专利名称：基因重组毕赤酵母生产普鲁兰酶的方法
技术领域：
本发明涉及基因重组毕赤酵母生产普鲁兰酶的方法。
背景技术：
普鲁兰酶(Pullululanase，E.C3.2.1.41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1，6-糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的脱枝酶。它在淀粉加工工业中有着非常重要的用途。普鲁兰酶与糖化酶并用时，在降低糖化酶用量一半以上的同时，可使DE值高达98％，从而大大提高葡萄糖的收率；应用于酒精工业中，大大提高淀粉的转化率，降低生产成本。当它与β-淀粉酶混合使用时，几乎可以全部将淀粉转化为麦芽糖，从而可以生产出80％以上的超高麦芽糖浆，在α-糖苷酶的作用下，超高麦芽糖浆转化为功能性异麦芽低聚糖，可用于糖尿病人、肥胖病人以及儿童糖果中使用，防止龋齿。在啤酒生产中添加普鲁兰酶可有效地提高麦汁中可发酵性糖含量，提高糖的利用率和缩短糖化时间，酿造出优级干啤酒。另外还可以采用普鲁兰酶生产直链淀粉，利用直链淀粉生产可生物降解的薄膜。由于我国将成为汽车消费大国，汽车尾气污染和石油短缺将成为严重问题，因此推广和使用汽油醇将成为发展趋势。也因此带动酒精产业及与酒精产业相关的淀粉制糖业的较大发展。由于普鲁兰酶在酒精、食品、环保产业上极其重要的用途，它将和淀粉酶、糖化酶一样成为一个与国民经济发展相关的重大产业。
70年代全酶法水解淀粉成葡萄糖的生产发展很快，全世界葡萄糖浆的年产量约为300万吨。在当时的生产中，葡萄糖的最高转化率约为96％，是全酶法生产工艺的一个极限数值。这是因为糖化酶对淀粉中的α-1，6-糖苷键作用力较弱，从而影响淀粉的最终水解度。降低淀粉浆浓度或者增加糖化酶的用量，在理论上可以突破这个极限，但前者大大增加生产负荷，提高了成本，后者能诱发葡萄糖的聚合反应，生产异麦芽糖等，影响最终收率。一种有效的改进方法是在糖化时加入淀粉脱枝酶，提高α-1，6-糖苷键的水解速度，降低糖化酶的用量，在得到最高转化的同时又最大限度地避免发生聚合反应。在降低糖化酶用量的同时，可使DE值高达98％。大大提高葡萄糖的收率。因此掀起了开发普鲁兰酶的高潮。自1961年到1979年，已经发现几十种微生物能够产生脱枝酶，但都未应用于工业生产，主要原因有下列几个方面一是耐热性差，一般最适温度在50℃左右，60℃很快失活；二是耐酸性差，pH低于5极不稳定；三是酶活力低，成本过高。直到1983年丹麦Novo公司成功分离出一株产普鲁兰酶的杆菌(B.acidopullulyticus)。经诱变育种后，能产生每毫升10个单位的普鲁兰酶。其所产生的普鲁兰酶最适pH5.0左右，pH4.0和pH6.0时酶活降至50％以下，pH3.3时酶活接近0；最适作用温度为60℃，45℃和68℃时活力为60℃的二分之一，耐热性能不是太好，但能配合糖化酶使用。该公司将这一酶制剂产业化，商品名为Promozyme，是目前国际上唯一商品化的普鲁兰酶，目前这一产品占领了中国乃至世界95％以上的市场份额。其价格相当昂贵，每升每毫升400单位的普鲁兰酶为165元。
目前发现产普鲁兰酶微生物中主要一类为杆菌类，如产气气杆菌Aerobacter aerogenes Z，蜡状芽孢杆菌覃状变种(Bacillus cereus varmycoides)，枯草杆菌(Bacillus subtilis TU)。它们所产普鲁兰酶耐热性都不是太高，其最适温度最高为70℃，因此不适用于淀粉的液化过程。为了配合淀粉的液化过程，希望开发出耐高温普鲁兰酶，自上世纪九十年代起，国外科学家把注意力转移至在高温下生存的极端高温微生物，并分离出许多产耐热性的普鲁兰酶的极端微生物。主要有高温厌氧菌(Thermoanaerobacter brockii，Thermoanaerobium Tok6-B1、Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus、Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EM1、Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum B6A-R1、Thermoanaerobacter finnii DSM3389、Thermobacteroid acetoethylicus DSM2359、Thermoanaerobacter ethanolicusDSM2246)，嗜热古细菌(Pyrococcus woesei、Pyrococcus furiosus)，Desulfurococcus mucosus，Fervidobacterium pennavorans Ven5等。这些微生物所产普鲁兰酶能耐70～100℃高温，最适pH为5～6，可用于淀粉的液化。其中Pyrococcus furiosusce能同时产生极高产量的耐高温的淀粉酶和普鲁兰酶，但由于其最适生长温度为100℃，其发酵工艺非常困难，另外这些耐高温微生物所产酶大多为胞内酶，不分泌到细胞外。因此如果直接采用这些菌株生产普鲁兰酶，很难工业化。如果想这些耐热普鲁兰酶真正得到应用，必须采用基因工程手段构建新的菌株进行生产。
从上世纪八十年代起，基因工程技术逐渐应用于普鲁兰酶的研究与开发中。1984年，日本科学家从Klehsiella aenogenes中克隆出普鲁兰酶基因转移入大肠杆菌中，得以有效表达，但此大肠肝菌的酶活水平不高且在非选择性培养基中表现型极不稳定。1985年，Takizawa通过把普鲁兰酶基因(包括结构基因和操纵基因)克隆入多拷贝载体pBR322，得到比野生菌株酶活水平高20～40倍的工程菌，可达350单位/每毫升发酵液，是目前报道最高的，此工程菌能保持高酶水平二周。但大部分的酶都是胞内的，不分泌到胞外，并聚集在细胞表面，这种现象是工业生产中所不需要的。自此以后许多普鲁兰酶基因得到了克隆并在大肠杆菌和枯草杆菌中得到了表达。特别是进入九十年代后，这些工作进展速度大大加快，相继有许多耐热普鲁兰酶基因，特别是上述高温菌的普鲁兰酶基因被克隆、测序、在大肠和枯草杆菌中表达。但目前真正形成产业化的还并不多见。
发明内容
本发明的目的是提供一种基因重组毕赤酵母生产普鲁兰酶的方法。它是从Bacillus naganoensis(ATCC53909)中分离出普鲁兰酶基因，成功实现原核生物基因在真核表达系统毕赤酵母中高效表达，并且重组的普鲁兰酶有好的耐热特性。
1999年，Teague W.Martin等人从Bacillus naganoensis(ATCC53909)(USPT06，300，115)中分离出了普鲁兰酶基因，并在原核生物表达系统枯草杆菌中高效表达，所产生的重组普鲁兰酶具有很好的应用特性。本发明也是从Bacillusnaganoensis(ATCC53909)中分离出普鲁兰酶基因，在真核表达系统毕赤酵母中高效表达。具体方法是1、工程菌的构建采用PCR的方法从Bacillus naganoensis(ATCC53909)中克隆出编码普鲁兰酶的基因，分别克隆入毕赤酵母表达载体(PPIC9，PPIC9K，PGAP)，得到不同类型的重组子，重组子分别转化毕赤酵母表达宿主GS115，SMD1168。然后分别筛选出高效表达转化子，转化子分两种类型，一种为甲醇诱导型的转化子，需要甲醇诱导才产生重组酶，另外一种为组成型表达，在普通葡萄糖培养基中就能产酶。
2、采用基因工程菌通过摇瓶生产普鲁兰酶1)对于组成型转化子来说，从平板上取少量菌接种于YEPD培养基中[1％yeast extract(酵母抽提物)、2％peptone(蛋白胨)、2％甘油(或glucose(葡萄糖))30℃]200转/分培养四天后，经5000转/分离心后，去除细胞得到含普鲁兰酶的上清液。然后进行发酵液酶活和酶学性质检测。
2)对于甲醇诱导型的转化子来说，从平板上取少量菌接种于BMGY培养基[1％yeast extract、2％peptone，10ml 10×(13.4g/100ml)，10ml 1Mol磷酸盐缓冲液，2ml 500×生物素(20mg/100ml)，2％甘油]中培养2天，再转入BMMY培养基[1％yeast extract、2％peptone，10ml 10×(13.4g/100ml)，10ml 1Mol磷酸盐缓冲液，2ml 500×生物素(20mg/100ml)，2％甲醇]诱导培养两天，离心去除细胞得到含普鲁兰酶的上清液。然后进行发酵液酶活和酶学性质检测。
3、酶活测定方法和粗酶酶学性质(1)酶活测定方法①原理普鲁兰酶在一定条件下，催化水解普鲁兰糖生成葡萄糖等还原糖，3，5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原为显棕红色的氨基络合物，在一定范围内其颜色的深浅与还原糖的量成正比，故可以在550nm的波长下进行比色，计算酶活力。
②酶反应体系1ml适当稀释后发酵液，1ml溶于pH4.5 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中的0.5％普鲁兰糖溶液，60℃反应30min，生成还原糖采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)测定。
③酶活定义在上述条件下，每min产生相当于1μmol葡萄糖还原力的酶活力为一个酶活单位。
(2)粗酶酶学性质①温度稳定性
表1.温度稳定性温度(℃)相对酶活(％)4095459650995599601006590702801②pH稳定性表2.pH稳定性pH相对酶活(％)3 03.5 814.0 934.5 975.0 1005.5 926.0 896.5 417.0 0③保温时间和酶活关系
表3.保温时间和酶活关系保温时间相对酶活(hr) (％)0 10016782472405748536445④最适温度与pH值表4.最适温度与pH值相对酶活(％)pH 55℃60℃65℃3.25.7 2.2 2.23.880.883.711.54.487.990.684.15 82.4100 74.15.650.680.113.56.27.5 4.9 06.80 0 0本发明与现有技术相比具有以下特点巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)本身不能合成普鲁兰酶，本发明通过基因工程的手段，在巴斯德毕赤氏酵母中导入普鲁兰酶基因，使巴斯德毕赤氏酵母大量产生普鲁兰酶，由于巴斯德毕赤氏酵母非常容易实现高密度发酵，具有高分泌的特点，因此很容易实现工业化大量廉价生产普鲁兰酶。
图1为本发明的粗酶酶学性质检测中的温度稳定性。
图2为本发明的粗酶酶学性质检测中的pH稳定性。
图3为本发明的粗酶酶学性质检测中的保温时间和酶活关系。
图4为本发明的粗酶酶学性质检测中的最适温度与pH值关系。
具体实施例方式
1、工程菌的构建采用PCR(聚合酶链反应)的方法从Bacillus naganoensis(ATCC53909)中克隆出或合成编码下列氨基酸的普鲁兰酶基因，编码的氨基酸序列为AspGlyAsnThrThrAsnIleValValHisTyrPheArgProSerGlyAspTyrThrAspTrpAsnLeuTrpMetTrpProGluAsnGlyAspGlyAlaGluTyrAspPheAsnGlnProThrAspSerTyrGlyGluValAlaSerValAsplleProGlyAsnProSerGlnValGlyllelleValArgLysGlyAsnTrpAspAlaLysAspIleAspSerAspArgTyrIleAspLeuSerLysGlyHisGluIleTrpLeuValGlnGlyAsnSerGlnIlePheTyrSerGluLysAspAlaGluAlaAlaAlaGlnProAlaValSerAsnAlaTyrLeuAspAlaSerAsnGlnValLeuValLysLeuSerGlnProPheThrLeuGlyGluGlySerSerGlyPheThrValHisAspAspThrAlaAsnLysAspIleProValThrSerValSerAspAlaAsnGlnValThrAlaValLeuAlaGlyThrPheGlnHisIlePheGlyGlySerAspTrpAlaProAspAsnHisAsnThrLeuLeuLysLysValAsnSerAsnLeuTyrGlnPheSerGlyAsnLeuProGluGlyAsnTyrGlnTyrLysValAlaLeuAsnAspSerTrpAsnAsnProSerTyrProSerAspAsnIleAsnLeuThrValProAlaGlyGlyAlaHisValThrPheSerTyrIleProSerThrHisAlaValTyrAspThrIleAsnAsnProAsnAlaAspLeuGlnValAspSerSerGlyValLysThrAspLeuValAlaValThrLeuGlyGluAs
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2、采用基因工程菌通过摇瓶生产普鲁兰酶1)对于组成型转化子来说，从平板上取少量菌接种于YEPD培养基中[1％yeast extract(酵母抽提物)、2％peptone(蛋白胨)、2％甘油(或glucose(葡萄糖))30℃]200转/分培养四天后，经5000转/分离心后，去除细胞得到含普鲁兰酶的上清液。然后进行发酵液酶活和酶学性质检测。
2)对于甲醇诱导型的转化子来说，从平板上取少量菌接种于BMGY培养基[1％yeast extract、2％peptone，10ml 10×(13.4g/100ml)，10ml 1Mol磷酸盐缓冲液，2ml 500×生物素(20mg/100ml)，2％甘油]中培养2天，再转入BMMY培养基[1％yeast extract、2％peptone，10ml 10×(13.4g/100ml)，10ml1Mol磷酸盐缓冲液，2ml 500×生物素(20mg/100ml)，2％甲醇]诱导培养两天，离心去除细胞得到含普鲁兰酶的上清液。然后进行发酵液酶活和酶学性质检测。
权利要求
1.一种基因重组毕赤酵母生产普鲁兰酶的方法，其特征在于采用巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)生产普鲁兰酶，本方法包括使用不同来源的普鲁兰酶的基因，使用不同的培养方法、不同的提取方法。
2.根据权利要求1所述的基因重组毕赤酵母生产普鲁兰酶的方法，其特征在于基因重组的毕赤酵母中包含任何基因片断具备编码下列氨基酸序列AspGlyAsnThrThrAsnIleValValHisTyrPheArgProSerGlyAspTyrThrAspTrpAsnLeuTrpMetTrpProGluAsnGlyAspGlyAlaGluTyrAspPheAsnGlnProThrAspSerTyrGlyGluValAlaSerValAspIleProGlyAsnProSerGlnValGlyIleIleValArgLysGlyAsnTrpAspAlaLysAspIleAspSerAspArgTyrIleAspLeuSerLysGlyHisGluIleTrpLeuValGlnGlyAsnSerGlnIlePheTyrSerGluLysAspAlaGluAlaAlaAlaGlnProAlaValSerAsnAlaTyrLeuAspAlaSerAsnGlnValLeuValLysLeuSerGlnProPheThrLeuGlyGluGlySerSerGlyPheThrValHisAspAspThrAlaAsnLysAspIleProValThrSerValSerAspAlaAsnGlnValThrAlaValLeuAlaGlyThrPheGlnHisIlePheGlyGlySerAspTrpAlaProAspAsnHisAsnThrLeuLeuLysLysValAsnSerAsnLeuTyrGlnPheSerGlyAsnLeuProGluGlyAsnTyrGlnTyrLysValAlaLeuAsnAspSerTrpAsnAsnProSerTyrProSerAspAsnIleAsnLeuThrValProAlaGlyGlyAlaHisValThrPheSerTyrIleProSerThrHisAlaValTyrAspThrIleAsnAsnProAsnAlaAspLeuGlnValAspSerSerGlyValLysThrAspLeuValAlaValThrLeuGlyGluAsnProAspValSerHisThrLeuSerIleGlnThrGluAspTyrGlnAlaGlyGlnValIleProArgLysValLeuAspSerSerGlnTyrTyrTyrSerGlyAspAspLeuGlyAsnThrTyrThrLysAsnAlaThrThrPheLysValTrpAlaProThrSerThrGlnValAsnValLeuLeuTyrAsnSerAlaThrGlyAlaValThrLysThrValProMetThrAlaSerGlyHisGlyValTrpGluAlaThrValAsnGlnAspLeuGluAsnTrpTyrTyrMetTyrGluValThrGlyGlnGlySerThrArgThrAlaValAspProTyrAlaThrAlaIleAlaProAsnGlyThrArgGlyMetIleValAspLeuAlaLysThrAspProAlaGlyTrpGluSerAspLysHisIleThrProLysAsnIleGluAspGluValIleTyrGluMetAspValArgAspPheSerIleAspSerAsnSerGlyMetLysAsnLysGlyLysTyrLeuAlaLeuThrGluLysGlyThrLysGlyProAspAsnValLysThrGlyValAspSerLeuLysGlnLeuGlyIleThrHisValGlnLeuGlnProValPheAlaPheAsnSerValAsnGluAsnAspProThrGlnTyrAsnTrpGlyTyrAspProArgAsnTyrAsnValProGluGlyGlnTyrAlaThrAsnAlaAsnGlyThrThrArgIleLysGluPheLysGluMetValLeuSerLeuHisGlnAspHisIleGlyValAsnMetAspValValTyrAsnHisThrPheAlaThrGlnIleSerAspPheAspLysIleValProGluTyrTyrTyrArgThrAspAspAlaGlyAsnTyrThrAsnGlySerGlyThrGlyAsnGluIleAlaAlaGluArgProMetValGlnLysPheIleIleAspSerLeuLysPheTrpValAsnGluTyrHisValAspGlyPheArgPheAspLeuMetAlaLeuLeuGlyLysAspThrMetSerLysAlaAlaThrGlnLeuHisAlaIleAspProGlyIleAlaLeuTyrGlyGluProTrpThrGlyGlyThrSerAlaLeuProAlaAspGlnLeuLeuThrLysGlyAlaGlnLysGlyMetGlyValAlaValPheAsnAspAsnLeuArgAsnGlyLeuAspGlySerValPheAspSerSerAlaGlnGlyPheAlaThrGlyAlaThrGlyLeuThrAspAlaIleLysAsnGlyValGluGlySerIleAsnAspPheThrAlaSerProGlyGluThrIleAsnTyrValThrSerHisAspAsnTyrThrLeuTrpAspLysIleAlaGlnSerAsnProAsnAspSerGluAlaAspArgIleLysMetAspGluLeuAlaGlnAlaIleValMetThrSerGlnGlyIleProPheMetGlnGlyGlyGluGluMetLeuArgThrLysGlyGlyAsnAspAsnSerTyrAsnAlaGlyAspValValAsnGluPheAspTrpSerArgLysAlaGlnTyrProAspValPheAsnTyrTyrSerGlyLeuIleHisLeuArgLeuAspHisProAlaPheArgMetThrThrAlaAsnGluIleAsnSerHisLeuGlnPheLeuAsnSerProGluAsnThrValAlaTyrGluLeuSerAspHisAlaAsnLysAspThrTrpGlyAsnIleValValIleTyrAsnProAsnLysThrAlaGluThrIleAsnLeuProSerGlyLysTrpGluIleAsnAlaThrSerGlyLysValGlyGluSerThrLeuGlyGlnAlaGluGlySerValGlnValProGlyIleSerMetMetIleLeuHisGlnGluValSerProSerAspGlyLys
全文摘要
本发明是一种基因重组毕赤酵母生产普鲁兰酶的方法。其特征在于采用巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)生产普鲁兰酶，本方法包括使用不同来源的普鲁兰酶的基因，使用不同的培养方法、不同的提取方法。巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)本身不能合成普鲁兰酶，本发明通过基因工程的手段，在巴斯德毕赤氏酵母中导入普鲁兰酶基因，使巴斯德毕赤氏酵母大量产生普鲁兰酶，由于巴斯德毕赤氏酵母非常容易实现高密度发酵，具有高分泌的特点，因此很容易实现工业化大量廉价生产普鲁兰酶。
文档编号C12N9/44GK1635116SQ20041004065
公开日2005年7月6日 申请日期2004年9月7日 优先权日2004年9月7日
发明者黄遵锡, 许波, 陈金全, 杨云娟, 唐湘华 申请人:云南师范大学