养120h，获得种子培养液；3)发酵生产发酵培养基葡萄糖0.5-1. 5，酵母提取物，0. 05-0. 2，蛋白胨0. 1-0. 4，琼 脂1-1. 5，氯化钠3-6、水100 ；将斜面培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-30°C静置 1-2个月；将发酵液经纱布过滤和离心去除菌体，上清液在50-60°C左右浓缩至5L，用乙酸乙酯 萃取3-5次，利用多次硅胶和凝胶L H-20柱层析色谱进行分离，以石油醚、乙酸乙酯、甲醇 或者氯仿、甲醇流动体系进行洗脱，最后得到化合物4-乙酰基-5-羟基-3，6，7-三甲基苯 并呋喃-2-酮以及化合物4-乙酰基-5-甲氧基_3，6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮。
5.根据权利要求4所述的抑制血管生成的化合物的制备方法，其特征是利用硅胶为固 定相在30-50%乙酸乙酯/石油醚的流动相下洗脱，然后利用凝胶色谱LH-20以石油醚/乙酸乙酯/甲醇为流动相进行分离，重结晶，即得到白色化合物4-乙酰基-5-羟基-3，6，7-三 甲基苯并呋喃-2-酮以及化合物4-乙酰基-5-甲氧基-3，6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮。
6.根据权利要求4所述的抑制血管生成的化合物的制备方法，其特征是步骤1)得到的 所述链格孢霉Alternaria sp. HS-3，2菌株，菌落开始为白色，渐变为黑绿色，基质黑色分生 孢子梗单枝，长短不一，顶生不分枝，分生孢子有纵横隔膜，倒棍棒形、卵形。
7.根据权利要求1所述的抑制血管生成的化合物的应用，其特征是所述化合物4-乙酰 基-5-羟基-3，6，7-三甲基苯并呋喃-2-酮以及化合物4-乙酰基-5-甲氧基-3，6，7-三 甲基苯并呋喃-2-酮在抑制血管生成生物活性方面的应用。
全文摘要
本发明从海参的共附生微生物的发酵培养物中提取分离得到一种抑制血管生成的化合物及其制备方法，它包括如下步骤1)从海参利用PDA培养基得到链格孢霉(Alternaria sp.)HS-3，2。菌落初白色，渐变为黑绿色，基质黑色分生孢子梗单枝，长短不一，顶生不分枝，分生孢子有纵横隔膜，倒棍棒形、卵形；2)制作种子培养基获种子培养液；3)发酵生产；发酵培养基葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物，0.05-0.2，蛋白胨0.1-0.4，琼脂1-1.5，氯化钠3-6、水100，将斜面种培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-30℃静置1-2个月；将发酵液经纱布过滤和离心去除菌体，上清液在50-60℃左右浓缩至5L，用乙酸乙酯萃取3-5次，利用柱层析色谱进行分离，以石油醚，乙酸乙酯或者氯仿、甲醇流动体系进行洗脱。
文档编号C12P17/04GK102114013SQ201010560318
公开日2011年7月6日 申请日期2010年11月26日 优先权日2010年11月26日
发明者刘新, 刘昌衡, 夏雪奎, 孟秀梅, 张永刚, 张绵松, 王小军, 袁文鹏, 贾爱荣, 陈锡强 申请人:山东省科学院中日友好生物技术研究中心