专利名称：酶解培养基培养昆虫病原线虫的方法
技术领域：
本发明涉及用于培养昆虫病原线虫的酶解培养基的制备方法，具体涉及利用淀粉酶酶解培养基培养昆虫病原线虫的方法。
背景技术：
昆虫病原线虫(Entomopathogenic Nematodes)是一类寄生昆虫的线虫。斯氏线虫科(Steinernematidae)和异小杆线虫科(Heterorhabditidae)线虫分别与嗜线虫杆菌(Xenorhabdus)和发光杆菌(Photorhabdus)共生，线虫携带共生菌进入寄主血腔，并保护共生菌不受寄主免疫反应的影响，共生菌繁殖产生毒素杀死寄主昆虫，并分解昆虫组织为线虫提供发育繁殖所需营养。此类线虫具有繁殖力高，世代历期短，致死昆虫快，杀虫谱广等特点。目前，国外有多家生物公司生产昆虫病原线虫，并作为一种生物杀虫剂以商品形式出售，用于防治多种隐蔽和土栖性害虫(van Lenteren et al，1996)。昆虫病原线虫是一类新型的生物杀虫剂，其具有对土栖及钻蛀性害虫独特的杀虫功效，且对人畜、环境安全无毒的优点。目前昆虫病原线虫已能够利用人工培养基规模化生产，作为一种生物杀虫剂在国际市场上已实现了产品的商品化。
国内对昆虫病原线虫的离体培养起步于80年代初期。80年代中期引进Bedding(1981)的三维固相培养技术后，人工离体培养线虫的效率大大提高，并根据我国国情对线虫离体培养的培养基进行了改进，我国目前培养昆虫病原线虫所用培养基是经过大量筛选工作后确定的以黄豆粉、面粉和猪油为主要成份的廉价培养基，该配方具有原料易得，配制方法简单等优点，但线虫常常对培养基利用不够完全，使线虫不易清洗，收获线虫中混有培养基残渣，影响线虫产品的质量和贮存。用此培养基培养小卷蛾斯氏线虫，每80g培养基线虫产量约为35×106条，培养周期为21天左右，较低的产量和较长的培养周期增加了线虫的生产成本，尽管其对某些重要农林害虫有很好的控制效果，但与化学农药相比在价格上没有竞争力，推广应用有一定难度。如何提高线虫对培养基的利用率，并进一步提高线虫产量和缩短培养周期，降低生产成本，成为昆虫病原线虫离体培养中急需解决的问题。
发明内容
本发明旨在提出一种利用生物酶酶解培养基用于培养昆虫病原线虫的方法，利用淀粉酶酶解培养基培养昆虫病原线虫，可提高线虫产量40％左右，收获期提前4-6天，线虫的收获率和清洁度提高。
本发明通过以下技术方案达到上述目的，即是在1000克以淀粉为主要成分的培养基中加入0.5ml~1.0ml淀粉酶(120KNU/ml)，混匀后高压灭菌，用于培养昆虫病原线虫。
本发明祥述如下利用淀粉酶、糖化酶、蛋白酶和脂肪酶等酶制剂对线虫培养基进行酶解处理后培养线虫，以线虫产量作为评定指标，发现淀粉酶酶解培养基对提高线虫产量最有效，产量可提高40％左右。
在淀粉酶酶解培养基上接种代线虫发育比率较高，雌成虫个体较大，雌成虫产卵量和子代幼虫量均比对照提高；线虫在淀粉酶酶解培养基中培养到12天时，产量即达到50×106条/80g培养基，而对照培养基到18天时，才达到其最高产量35×106条/80g培养基，酶解培养基的线虫产量比未酶解培养基提高40％，收获期提前4-6天。线虫一共生菌对酶解培养基中的总糖利用率在接种代线虫发育期比对照提高40％，在线虫产量达到最高时仍比对照高20％。
从淀粉酶酶解培养基中清洗收获线虫，线虫的收获率和清洁度提高；淀粉酶酶解培养基繁殖的线虫质量的多项生物学和生化指标检测结果与对照差异不明显，说明酶解培养基对线虫质量没有影响。
下列实施例是进一步对本发明的说明，以淀粉酶酶解培养基培养昆虫病原线虫-小卷蛾斯氏线虫S.carpocapsae为例。本方法适用于培养昆虫病原线虫-斯氏线虫科(Steinernematidae)和异小杆线虫科(Heterorhabditidae)线虫。
实施例1不同酶制剂酶解培养基对线虫繁殖量的影响将线虫培养基各组份(豆粉18％，面粉9％，酵母1％，蛋粉1％，油脂3％，水68％)混合，在高速组织匀浆器中制成匀浆，每处理1000ml，加入碎海绵均匀吸附培养基，分装于三角瓶中，每瓶装量为80g，15磅灭菌30分钟，接入共生细菌培养3天后，接入3龄侵染期线虫105条。
表1不同酶制剂酶解培养基线虫繁殖量比较
*80g培养基中线虫总量n＝5从表1结果看出，淀粉酶与淀粉酶加糖化酶两酶解培养基能明显提高小卷蛾斯氏线虫的产量，而蛋白酶和脂肪酶处理培养基对线虫产量无明显提高作用。线虫培养8天时，淀粉酶与淀粉酶加糖化酶酶解的培养基线虫产量比对照培养基有显著提高，平均每三角瓶线虫产量分别达到35.28×106、34.11×106；线虫培养15天时，淀粉酶与淀粉酶加糖化酶两个处理的线虫产量最高，分别达到49.18×106、46.88×106，与对照培养基的线虫产量差异极显著。
此结果说明采用淀粉酶酶解培养基繁殖线虫是一项可显著提高线虫产量的技术。
实施例2淀粉酶最佳用量的确定从表2看出每1000ml培养基中加入0.5ml以上淀粉酶溶液，在灭菌前期的升温过程中，培养基中的淀粉即可被完全水解，从节约酶用量考虑，在1000ml培养基溶液中加入0.5ml淀粉酶为最佳酶用量。
表2淀粉酶最佳用量的确定
*- 淀粉水解不完全；+ 淀粉水解完全实施例3淀粉酶酶解培养基对接种代线虫生长、发育和繁殖的影响表3结果显示，在淀粉酶酶解培养基中，接种代线虫的生长发育和繁殖都显著高于对照培养基。在淀粉酶酶解培养基中接种代侵染期线虫有98.2％的个体发育为成虫，而对照培养基仅为89.4％，两者之间差异显著，说明淀粉酶酶解培养基中易被线虫利用营养物的增加使更多的接种线虫发育为成虫；淀粉酶酶解培养基接种代雌成虫平均长度为5686.66微米，对照培养基的雌成虫长度为5188.89微米，两者之间差异显著，说明酶解培养基能够提供较多的营养使雌成虫发育的更好，长的更大，增加其抱卵量。在淀粉酶酶解培养基上接种代雌成虫平均繁殖量为619.67，对照为571.17，两者之间差异显著，说明淀粉酶酶解培养基能获得较高的线虫产量，是由于接种代线虫发育充分，繁殖力高所至。
表3淀粉酶酶解培养基对接种代线虫生长发育的影响
实施例4淀粉酶酶解培养基对线虫总量动态变化的影响表4线虫总量动态表明在淀粉酶酶解培养基上线虫发育的所有阶段其总量均高于未酶解培养基。在淀粉酶酶解培养基中第8天子一代线虫的产量为37.75×106/80g培养基，12天时为49.23×106条，14天时为50.01×106条，即在12天时达到其最高产量；在对照培养基第8天时子一代线虫总量为23.26×106条，18天时才达到其最高产量为35.63×106条。在淀粉酶酶解培养基中线虫的产量明显高于对照培养基，且达到最高产量的时间提前4天。淀粉酶酶解培养基子一代的线虫总量比对照提高了37.12％，最高产量比对照提高了40.36％，此结果进一步证明接种代线虫的发育繁殖量对最终产量的决定性影响。
表4淀粉酶酶解培养基对线虫总量动态变化的影响
实施例5淀粉酶酶解培养基对线虫培养过程中总糖代谢的影响表5可看出共生菌和线虫在淀粉酶酶解培养基中的总糖代谢速度比对照培养基快，总糖利用率高。当线虫接入2天后，淀粉酶酶解培养基和对照培养基中总糖利用率分别为50.44％和9.43％，处理高于对照41.01％，说明淀粉酶酶解培养基为接种代线虫的发育提高了较多低分子的糖，可被线虫迅速利用，而在对照培养基中，由于共生细菌不能水解淀粉，而线虫的淀粉酶活性又较低，使糖的利用速度较慢；线虫接入8天后，子一代线虫大量形成，淀粉酶酶解培养基和对照培养基总糖利用率分别为62.94％和40.13％，处理比对照高22.81％；在线虫总量达到最高点时，即淀粉酶酶解培养基中线虫培养14天，对照培养基中线虫培养18天，淀粉酶酶解培养基和对照培养基中总糖利用率分别为76.97％和56.80％，处理仍比对照高20.17％；说明在对照培养基中未被利用的糖类物质较多，用碘—碘化钾试剂检测对照培养基中仍有淀粉存在。
表5线虫-共生菌培养过程中的总糖利用率比较
实施例6不同处理培养基线虫收获率比较从表6结果可知，浸泡10分钟至120分钟的8个取样时间的线虫收获率，淀粉酶酶解培养基均高于对照培养基。浸泡60分钟，淀粉酶酶解培养基线虫的收获率即达91.65％，对照仅为77.02％；浸泡120分钟后，淀粉酶酶解培养基线虫的收获率为96.54％，对照为88.91％，两者之间差异显著。说明淀粉酶酶解培养基生产线虫，不仅提高线虫产量和缩短培养时间，在收获时间上较对照缩短了一半，提高了线虫收获的效率。
表6不同处理培养基线虫收获率比较
实施例7淀粉酶酶解培养基生产线虫质量的生物学指标测定表7结果表明淀粉酶酶解培养基所培养的线虫其带鞘率、带菌率、侵染力和抗干燥能力等多项生物学指标与对照培养基无显著差异。由此结果可知，用淀粉酶酶解培养基生产线虫不仅可提高线虫产量，同时也能保证线虫的质量。
表7淀粉酶酶解培养基生产线虫质量的生物学指标测定
*以线虫的存活率表示实施例8淀粉酶酶解培养基生产线虫质量的生理生化指标测定表8、9结果显示淀粉酶酶解培养基培养的侵染期线虫的干重、体内糖原、脂肪含量和体内脂肪酸相对含量等指标与对照培养基无差异。此结果从理化指标方面进一步确定了淀粉酶酶解培养基生产线虫质量的可靠性。
表8淀粉酶酶解培养基生产线虫质量的生理生化指标测定
表9淀粉酶酶解培养基生产线虫脂肪酸相对含量的比较
权利要求
1.培养昆虫病原线虫酶解培养基的制备方法，其特征是在培养基中加入消化酶，对基本培养基进行预消化；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于用淀粉酶将以淀粉为主的培养基成分酶解后制成淀粉酶酶解培养基；
3.根据权利要求1、2所述的方法，其特征是在1000克以淀粉为主要成分的培养基中加入0.5-1.0ml淀粉酶(120KNU/ml)；
4.根据权利要求1、2、3、所述的培养基，其特征是用于培养昆虫病原线虫——斯氏线虫科(Steinernematidae)和异小杆线虫科(Heterorhabditidae)线虫。
全文摘要
本发明涉及用酶解培养基培养昆虫病原线虫的方法。本发明的淀粉酶酶解培养基是在1000克以淀粉为主要成分的培养基中加入0.5－1.0ml淀粉酶(120KNU/ml)，混匀后高压灭菌，用于培养昆虫病原线虫。用本发明研制的淀粉酶酶解培养基培养昆虫病原线虫，和原培养基相比产量提高40％左右，收获期提前4－6天，线虫的收获率和清洁度提高。
文档编号C12N1/10GK1778888SQ20041009604
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月26日 优先权日2004年11月26日
发明者杨怀文, 刘峥, 简恒, 杨秀芬, 陈松笔, 袁京京 申请人:中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所