专利名称：白花蛇舌草物种特异性鉴定引物、鉴定试剂盒及鉴定方法
技术领域：
本发明涉及中药材白花蛇舌草物种的基因学鉴定，特别是涉及中药材白花蛇舌草物种特异性鉴定引物，本发明还涉及含有该引物的鉴定试剂盒及运用该引物进行特异性鉴定的方法。
背景技术：
中药材白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd.又名Oldenlandia diffusa Roxb.)系茜草科耳草属植物，广泛分布于我国长江以南地区，具有清热解毒，活血化瘀，利水渗湿，消肿止痛之功效。含有丰富的有机锗、黄酮、多酚、免疫多糖、熊果酸等化合物。临床上广泛用于各种癌症、阑尾炎、扁桃体炎、肝炎、毒蛇咬伤等疾病的治疗。
但商品中常有同属植物纤花耳草Hedyotis tenelliflora、伞房花耳草(水线草)Hedyotiscorymbosa、松叶耳草Hedyotis pinifolia三种混杂其中。此外，市场上还出现过石竹科植物漆姑草Sagina japonica、雀舌草Stellaria alsine和蚤缀Arenaria serpyllifolia，以及粟米草科的粟米草Mollugo pentaphylla和多棱粟米草Mollugo costata。通常的鉴定方法为植物形态和药材特征、显微特征和薄层层析等(参见李欣，等.白花蛇舌草及其常见混伪品的鉴别.中国中药杂志，1996，21(8)460-470、潘景权.白花蛇舌草及其混淆品的鉴别.中药材，1995，18(7)344、谢志民，等.白花蛇舌草与混淆品松叶耳草的生药鉴别.中药材，1997，20(6)287-290)，但是这些混伪品干燥后或切制后的外部形态特征与白花蛇舌草极为相似，并且，传统的中药材鉴定方法有其局限性，往往受到主观或客观条件的影响，如所鉴定的药材必须保持其相对完整性等，因此，常给形态学鉴定工作带来困难与失误。
随着中药材的DNA抽提、扩增技术的日臻完善，PCR仪的迅速普及，及DNA的测序费用大幅度降低，且全自动测序非常方便，使得运用DNA鉴定中药材在实际工作中成为可能。虽然通过DNA序列比较鉴别中药材，特别在不同种属的中药材正伪品之间，是非常准确、有效的方法，即使只有一个核苷酸序列的差异，也能清楚地鉴别出来，从而弥补传统鉴定方法的不足，但是由于测序过程相对繁琐、成本高，实践中往往没有必要测定全部序列。
运用特异性引物鉴定中药材已在蛇类(参见Wang Yiquan，Zhou KY，Xu LS，at el.Authentication of an animal crude drug，Zaocys，by diagnostic PCR.Biol.Pharm.Bull.，2000，23(5)585-588)、龟甲(参见刘中权，等.中药材龟甲及原动物的高特异性PCR鉴定研究.药学学报，1999，34(12)941-945)、石斛(参见Ding X，Wang Z，Zhou K，Xu L，Xu H，Wang Y.Allele-Specific Primers for Diagnostic PCR Authentication of Dendrobiumofficinale.Planta Med.2003，69(6)587-588)等药材中取得成功。
发明内容
本发明的目的是提供中药材白花蛇舌草物种特异性鉴定引物。
本发明的另一个目的是提供含有上述特异性鉴定引物的试剂盒。
本发明还有一个目的是提供了一种运用上述特异性鉴定引物对白花蛇舌草进行简便、高效的特异性鉴定的方法。
本发明针对所要解决的技术问题提供了一种技术方案。本发明在测定了白花蛇舌草及其混伪品的核糖体DNA(rDNA)中的内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)的ITS-1、5.8S rRNA基因、ITS-2全长序列及18S、28S rRNA基因的部分序列，在此基础上，从ITS-1和ITS-2区找出白花蛇舌草特异性位点，设计出能专一性鉴别白花蛇舌草的特异性引物，通过PCR来鉴定中药材白花蛇舌草。
本发明的目的是通过下列措施实现的白花蛇舌草物种特异性鉴定引物，它的上游引物核苷酸序列与SEQ ID No.1所述序列至少有95％的相同序列；下游引物核苷酸序列与SEQ ID No.2所述序列至少有95％的相同序列。
所述的白花蛇舌草物种特异性鉴定引物，它的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述；下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述。
白花蛇舌草物种特异性鉴定试剂盒，包括下列部分a、上述特异性鉴定引物上游引物序列为SEQ ID No.1或与SEQ ID No.1所述序列至少有95％的相同序列，下游引物序列为SEQ ID No.2或与SEQ ID No.2所述序列至少有95％的相同序列，各10pmol/L；b、阳性对照品白花蛇舌草DNA模板；各10pmol/L的两个引物P1和P2，其中P1序列为SEQ ID No.3，P2序列为SEQ ID No.4。
所述的白花蛇舌草物种特异性鉴定试剂盒，还可以包括下列部分a、缓冲体系含10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.1％TritonX-100；b、1U的Taq DNA聚合酶；c、4种dNTP，各150μmol/L。
白花蛇舌草物种特异性鉴定引物的方法，其步骤包括从待检商品药材中抽提出DNA，用上述特异性鉴定引物(上游引物序列为SEQ ID No.1或与SEQ ID No.1所述序列至少有95％的相同序列，下游引物序列为SEQ ID No.2或与SEQ ID No.2所述序列至少有95％的相同序列)在50-60℃复性条件下采用常规PCR技术进行扩增，琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察，白花蛇舌草真品会出现特异性扩增条带，伪品则不出现。
有益效果本发明根据白花蛇舌草和它的常见伪混品建立的rDNA ITS区序列数据库设计的高度特异性鉴别引物，可以准确地鉴定出白花蛇舌草的真伪。本发明采用特异性鉴别引物配制成的鉴定试剂盒，成本低、准确性高，便于药检部门用该分子标记技术鉴定药材白花蛇舌草。本发明提供的鉴定方法简单高效，通过特异性的鉴别引物，在50-60℃复性条件下(优选55℃)，通过简单的PCR，白花蛇舌草DNA样品能显著地扩增出特定的207bp DNA片段，而其它伪混品的样品在同等条件下都无扩增产物，非常方便地鉴定出药材的真伪，从而建立一种更具实用价值的药材白花蛇舌草的分子标记鉴别方法。
图1核糖体DNA中的ITS示意图。
图中箭头方向代表引物的扩增方向。
图2用物种特异性引物(HD-L和HD-H)和阳性对照引物(P1和P2)扩增rDNA ITS的PCR产物琼脂糖凝胶电泳(分别扩增，混合点样)。
1、4、5分别为石竹科的蚤缀、漆姑草和雀舌草，约663bp(加上引物实际片段长约712bp，下同)；2、3分别为粟米草科的粟米草和多棱粟米草，611bp(661bp)；6、7、8分别为纤花耳草、松叶耳草、伞房花耳草，630、617、603bp(680、667、653bp)，9白花蛇舌草，特异性扩增带为207bp(251bp)，阳性对照带为603bp(653bp)；MMaker。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。
实施例11材料和方法1.1 实验材料白花蛇舌草、漆姑草、雀舌草和蚤缀为新鲜植株，经快速烘干后保存，分别采自福建厦门和安徽黄山；伞房花耳草、松叶耳草、纤花耳草和粟米草、多棱粟米草，均为干药材，原产广东或海南，由江苏省药检所提供。
1.2 DNA提取分别取100mg待检材料干标本在液氮中研成粉，置1.5mL离心管中，加入在65℃水浴中预热的0.5mL 1×CTAB提取缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTApH8.0，0.7mM NaCl，1％ CTAB，20mM 2-mercaptoethanol)，放入65℃水浴保温30min，其间倒转数次。酚-氯仿抽提，乙醇沉淀DNA。晾干，TE(10mM Tris-HCl pH8.0，1mMEDTA pH8.0)溶解后用DNA纯化试剂盒纯化，得到各待检材料DNA模板。
1.3位点特异性引物的设计测定白花蛇舌草及伪混品共9种植物的rDNA ITS-1和ITS-2区序列，并呈送GenBank，其登录号分别为AY438312-AY438323。通过CLUSTAL X(1.8)软件进行序列比对，找出白花蛇舌草与其它8种伪混品特异性位点，设计特异性扩增白花蛇舌草的鉴别引物，上游引物在白花蛇舌草rDNA ITS-1区的第153碱基开始，HD-L5′-TTCCGTTGGGCGGGTGTGACGT-3′(SEQ ID No.1)，下游引物在白花蛇舌草rDNAITS-2区第32处，HD-H5′-CAACTTCCGTCACCCCGCGCTT-3′(SEQ ID No.2)。HD-L和HD-H引物对只能特异性扩增白花蛇舌草，扩增207 bp的条带，而其它8种伪混品则没有扩增带出现。
1.4 PCR扩增为了防止可能出现假阴性，另一对引物(P1和P2)扩增约603-663 bp rDNA ITS区片段(在不同的物种中长度不同，包括部分18S rDNA、全部ITS-1、5.8S rDNA、ITS-2、部分28S rDNA)作为阳性对照，上游引物在18S rDNA的3′末端，P15′-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3′(SEQ ID No.3)(自文献Fushimi H，KomatsuK，Isobe M，et al.A new approach for the identification of a Chinese Traditional Medicine，“Chuanxiong”by 18S ribosomal RNA gene sequence.Phytomedicine，1996，3387)，下游引物在28S rDNA的5′端，P25′-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3′(SEQ ID No.4)(自文献Cerbah M，Souza-Chies T，Jubier MF，et al.Molecular phylogeny of the GenusHypochaeris using internal transcribed spacers of nuclear rDNAinference for chromosomalevolution.Mol Biol Evol，1998，15345)。P1和P2作为所有样品DNA模板的阳性对照。各引物在核糖体DNA的ITS中的位置见图1。
扩增程序为95℃预变性4min后进入如下循环95℃变性40s，55℃复性60s，72℃延伸60s共30个循环，最后7min延伸补齐。扩增反应在MJ/PTC200热循环仪上进行，反应体积为30μl，其中含10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/LMgCl2，0.1％TritonX-100，Taq DNA聚合酶1U，4种dNTP各150μmol/L，两个引物各10pmol/L，DNA模板约100ng。分别扩增9种待检药材。
1.5 检测及测序基因组DNA及PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，在UVP-Whiter/UltravioletTransilluminator上紫外扫描成像检测。测序由ABI 310遗传分析仪进行。
2 结果位点特异性引物鉴别用P1和P2这对引物，所有的样品都能扩增出明显的PCR产物(分别大约在603-663bp)，说明每个样品的DNA质量是符合PCR要求的。用HD-L和HD-H这对引物，只有白花蛇舌草能特异性的扩增出207bp PCR产物，其它伪混样品不能扩增，结果见图2。
结果表明，本发明设计的HD-L和HD-H这对引物能够准确地鉴定出白花蛇舌草的真伪。
实施例2白花蛇舌草鉴定试剂盒组成a、特异性鉴定引物上游引物序列为SEQ ID No.1，下游引物序列为SEQ ID No.2，各10pmol/L；b、缓冲体系含10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.1％ TritonX-100；c、1U的Taq DNA聚合酶；d、4种dNTP，各150μmol/L；
e、阳性对照品白花蛇舌草DNA模板；两个引物P1和P2(P1序列为SEQ ID No.3，P2序列为SEQ ID No.4)，各10pmo/L。
<110>盐城师范学院<120>白花蛇舌草物种特异性鉴定引物、鉴定试剂盒及鉴定方法<160>4<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的DNA<400>1ttccgttggg cgggtgtgac gt22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的DNA<400>2caacttccgt caccccgcgc tt22<210>3
<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的DNA<400>3cgtaacaagg tttccgtagg tgaac25<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的DNA<400>4ttattgatat gcttaaactc agcggg 2权利要求
1.白花蛇舌草物种特异性鉴定引物，它的上游引物核苷酸序列与SEQ ID No.1所述序列至少有95％的相同序列；下游引物核苷酸序列与SEQ ID No.2所述序列至少有95％的相同序列。
2.根据权利要求1所述的白花蛇舌草物种特异性鉴定引物，它的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述；下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述。
3.白花蛇舌草物种特异性鉴定试剂盒，包括下列部分a、权利要求1或2所述特异性鉴定引物上游引物序列为SEQ ID No.1或与SEQ IDNo.1所述序列至少有95％的相同序列，下游引物序列为SEQ ID No.2或与SEQ ID No.2所述序列至少有95％的相同序列，各10pmol/L；b、阳性对照品白花蛇舌草DNA模板；各10pmol/L的两个引物P1和P2，其中P1序列为SEQ ID No.3，P2序列为SEQ ID No.4。
4.根据权利要求3所述的白花蛇舌草物种特异性鉴定试剂盒，还可以包括下列部分a、缓冲体系含10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.1％ TritonX-100；b、1U的Taq DNA聚合酶；c、4种dNTP，各150μmol/L。
5.白花蛇舌草物种特异性鉴定引物的方法，其步骤包括从待检商品药材中抽提出DNA，用权利要求1或2所述特异性鉴定引物在50-60℃复性条件下采用常规PCR技术进行扩增，琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察，白花蛇舌草真品会出现特异性扩增条带，伪品则不出现。
全文摘要
本发明公开了白花蛇舌草物种特异性鉴定引物、鉴定试剂盒及鉴定方法。该鉴定引物的上游引物序列为SEQ ID No.1或与SEQ ID No.1所述序列至少有95％的相同序列，下游引物序列为SEQ ID No.2或与SEQ ID No.2所述序列至少有95％的相同序列；该试剂盒包含上述引物及阳性对照品；该方法通过提取药材的DNA，用上述特异性鉴定引物在50－60℃复性条件下采用常规PCR技术进行扩增，琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察是否出现特异性扩增条带即可鉴别真伪。本发明提供的引物及试剂盒成本低，可准确地鉴定白花蛇舌草，本发明的鉴定方法简单、高效。
文档编号C12Q1/68GK1661090SQ20041006585
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月22日 优先权日2004年12月22日
发明者刘忠权, 郝明干, 王加连 申请人:盐城师范学院