专利名称：Il－7融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及白介素-7(IL-7)融合蛋白、它们的生产方法及其用途。该融合蛋白包含直接或间接与IL-7融合的免疫球蛋白部分，为了改善生物学和药学性质，相对于野生型IL-7将其在特异位点进行修饰。本发明的蛋白质在治疗伴有免疫缺陷的紊乱中，特别是在治疗涉及T细胞缺陷的疾病中特别有用。
背景技术：
多种种紊乱和治疗涉及免疫细胞的缺陷。例如，HIV感染导致CD4+T细胞的丧失，而治疗如化疗和放射治疗通常导致广泛的多种血细胞的丧失。已尝试提供能补充由于疾病或治疗而丧失的特异型免疫细胞的特异性蛋白药物。例如，在癌症化疗中，使用促红细胞生成素补充红细胞，使用粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)补充中性粒细胞，以及使用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)补充粒细胞和巨噬细胞。这些蛋白质药物，尽管是有益的，但是血清半寿期相对较短，结果免疫细胞补充常常是不足的。此外，即使已知由于疾病或者某种重度骨髓清除性处理(myeloablativetreatment)后导致这些细胞的丧失对于患者的健康特别有害，但是当前在临床使用中没有用于特异性刺激T或B细胞的发育的特异性治疗。因此，在本领域中需要研制血清半寿期延长的免疫系统刺激剂和恢复药物，特别是淋巴细胞的刺激剂和恢复药物。
发明概述本发明涉及与相应的野生型IL-7蛋白相比，具有改良的生物学性质的白介素-7(IL-7)融合蛋白。此外，本发明是部分基于与野生型重组IL-7相比，具有特定结构特征的IL-7融合蛋白具有改良的生物学特性的发现。
因此，在一个方面，本发明的特征是包括包含免疫球蛋白(Ig)链的第一部分和包含白介素-7(IL-7)的第二部分的融合蛋白，其中与野生型IL-7相比，IL-7融合蛋白具有增强的生物学活性，如延长的血清半寿期或者在促进免疫细胞的存活或扩增方面生物学活性增强。
在一个实施方案中，本发明的特征是包括包含Ig链的第一部分和包含IL-7的第二部分的融合蛋白，其中IL-7的70和91位上的氨基酸残基是糖基化的并且IL-7的116位上的氨基酸残基是非糖基化的。贯穿本文件，IL-7的氨基酸位置参考成熟的人IL-7序列中的相应位置。在一个实施方案中，IL-7的116位上的氨基酸残基是天冬酰胺。在另一个实施方案中，改变IL-7的116位上的氨基酸残基使得其不作为糖基化位点。在一个实施方案中，IL-7部分包括IL-7中的Cys2和Cys92、Cys34和Cys129，以及Cys47和Cys141之间的二硫键。
在另一个实施方案中，本发明包括一种融合蛋白，其包括包含Ig链的第一部分和包含IL-7的第二部分，其中IL-7包括IL-7中的Cys2和Cys92、Cys34和Cys129，以及Cys47和Cys141之间的二硫键。在一个实施方案中，IL-7的116位上的氨基酸残基是非糖基化的。在另一个实施方案中，IL-7的116位上的氨基酸残基是天冬酰胺或者被改变使得其不作为糖基化位点。在另一个实施方案中，IL-7的70和91位上的氨基酸残基是糖基化的。
Ig链通常是完整的抗体或其一部分，如Fc区。IL-7融合蛋白的Ig链可来自任何已知的Ig同种型并且可包括一个或多个恒定区的至少一部分。例如，恒定区可选自CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。在一个实施方案中，Ig部分包括铰链区、CH2区和CH3区。Ig链可选择地通过接头与IL-7部分连接。
在本发明中允许单一抗体同种型(如IgG1或IgG2)的Ig部分以及杂合的Ig部分。例如，在一个实施方案中，Ig部分包含来自一种同种型(即IgG2)的铰链区和来自另一种同种型(即IgG1)的CH区。可有利地修饰包括IgG1的Fc部分的Ig链以包含Asn297Gln和Tyr296Ala突变。此外，可有利地修饰包括IgG2的Fc部分的Ig链以包括Asn297Gln和Phe296Ala突变。
上述IL-7融合蛋白的IL-7部分可包括IL-7的成熟部分。在一个实施方案中，IL-7部分还可包含缺失，如内部缺失。在一个实例中，IL-7可包括SEQ ID NO1的96-114位氨基酸的18个氨基酸的缺失。
在另一个实施方案中，本发明包括编码上述IL-7融合蛋白的纯化的核酸以及培养含有这些核酸的宿主细胞。
在另一个实施方案中，本发明包括制备IL-7融合蛋白的方法，包括在宿主细胞中表达上述核酸以及收获该融合蛋白。
在另一个方面，本发明包括组合物，如包含上述融合蛋白的药物组合物。
在另一个方面，本发明包括通过施用Fc-IL-7融合蛋白治疗患者的方法。
附图简述
图1描述人IL-7的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。以粗体显示信号序列。也以粗体和斜体描述了可从IL-7序列中缺失的一段18个氨基酸。
图2描述母牛IL-7的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。以粗体显示信号序列。
图3描述绵羊IL-7的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。以粗体显示信号序列。
图4描述成熟的人Fcγ1-IL-7的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
图5描述成熟的人Fcγ2(h)(FN＞AQ)-IL-7的氨基酸序列(SEQ IDNO5)。
图6描述成熟的人Fcγ1(接头1)-IL-7的氨基酸序列(SEQ ID NO6)。
图7描述成熟的人Fcγ1(YN＞AQ)(接头2)-IL-7的氨基酸序列(SEQ IDNO7)。
图8描述成熟的人Fcγ1(YN＞AQ，d)(接头2)-IL-7的氨基酸序列(SEQID NO8)。
图9描述人Fcγ1-IL-7的Fc区的核酸序列(SEQ ID NO22)。
图10描述人Fcγ1(YN＞AQ)-IL-7的Fc区的核酸序列(SEQ ID NO21)。
图11是人Fcγ2(h)-IL-7的Fc区的核酸序列(SEQ ID NO20)。
图12是人Fcγ2(h)(FN＞AQ)-IL-7的Fc区的核酸序列(SEQ ID NO19)。
图13是实施例7的重组人IL-7(空心正方形)和融合蛋白Fcγ2(h)(FN＞AQ)-IL-7(空心菱形)的药代谢动力学谱图示。测量所施用的IL-7融合蛋白随时间(小时)的血清浓度(ng/ml)。
图14是在用重组的人IL-7(空心符号)、人Fc-IL-7(实心符号)或PBS(X)处理的、经照射的、骨髓移植的小鼠中B细胞重建的图示。每隔一天(正方形)或每周一次(三角形)施用蛋白。点划线代表供体小鼠中的B细胞浓度。
图15是在用重组的人IL-7(空心符号)、人Fc-IL-7(实心符号)或PBS(X)处理的、经照射的、骨髓移植的小鼠中T细胞重建的图示。每隔一天(正方形)或每周一次(三角形)施用蛋白。点划线代表供体小鼠中的T细胞浓度。
图16是代表用huFcγ2(h)(FN＞AQ)-IL-7(前两列)处理的、经照射的、骨髓移植的小鼠以及未处理的对照(最后一列)的血液(顶行)和脾(底行)样品中淋巴细胞群的点图。第一列代表重建的内源性淋巴细胞(CD45.2+)，第二列代表重建的供体淋巴细胞(CD45.1+)。在右下象限中显示检测为CD3阳性细胞的T淋巴细胞。在左上象限中显示检测为B220阳性细胞的B淋巴细胞。
发明详述本发明提供与野生型IL-7蛋白相比，生物学活性提高的IL-7融合蛋白。具体而言，本发明提供包含免疫球蛋白(Ig)部分的IL-7融合蛋白。这些Ig-IL-7融合蛋白具有增强的生物学活性，如与野生型IL-7蛋白相比血清半寿期延长，这使得它们适用于治疗伴有免疫细胞缺陷(如淋巴细胞缺陷)的疾病。
本发明还部分基于具有特定结构特征的IL-7融合蛋白也具有提高的生物学性质这一发现。虽然哺乳动物IL-7的氨基酸序列是公知的，但是关于真核生物来源的IL-7蛋白的结构信息，包括例如蛋白如何折叠以及其预测的N-连接的糖基化位点对其生物学活性的影响仍然不清楚。例如，人IL-7蛋白在成熟蛋白的2、34、47、92、129和141位上为半胱氨酸以及在天冬酰胺(Asn)70、Asn91、和Asn116位上具有三个潜在的N-连接的糖基化位点。然而，在真核细胞条件下所合成的IL-7的精确结构是未知的。
本发明包括具有特定的结构形式和增强的生物学活性的IL-7融合蛋白。例如，具有Cys2-Cys92、Cys34-Cys129和Cys47-141的二硫键模式的IL-7融合蛋白的体内活性高于野生型重组IL-7蛋白。
此外，本发明提供IL-7中三个潜在的N-连接的糖基化位点中仅有两个被糖基化的IL-7融合蛋白形式。具体而言，成熟蛋白的Asn70和Asn91被糖基化，而IL-7Asn116位上预期的N-连接的糖基化位点没有被糖基化。这种IL-7融合蛋白的体内活性高于野生型重组IL-7。
本发明也包括IL-7部分含有缺失并且与相应的未修饰的IL-7融合蛋白相比，仍然保留同等活性的IL-7融合蛋白。例如，本发明提供IL-7部分含有与序列VKGRKPAALGEAQPTKSL(SEQ ID NO9)对应的18个氨基酸内部缺失的Ig-IL-7形式。
白介素-7融合蛋白一般而言，将IL-7蛋白与载体蛋白融合。在一个实施方案中，将载体蛋白置于融合蛋白的N末端，将IL-7蛋白置于C末端。在另一个实施方案中，IL-7融合蛋白置于融合蛋白的N末端，将载体蛋白置于C末端。
如在这里所使用的，术语“白介素-7”或“IL-7”意思是IL-7多肽及其与野生型成熟哺乳动物IL-7具有基本上相同的氨基酸序列并且例如在IL-7受体结合亲和力的标准生物学测定或试验中具有基本上同等的生物学活性的衍生物和类似物。例如，IL-7指重组或非重组多肽的氨基酸序列，其具有以下氨基酸序列i)IL-7多肽的天然的或自然发生的等位变体，ii)IL-7多肽的生物学活性片段，iii)IL-7多肽的生物学活性多肽类似物，或者iv)IL-7多肽的生物学活性变体。可从任何物种中获得本发明的IL-7多肽，例如人、母牛或绵羊。IL-7核酸和氨基酸序列在本领域中是公知的。例如，人IL-7氨基酸序列的Genbank登录号为000880(SEQ ID NO1)，显示于图1；小鼠IL-7氨基酸序列的Genbank登录号为NM 008371；大鼠IL-7氨基酸序列的Genbank登录号为AF 367210；母牛IL-7氨基酸序列的Genbank登录号为NM 173924(SEQ ID NO2)，显示于图2；绵羊IL-7氨基酸序列的Genbank登录号为U10089(SEQ ID NO3)，显示于图3。在每个图中用粗体显示每种多肽物种的信号序列，一般不包括C末端与载体蛋白融合的IL-7部分。
IL-7蛋白的“变体”指改变了一个或多个氨基酸的氨基酸序列。变体可具有“保守性”改变，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质，例如用异亮氨酸取代亮氨酸。更少见的是，变体可具有“非保守性”改变，例如用色氨酸取代甘氨酸。类似的次要变化也可包括氨基酸缺失或插入，或二者。使用本领域中公知的计算机程序(例如用于分子建模或用于产生序列对比的软件)可以发现确定哪些和多少氨基酸残基可被取代、插入或缺失，而不废除生物学活性的指导。包含于本发明的IL-7变体蛋白包括保留IL-7活性的IL-7蛋白。包括添加、取代或缺失在内的IL-7多肽也包含于本发明，只要该蛋白保留与IL-7基本等同的生物学活性。例如，在本发明也包括保留与全长型IL-7蛋白等同生物学活性的IL-7截短物。可使用如下面实施例6中所描述的体外细胞扩增测定法测量IL-7蛋白的活性。本发明IL-7变体的活性保持与野生型IL-7相比至少10％、20％、40％、60％，但是更优选地80％、90％、95％以及甚至更优选地99％的生物学活性。
IL-7蛋白变体也包括与野生型IL-7至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％，或更高序列同一性的多肽。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，将序列比对用于最佳的比较目的(例如，可在第一个氨基酸的序列或核酸序列中引入缺口用于与第二个氨基酸或核酸序列的最佳比对)。两个序列之间的同一性百分数是序列之间共有相同位置数量的函数(即，同源性％＝相同位置的数量/总的位置数X 100)。可使用数学算法确定两个序列之间的同源性百分数。优选的用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-68的算法，改良于Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-77中。将这种算法整合到Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序中。可用NBLAST程序，记分＝100，词长＝12进行BLAST核苷酸搜索。可用XBLAST程序，记分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白搜索。为了获得用于比较目的的带缺口的序列对比，可使用如在Altschul等(1997)Nucleic Acids Research25(17)3389-3402中所述的缺口BLAST。当利用BLAST和缺口BLAST程序时，可使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
可在本发明的Fc-IL-7融合蛋白中除去或修改IL-7部分中的潜在的T细胞或B细胞表位。于2004年12月9日递交于美国专利和商标局的名为“免疫原性降低的IL-7变体”的美国临时专利申请(Attorney Docket No.LEX-035PR)中公开了示范性的去免疫的IL-7部分。
载体蛋白载体蛋白可以是与IL-7蛋白共价融合的任何部分。在一个实施方案中，载体蛋白是白蛋白，例如人血清白蛋白。在另一个实施方案中，载体蛋白是免疫球蛋白(Ig)部分，如Ig重链。Ig链可来自IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。根据本发明，Ig部分可形成完整的抗体并可在体内使IL-7融合蛋白针对特异性靶位点。利用抗体靶向融合蛋白是本领域技术人员已知的。在另一个实施方案中，载体Ig部分还包含Ig轻链。
在一个实施方案中，Ig部分包含Fc区。如在这里所使用的，“Fc部分”包括来自免疫球蛋白(优选人免疫球蛋白)的恒定区的区域，包括恒定区的片段、类似物、变体、突变体或衍生物。合适的免疫球蛋白包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和其它种类的免疫球蛋白。免疫球蛋白恒定区指与免疫球蛋白C末端区同源的天然存在的或合成产生的多肽，可包括单独的或以任何方式组合的CH1结构域、铰链、CH2结构域、CH3结构域或CH4结构域。在本发明中，Fc部分一般包括至少CH2结构域。例如，Fc部分可包括铰链-CH2-CH3。另选地，Fc部分可包括铰链区、CH2结构域和/或CH3结构域和/或CH4结构域中的全部或者一部分。
免疫球蛋白的恒定区负责许多重要的抗体功能，包括Fc受体(FcR)结合和补体固定。有五种主要类型的重链恒定区，分为IgA、IgG、IgD、IgE和IgM。例如，IgG分成四个亚类1、2、3和4，也分别称为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
IgG分子与多种类型的细胞受体相互作用，包括对IgG类抗体特异的三类Fcγ受体(FcγR)，即Fc3RI、FcγRII和FcγRIII。已报道对IgG与FcγR受体的结合非常重要的序列位于CH2和CH3区中。抗体的血清半寿期受该抗体结合Fc受体(FcR)能力的影响。类似地，免疫球蛋白融合蛋白的血清半寿期也受结合这种受体能力的影响(Gillies等(1999)Cancer Res.592159-66)。与IgG1的那些区域相比，IgG2和IgG4的CH2和CH3结构域对Fc受体具有生物化学上未检测到的或降低的结合亲和力。已报道含有IgG2或IgG4的CH2和CH3结构域的免疫球蛋白融合蛋白的血清半寿期比相应的含有IgG1的CH2和CH3结构域的融合蛋白更长(美国专利No.5,541,087；Lo等(1998)Protein Engineering，11495-500)。因此，在本发明的某些实施方案中，优选的CH2和CH3结构域来自受体结合亲和力和效应器功能降低的抗体同种型，例如，IgG2或IgG4。更优选的CH2和CH3结构域来自IgG2。
铰链区正常位于重链恒定区的CH1结构域的C末端。在IgG同种型中，在该铰链区内一般存在二硫键，允许形成最终的四聚体抗体分子。该区域中脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸占多数。当包含在本发明中时，铰链区一般至少与天然存在的免疫球蛋白区域同源，其包含半胱氨酸残基以形成连接两个Fc部分的二硫键。人和小鼠免疫球蛋白铰链区的代表性的序列在本领域中是公知的，并且可见于Borrebaeck编，(1992)《AntibodyEngineering，A Practical Guide》，W.H.Freeman and Co。适合本发明的铰链区可来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和其它类型的免疫球蛋白。
IgG1铰链区有三个半胱氨酸，在免疫球蛋白的两条重链之间的二硫键中涉及其中的第二和第三个半胱氨酸。这些相同的两个半胱氨酸允许Fc部分形成有效的和一致的二硫键。因此，本发明优选的铰链区来自IgG1，更优选来自人IgG1，其中优选将第一个半胱氨酸突变成另一个氨基酸，优选为丝氨酸。
IgG2同种型铰链区有四个二硫键，其在重组系统的分泌中倾向于促进寡聚化和可能形成不正确的二硫键。合适的铰链区可来自IgG2铰链；优选将前两个半胱氨酸中的每一个突变成另一个氨基酸。
已知IgG4的铰链区无效地形成链间二硫键。然而，本发明合适的铰链区可来自IgG4铰链区，优选地含有在来源于重链的部分之间能提高正确二硫键形成的突变(Angal等(1993)Mol.Immunol.，30105-8)。
根据本发明，Fc部分可含有来自不同抗体同种型的CH2和/或CH3和/或CH4结构域以及铰链区，即杂合的Fc部分。例如，在一个实施方案中，Fc部分含有来自IgG2或IgG4的CH2和/或CH3结构域以及来自IgG1的突变铰链区。如在本申请中所使用的，Fcγ2(h)指一种实施方案，其中铰链来自IgG1，其余的恒定结构域来自IgG2。另选地，在杂合的Fc部分中使用来自另一种IgG亚类的突变铰链区。例如，可使用允许在两个重链之间有效形成二硫键的IgG4铰链的突变形式。突变铰链也可来自IgG2铰链，其中将前两个半胱氨酸中的每一个突变成另一个氨基酸。这种杂合Fc部分便于高水平表达并提高Fc-IL-7融合蛋白的正确装配。这种杂合Fc部分的装配在本领域中是已知的并且描述于美国公开的专利申请No.2003-0044423。
在一些实施方案中，Fc部分含有通常延长Fc融合蛋白的血清半寿期的氨基酸修饰。这种氨基酸修饰包括基本上降低或消除Fc受体结合或补体固定活性的突变。例如，可除去免疫球蛋白重链Fc部分内的糖基化位点。在IgG1中，糖基化位点是氨基酸序列Gln-Tyr-Asn-Ser(SEQ ID NO30)内的Asn297。在另一个免疫球蛋白同种型中，糖基化位点对应于IgG1的Asn297。例如，在IgG2和IgG4中，糖基化位点是氨基酸序列Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO29)内的天冬酰胺。因此，lgGl的Asn297突变除去了来自IgG1的Fc部分中的糖基化位点。在一个实施方案中，用Gln取代Asn297。在另一个实施方案中，将氨基酸序列Gln-Tyr-Asn-Ser(SEQ ID NO30)内的酪氨酸进一步突变以除去由于天冬酰胺突变所致的潜在的非自身T细胞表位。如在这里所用的，T细胞表位是蛋白质内与MHC类II型分子相互作用或结合的多肽序列。例如，可用Gln-Ala-Gln-Ser(SEQ ID NO28)氨基酸序列取代IgG1重链内的氨基酸序列Gln-Tyr-Asn-Ser(SEQ ID NO30)。类似地，在IgG2或IgG4中，突变氨基酸序列Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO29)内的天冬酰胺除去来自IgG2或IgG4重链的Fc部分中的糖基化位点。在一个实施方案中，用谷氨酰胺取代天冬酰胺。在另一个实施方案中，将氨基酸序列Gln-Phe-Asn-Ser(SEQID NO29)内的苯丙氨酸进一步突变以消除由于天冬酰胺突变所致的潜在的非自身T细胞表位。例如，可用Gln-Ala-Gln-Ser(SEQ ID NO28)氨基酸序列取代IgG2或IgG4重链内的氨基酸序列Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ IDNO29)。
也已经观察到靠近Fc部分和非Fc部分连接的氨基酸的改变可显著增加Fc融合蛋白的血清半寿期(美国公开的专利申请No.2002-0147311)。因此，本发明的Fc-IL-7或IL-7-Fc融合蛋白的连接区可含有相对于免疫球蛋白重链和IL-7天然存在的序列的某种改变，优选改变位于连接点的约10个氨基酸内。这些氨基酸变化可导致疏水性增加，例如将Fc部分C末端的赖氨酸变为疏水氨基酸(如丙氨酸或亮氨酸)。在本发明的另一个实施方案中，缺失Fc部分的C末端赖氨酸和前面的甘氨酸。
在另一个实施方案中，Fc部分含有靠近免疫球蛋白重链Fc部分C末端的Leu-Ser-Leu-Ser片段的氨基酸改变。Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO27)片段的氨基酸替换消除了潜在的功能性T细胞表位。在一个实施方案中，用Ala-Thr-Ala-Thr(SEQ ID NO26)氨基酸序列取代靠近Fc部分C末端的Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO27)氨基酸序列。在另一个实施方案中，用其它氨基酸(例如甘氨酸或脯氨酸)取代Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ IDNO27)片段内的氨基酸。已在美国公开的专利申请No.2003-0166877中描述了产生靠近IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其它类型免疫球蛋白分子C末端的Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO27)片段的氨基酸替换，以及改变功能性T细胞表位的其它示范性修饰的详细方法。
间隔区在一个实施方案中，在载体蛋白和IL-7融合蛋白之间插入间隔区或接头肽。例如，将间隔区直接置于Ig恒定区的最后一个氨基酸的C末端。间隔区或接头肽优选不带电荷，更优选是非极性的或疏水的。间隔区或接头肽的长度优选在1至约100个氨基酸之间，更优选在1至约50个氨基酸之间，或者在1至约25个氨基酸之间，甚至更优选在1至约15个氨基酸之间，甚至更优选少于10个氨基酸。在一个实施方案中，间隔区含有序列(G4S)n，其中n小于5。在优选的实施方案中，间隔区含有序列G4SG4(SEQID NO25)。在另一个实施方案中，间隔区含有被识别为N-连接的糖基化位点的基序。在另一个实施方案中，间隔区含有被位点特异性裂解剂识别的基序。在本发明的一个可选择的实施方案中，载体蛋白和IL-7融合蛋白通过合成的间隔区分开，所述间隔区例如PNA间隔区，优选不带电荷，更优选非极性的或疏水的间隔区。
IL-7融合蛋白的产生在本文的实施例中描述了用于合成本发明的有用的实施方案的非限制性的方法，以及可用于体外测试性质、药代动力学和在动物模型体内测试活性的测定法。
可使用本领域已知的重组表达载体生产本发明的IL-7融合蛋白。术语“表达载体”指用于表达编码目的IL-7融合蛋白的可复制的DNA构建体，其包含转录单位DNA，其中转录单位包括以下集合(1)在基因表达中具有调节作用的遗传元件，例如启动子、操纵子或增强子，其与(2)被转录成mRNA并被翻译成蛋白质的编码目的IL-7融合蛋白的DNA序列有效连接，以及(3)适当的转录和翻译起始和终止序列。启动子和其它调控元件的选择通常根据预期的宿主细胞而变化。本发明优选的表达载体是来自在Lo等，Protein Engineering(1998)11495中所描述的PdCs-huFc表达载体的Fc表达载体。
在优选的实施例中，使用重组DNA技术将编码IL-7融合蛋白的核酸转染到宿主细胞内。在本发明上下文中，外源DNA包含编码本发明蛋白质的序列。适当的宿主细胞包括原核细胞、酵母或更高级的真核细胞。优选的宿主细胞是真核细胞。
可在酵母宿主中表达重组的IL-7融合蛋白，优选来自酵母属(Saccharomyces)的种类，如酿酒酵母(S.cerevisiae)。也可使用其它属如毕赤酵母属(Pichia)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的酵母。酵母载体将通常含有酵母质粒的复制起点或者自主复制的序列(ARS)、启动子、编码IL-7融合蛋白的DNA、用于多聚腺苷酸化作用和转录终止的序列以及选择基因。酵母载体中适当的启动子序列包括金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-4-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡糖异构酶以及葡糖激酶的启动子。
可使用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统表达重组蛋白。用于在昆虫细胞中生产蛋白质的杆状病毒系统是本领域公知的。适当的哺乳动物宿主细胞系的实例包括NS/0细胞、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa以及BHK细胞系。另外适当的哺乳动物宿主细胞包括都来自猴肾的CV-1细胞(ATCC CCL70)和COS-7细胞。另一种适当的猴肾细胞系，CV-1/EBNA，是通过用编码EB病毒核抗原-1(EBNA-1)的基因和用含有CMV调控序列的载体转染CV-1细胞系衍生的(McMahan等，(1991)EMBO J.102821)。EBNA-1基因允许含有EBV复制起点的表达载体(如HAV-EO或pDC406)的游离型复制。
哺乳动物表达载体可包括与要表达的基因相连的非转录元件，如复制起点、适当的启动子和增强子，其它5′或3′侧翼非转录的序列和5′或3′非翻译的序列，如必需的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点，以及转录终止序列。通常使用的启动子和增强自来自多瘤、腺病毒2、猿猴病毒40(SV40)以及人巨细胞病毒。可使用来自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期和晚期启动子、增强子、剪接和多聚腺苷酸化位点以提供异源DNA序列表达所需的其它遗传元件。
为了从宿主细胞中分泌IL-7融合蛋白，表达载体包含编码信号或前导肽的DNA。在本发明中，可使用编码IL-7的天然信号序列的DNA，或者另选地，可使用编码异源信号序列的DNA，如来自另一种白介素或分泌的Ig分子的信号序列。
本发明也提供制备本发明的重组蛋白的方法，包括在促进表达的条件下，培养用包含编码IL-7融合蛋白的DNA序列的表达载体转化的宿主细胞。然后从培养基或细胞提取物中纯化目的蛋白。例如，可首先对将重组蛋白分泌到培养基内的表达系统的上清液进行浓缩，使用可买到的蛋白浓缩过滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元。浓缩步骤后，将浓缩液应用到适当的纯化基质中，如本领域中公知的纯化基质。例如，使用与A蛋白偶联的基质常规捕获Fc-IL-7融合蛋白。
“分离的”或“纯化的”IL-7融合蛋白或其生物活性部分基本上无IL-7融合蛋白来源的细胞或组织的细胞材料或其它污染的蛋白，或者当用化学方法合成时基本上无化学前体或其它化学制剂。“基本上无细胞材料”包括IL-7融合蛋白制品，其中蛋白质从其被分离的或重组产生的细胞的细胞组分中分离。在一个实施方案中，“基本上无细胞材料”包括具有非IL-7融合蛋白(这里也称作“污染蛋白”)低于约30％(以干重计算)的IL-7融合蛋白制品，更优选非IL-7融合蛋白低于约20％，还更优选非IL-7融合蛋白低于约10％，最优选非IL-7融合蛋白低于约5％。当从重组来源中纯化IL-7融合蛋白或其生物活性部分时，也优选基本上无培养基，即培养基低于约蛋白制品体积的20％，更优选低于约10％，最优选地低于约5％。
术语“基本上纯的Ig-IL-7融合蛋白”指Ig-IL-7融合蛋白在制品中构成蛋白的至少60％、70％、80％、90％、95％或99％的制品。在一个实施方案中，本发明包括具有在Cys2和Cys92、Cys34和Cys129、以及Cys47和Cys141之间形成二硫键的Ig-IL-7融合蛋白形式的基本上纯的制品。在另一个实施方案中，本发明的特征是Ig-IL-7融合蛋白的基本上纯的制品，其中Asn116是非糖基化的但是Asn70和Asn91是糖基化的。
使用Fc-IL-7蛋白的治疗方法本发明的IL-7融合蛋白可用于治疗免疫缺陷和加速例如在疾病或本质上是免疫抑制的治疗后发生的免疫系统的自然重建。例如，可使用IL-7融合蛋白治疗感染性病原体、免疫紊乱以及促进特定免疫细胞类型的生长(包括增殖)。此外，IL-7融合蛋白可用于治疗癌症，如膀胱癌、肺癌、脑癌、乳腺癌、皮肤癌以及前列腺癌。在一个实施例中，可用上述IL-7融合蛋白治疗经历了一个或多个化疗周期的患者以帮助它们的免疫细胞补充。另选地，IL-7融合蛋白可用于过继T细胞移植。例如，可施用IL-7融合蛋白以便于移植的T细胞的扩增和存活，或者用于离体扩增分离的T细胞群。另选地，向患HIV的患者、年老的、接受移植的患者，或者免疫系统功能被抑制的其它患者施用上述IL-7融合蛋白也是有用的。
施用可将本发明的IL-7融合蛋白整合到适于施用的药物组合物中。这种组合物一般包括IL-7融合蛋白和可药用载体。如在这里所使用的，“可药用载体”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散剂、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂等。这类介质和试剂用作药学活性物质是本领域众所周知的。
配制本发明的药物组合物，使其与期望的给药途径相容。给药途径的实例包括肠胃外给药，例如静脉内、真皮内、皮下、口服(例如吸入)、经皮的(局部)、经粘膜和直肠给药。用于肠胃外、真皮内或皮下应用的溶液或悬液可包括下列成分无菌稀释剂如用于注射的水、盐溶液、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；鳌合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液，如醋酸盐、枸橼酸盐或磷酸盐以及用于调节张力的试剂如氯化钠或葡萄糖。pH可用酸或碱调整，如盐酸或氢氧化钠。可将肠胃外制剂装于安瓿、一次性注射器或者由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
含有本发明的IL-7融合蛋白的药物可具有0.01到100％(w/w)的浓度，尽管量可根据药物的剂型而改变。
给药剂量取决于患者的体重、疾病的严重性以及医生的意见。然而，通常每天给予约0.01到约10mg/kg体重的量是适当的，优选约0.02到2mg/kg，在注射的情况中更优选地是约0.5mg/kg。根据疾病的严重性和医生的意见，该剂量可以每日给予一次或分几次给予。
当与一种或多种其它治疗剂共同施用，例如，一种也已知对补充血细胞有用的分子时，本发明的组合物是有用的。例如，该分子可以是已知用于补充红细胞的促红细胞生成素、用于补充中性粒细胞的G-CSF或者用于补充粒细胞和巨噬细胞的GM-CSF。
实施例1人(hu)Fc-IL-7和huFc-IL-7变体的克隆通过聚合酶链反应(PCR)扩增编码人IL-7的成熟形式(即缺乏其N末端信号序列)的核酸，使用分别结合Sma I和Xho I限制性位点的正向和反向引物。将扩增的PCR产物克隆到pCRII载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)内，证实其序列。成熟IL-7的氨基酸序列显示为SEQ ID NO1，将Sma I/Xho I消化的IL-7片段转移到同样处理过的pdCs-huFc衍生的表达载体中，得到huFc和IL-7之间的嵌合序列，IL-7于筐内置于编码Fc CH3部分的序列的下游(见Lo等，Protein Engineering(1998)11495)。
一系列表达载体源自pdCs-huFc载体，其编码通常包括Ig的铰链、CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，并且已将其改造，以在Fc区中掺入特异的改变。因此，通过将IL-7片段在这些载体之间进行穿梭，产生了一系列其Fc主链不同的huFc-IL-7融合蛋白。为了产生各种主链，可通过本领域的公知方法首先将适当的突变引入到Fc序列中。由于pdCs-huFc来源载体的Fc区的两侧是AflII限制性酶切位点和SmaI限制性酶切位点，因此通过使用分别结合AflII和SmaI限制性酶切位点的引物，将经过适当修饰的主链的核酸进行PCR，然后将所得的编码Fc的核酸片段作为AflII到SmaI片段替换到pdCs-huFc来源的载体中。AflII序列CTTAAGC(SEQID NO24)位于以GAGCCCAAA(SEQ ID NO23)开始的Fc序列的上游，如在图20中所示其代表铰链区的开始。如在图12中通过有下划线的核酸所示，SmaI位点CCCGGGT(SEQ ID NO17)接近CH3区的末端，并且编码位于CH3区末端丙氨酸残基前，从赖氨酸到丙氨酸突变的Pro-Gly氨基酸。
例如，构建具有来源于IgG 1亚类的铰链区、CH2和CH3结构域的huFcγ1-IL-7。在Fc融合蛋白的情况下，IgGγ1铰链区另外含有用第一个半胱氨酸替代丝氨酸的突变。在图4中描述了所编码的融合蛋白的序列(SEQ ID NO4)，而SEQ ID NO22中的序列编码载体的成熟huFcγ1主链。
另外，根据上述方法产生包括YN到AQ二肽突变的Fcγ1-IL-7融合蛋白，所述突变消除Fc上的糖基化位点(对应于IgGγ1中的N297)以及潜在的免疫原性T细胞表位。在SEQ ID NO21中公开了huFcγ1(YN＞AQ)的成熟Fc主链序列。通过重叠PCR法首先将突变引入到Fc主链内，完成酪氨酸和天冬酰胺位置上的丙氨酸和甘氨酸的替代。使用两个重叠互补诱变引物以产生两个PCR片段，其在第二轮扩增中用作模板以产生含有适当密码子替换的单一片段。有义方向的诱变引物是5′-AGCAGGCCCAGAGCACGTACCGTGTGGT-3′(用下划线表示突变)(SEQ ID NO36)。互补链是5′-GTACGTGCTCTGGGCCTGCTCCTCCCGC-3′(SEQ ID NO37)。正向引物的侧翼是5′-CTCTCTGCAGAGCCCAAATCT-3′(SEQ ID NO38)，其也含有PstI位点。在反义方向中，反向引物的侧翼是5′CAGGGTGTACACCTGTGGTTC-3′(SEQ ID NO33)，其也含有BsrGI位点。扩增后，该序列通过标准方法进行证实，并且用BsrGI和PstI进行限制性酶切。然后将所得的片段替换Fc区的非突变片段。
也使用前述技术构建huFcγ2(h)(FN＞AQ)-IL-7。该融合蛋白包括来自IgGγ1亚类的经过改变的铰链区，而CH2和CH3结构域来自IgGγ2亚类。另外，包括FN到AQ的二肽突变以消除Fc上的糖基化位点(对应于IgGγ1中的N297)以及潜在的免疫原性T细胞表位。在图5中描述了所编码的融合蛋白的序列(SEQ ID NO5)。在SEQ ID NO19中显示成熟Fc主链huFcγ2(h)(FN＞AQ)的序列。
另外，产生包含Fc部分和IL-7部分之间柔性接头序列的Fc-IL-7融合蛋白。例如，插入具有序列GGGGSGGGGSGGGGS(接头1，SEQ IDNO34)的接头多肽。为了产生huFcγ1(接头1)-IL-7，在表达载体pdCs-huFc-IL-7唯一的SmaI位点通过钝性末端连接插入序列为5′-G GGTGCA GGG GGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGA TCC GGCGGG GGC TC-3′(SEQ ID NO18)的合成的寡核苷酸双链体，证实双链体的方向。设计正向引物使得由密码子所编码的氨基酸残基Pro-Gly跨越SmaI位点(C CCG GGT)(SEQ ID NO17)并且紧接着CH3区的Ala残基(由所编码的赖氨酸被丙氨酸替代所致)。在图6中显示所编码的融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO6)。
构建包含具有序列GGGGSGGGG(接头2，SEQ ID NO25)的较短的接头多肽的另外的Fc-IL-7融合蛋白。为了产生huFcγ1(YN＞AQ)(接头2)-IL-7，将用引物对5′-CCCGGGCGCCGGCGGTGGAGGATCAGGTGGTGGCGGTGATTGTGATATTGAAGGTAAAGATG-3′(含有所编码的接头序列，SEQ IDNO15)和5′-ATCATGTCTGGATCCCTCGA-3′(SEQ ID NO14)从适当的pdCs-Fc-IL-7模板质粒中扩增所获得的PCR产物克隆到pCRII载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，并且证实其序列。然后将编码接头2/IL-7的Xma I/Xho I消化的片段转移到同样处理的pdCs-huFc来源的表达载体中。将该载体进行修饰以含有SEQ ID NO21的成熟Fc主链huFcγ1(YN＞AQ)。在图7中显示所编码的融合蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO7)。
类似地，使用引物对5′-CCCGGGCGGTGGAGGATCAGGTGGTGGCGGTGATTGTGATATTGAAGGTAAAGATG-3′(SEQ ID NO16)和5′-ATCATGTCTGGATCCCTCGA-3′(SEQ ID NO12)产生huFcγ1(YN＞AQ，d)(接头2)-IL-7。huFc 1(YN＞AQ，d)(接头2)-IL-7与前面的融合蛋白huFcγ1(YN＞AQ)(接头2)-IL-7不同，因为其缺乏融合蛋白Fc部分末端的两个氨基酸残基。具体而言，Fc部分不是以序列…ATATPGA(SEQ ID NO11)终止，而是以序列…ATATP(SEQ IDNO10)结束。在图8中显示所编码的融合蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO8)。
实施例2Fc-IL-7融合蛋白的转染和表达使用电穿孔将编码上述IL-7融合蛋白的DNA引入到小鼠骨髓瘤NS/0细胞系中。为了进行电穿孔，在补充了10％热灭活的胎牛血清、2mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基中培养NS/0细胞。将约5×106细胞用PBS洗涤一次并在0.5ml PBS中重悬。然后在冰上将10μg线性化的编码huFcγ1-IL-7的质粒DNA与细胞在Gene Pulser杯(0.4cm电极间距，BioRad)中孵育10分钟。使用Gene Pulser(BioRad，Hercules，CA)，设置为0.25V和500μF进行电穿孔。允许细胞在冰上恢复10分钟，其后将它们在生长培养基中重悬并置于两个96孔板内。
转染后两天将细胞加到生长培养基中，通过它们在存在100mM氨甲蝶呤(MTX)时的生长情况选择稳定转染的克隆。将细胞每三天补充一次养料，补充两到三次以上，在2到3周出现MTX抗性克隆。通过抗Fc ELISA测定克隆的上清液以鉴定产生高产量IL-7融合蛋白的克隆。分离高产量克隆并在含有100nM MTX的生长培养基中繁殖。一般，使用无血清生长培养基，如H-SFM或CD培养基(Life Technologies)。
实施例3huFc-IL-7融合蛋白的生化分析使用常规SDS-PAGE鉴定以评估融合蛋白的完整性。研究huFc-IL-7变体huFcγ1-IL-7、huFcγ2(h)(FN＞AQ)-IL-7、huFcγ1(接头1)-IL-7、huFcγ1(YN＞AQ)(接头2)-IL-7和huFcγ1(YN＞AQ，d)-IL-7之间的差异。在A蛋白琼脂糖珠(Repligen，Needham，MA)上，从它们所分泌到的组织培养基中捕获从NS/0细胞中表达的huFc-IL-7融合蛋白，并在有或没有还原剂(如β-巯基乙醇)的蛋白质样品缓冲液中通过煮沸洗脱。将样品通过SDS-PAGE分离，通过考马斯染色显示蛋白条带。通过SDS-PAGE，测试的huFc-IL-7融合蛋白通常表达很好，因为它们在凝胶上基本上显示为单一条带；在包含接头的huFc-IL-7变体的样品中发现可能代表截短材料的第二条带明显减少。
也通过大小排阻层析(SEC)分析纯化的huFc-IL-7融合蛋白以评估huFc-IL-7变体聚集的程度。简言之，将细胞培养物上清液加到预先平衡的Fast-Flow A蛋白琼脂糖柱，将该柱在生理缓冲(如如中性pH的100mM磷酸钠、150mM NaCl)中彻底洗涤，在pH约2.5到3的上述同一盐缓冲液中洗脱结合的蛋白。立即中和级分。
发现对于所测试的每种融合蛋白来说，至少产物的50％是单体，通常超过65％。这里所用的“单体”指非聚集的蛋白质。应当理解的是具有Fc部分的蛋白质通常形成具有二硫键的复合物，其通常包括两个多肽链(除非在同一多肽内存在两个Fc部分)并且被认为是“单位-二聚体”。“单体”无意排除这种形成二硫键的种类，而是仅意味着该蛋白质是非聚集的。为了获得实际上是单体huFc-IL-7融合蛋白的制品(大约98％)，将从琼脂糖-A蛋白纯化的洗脱液加到制备型SEC柱(Superdex)上并收集单体峰级分。一般，所回收的蛋白质浓度是大约1mg/ml。如果需要的话，将样品浓缩，例如通过具有截断10-30kDa分子量的旋转透析(例如，VivaSpin)。
形成二硫键
IL-7在成熟IL-7蛋白序列的Cys2、Cys34、Cys47、Cys92、Cys129和Cys141位上含有六个可形成二硫键的Cys残基。通过测定存在于融合蛋白的IL-7部分中的二硫键的模式，评估huFcγ1-IL-7的折叠。简言之，从经胰酶消化的材料中产生huFcγ1-IL-7的肽图并且分析是否存在信号(signature)肽片段。用胰酶消化天然形式的或者还原和烷化后的huFcγ1-IL-7蛋白。为了计算可被糖基化的肽片段，在胰蛋白酶消化前，将天然的和变性蛋白的样品另外用PNGaseF进行处理以除去糖基链。将肽片段通过HPLC进行分离，通过质谱测定它们的质量。
在Fcγ1-IL-7的情况中，预计含有二硫键Cys47-Cys141(“3-6”)的肽片段将具有1447.6的质量，而预计含有二硫键Cys2-Cys141(“1-6”)的肽片段将具有1426.6的质量。类似地，预计含有二硫键Cys34-Cys129(“2-5”)的肽片段将具有2738.3的质量。的确，无论样品是否用PNGaseF处理过，在来自天然Fc-IL-7蛋白的样品中鉴定了质量为1447.6(“3-6”)和2738.3(“2-5”)的肽片段，但是在还原的Fc-IL-7的样品中没有鉴定出。相反，在任何样品中都没有发现质量为1426.6(“1-6”)的肽片段。因此，Fcγ1-IL-7含有二硫键Cys47-Cys141和Cys34-Cys129，但是不含二硫键Cys2-Cys141。注意到仅在用PNGaseF处理过的天然融合蛋白的样品中，鉴定了与含有Cys2-Cys92(“1-4”)的片段对应的预计质量为2439.2的肽片段。实际上，Cys92位于三肽基序Asn91Cys92Thr93内，表明在huFcγ1-IL-7中Asn91被糖基化。因此，在huFcγ1-IL-中二硫键的模式与Cys2-Cys92、Cys34-Cys129和Cys47-Cys141一致。此实验确定的Fc-IL-7链二硫键的构型与所报道的实验确定的由细菌产生并重折叠的IL-7的构型(Cosenza等(1997)JBC27232995)相反。
N-连接的糖基化位点人IL-7在成熟IL-7蛋白序列的Asn70、Asn91和Asn116位上含有三个潜在的糖基化位点。分析huFcγ1-IL-7(还有的/烷化的)的肽图中是否存在信号肽片段。如果被糖基化，这些信号片段将仅在用PNGaseF处理的样品中显现。预计含有未修饰的Asn70、Asn91和Asn116残基的胰蛋白酶肽片段的质量分别为1489.7、1719.9和718.3。
的确，在已用PNGaseF处理的样品中鉴定了质量为1489.7和1719.9的肽片段，但是在未处理的样品中缺乏，表明Asn70(包含在序列...MNSTG...中)(SEQ ID NO31)和Asn91(包含在序列...LNCTG...中)(SEQID NO32)的确被糖基化。令人惊奇地，既在PNGaseF处理过的样品中也在未处理过的样品中鉴定了质量为718.3的胰蛋白酶片段，与SLEENK(SEQ ID NO35)对应，表明Asn116没被糖基化。这是出乎意料的，因为预测人IL-7序列...PTKSLEENKSLKE...(SEQ ID NO13)(见SEQ IDNO1)中的Asn116是N-连接的糖基化位点。NKS推定的糖基化位点在绵羊和母牛以及人中是保守的。
用Fcγ1-(接头1)-IL-7和Fcγ2h(FN＞AQ)-IL-7的样品重复进行的二硫键模式和N-连接的糖基化位点的分析，得到类似的结果。
实施例4ELISA法通过下面详细描述的抗huFc ELISA，测定MTX抗性克隆和其它测试样品上清液中的蛋白产物浓度。ELISA板用溶于PBS的5μg/mLAffiniPure山羊抗人IgG(H+L)(Jackson Immune Research Laboratories，West Grove，PA)在96孔板中以100μL/孔包被。覆盖包被的平板并在4℃过夜孵育。平板用溶于PBS的0.05％Tween(Tween 20)洗涤4次，并用溶于PBS的1％BSA/1％山羊血清以200μL/孔封闭。在37℃用封闭缓冲液孵育2小时后，将平板用溶于PBS的0.05％Tween洗涤4次并轻叩干燥。将测试样品在样品缓冲液(溶于PBS的1％BSA/1％山羊血清/0.05％Tween)中适当稀释。使用已知浓度的嵌合抗体(具有人Fc)制备标准曲线。为了制备标准曲线，在样品缓冲液中制备系列稀释液以产生从125ng/mL到3.9ng/mL范围的标准曲线。将经过稀释的样品和标准加到平板中，100μL/孔，并将平板在37℃孵育2小时。孵育后，将平板用溶于PBS的0.05％Tween洗涤8次。向每个孔中加入100μL偶联辣根过氧化物酶的抗人IgG的第二抗体，在样品缓冲液中稀释到大约1∶120,000。对于每批偶联HRP的抗人IgG，测定第二抗体的准确稀释度。在37℃孵育2小时后，将平板用溶于PBS的0.05％Tween洗涤8次。
向平板中以100μL/孔加入底物溶液。通过将1片30mg OPD(二盐酸邻苯二胺(OPD))溶于15mL 0.025M枸橼酸/0.05M Na2HPO4缓冲液(pH 5)，制备该溶液，其含有0.03％新添加的过氧化氢。室温下在黑暗中显色约30分钟。通过以100μL/孔添加4N硫酸终止反应。平板通过平板读数器读取，将其设置为490和650nm，并且按程序从490nm的OD中减去650nm的背景OD。
基本上根据上述方法，通过ELISA测定用huFc-IL-7融合蛋白或重组人IL-7处理的动物血清样品中的人IL-7的浓度。通过小鼠抗人IL-7抗体(R&D Systems，Milmeapolis，MN)获得人IL-7，并用山羊抗人IL-7生物素抗体(R&D Systems，Mimeapolis，MN)检测。
实施例5hFc-IL-7蛋白的纯化基于Fc蛋白部分对A蛋白的亲和力，进行含有Fc融合蛋白的标准纯化。简言之，在组织培养基中生长表达适当融合蛋白的NS/0细胞，收集含有所表达蛋白的上清液并加到预先平衡的Fast-Flow A蛋白琼脂糖柱上。然后将柱用缓冲液(如中性pH的100mM磷酸钠、150mM NaCl)彻底洗涤。在上述同一缓冲液中以低pH(pH 2.5-3)洗脱结合的蛋白并立即中和级分。
为了获得非聚集的huFc-IL-7融合蛋白制品(大约98％的单体)，将洗脱液加到制备型SEC柱(Superdex)上并收集单体峰级分。一般，所回收蛋白的浓度大约0.5mg/ml到2mg/ml，其中通过旋转透析(例如，截获30kDa分子量的Viva Spin)浓缩适当的样品。
实施例6
huFc-IL-7蛋白的体外活性在细胞增殖生物测定中体外测定纯化的huFc-IL-7融合蛋白的细胞因子活性。通过PHA-P活化人PBMC(外周血单核细胞)以产生对IL-7反应的细胞。在标准胸苷掺入试验中测量增殖。简言之，将PBMC首先与10mg/ml PHA-P孵育5天，洗涤细胞，然后在补充了一系列稀释的huFc-IL-7融合蛋白的培养基中孵育，总共48小时。在最后的12小时期间，将样品用0.3μCi的[甲基-3H]胸苷(Dupont-NEN-027)进行脉冲。然后将细胞彻底洗涤，收获并溶解到玻璃滤器上。在闪烁计数器中测量掺入到DNA中的3H-胸苷。测定作为标准的，购自R&D Systems(Minneapolis，MN)或National Institute for Biological Standards and Control(NIBS)的野生型huIL-7蛋白。
从根据标准技术绘制的剂量反应曲线中获得huFc-IL-7融合蛋白的细胞增殖的ED50值，确定导致半最大反应的蛋白质浓度。评估融合蛋白huFcγ1-IL-7、huFcγ2(h)(FN＞AQ)-IL-7和huFcγ1(接头1)-IL-7。融合蛋白的ED50值彼此相当相似，落在彼此的3倍范围内。因此，发现Fc部分中的这些改变对融合蛋白的IL-7活性几乎没有影响。
另外，发现这些融合蛋白的ED50值高于购自R&D Systems的huIL-7的ED50值的3到10倍。由于这种商品化的制品是在细菌中生产的并且没有被糖基化，因此评估通过用PNGaseF处理的酶促去糖基化的huFcγ1-IL-7蛋白。发现其与未处理形式具有相似的活性。不希望受理论束缚，稍微降低的融合蛋白的活性可能不是由于IL-7部分的糖基化作用，而是由于受限制的IL-7部分的N末端所致的空间效应。
实施例7huFc-IL-7蛋白的药代动力学评估huFc-IL-7融合蛋白和重组人IL-7(Peprotech，Rocky Hill，NJ)的药代动力学(PK)谱，结果描述于图13。向C57BL6/J小鼠组进行一次性皮下注射等摩尔量的huFcγ2(h)(FN＞AQ)-IL-7或重组人IL-7(50毫克)。在注射时(即在t＝0分钟)和在注射后30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24、48、72、96、120以及144小时，通过眼眶取血获得血液样品。将样品收集到在肝素化试管中以防止凝固，通过在高速Eppendorf微量离心机中以12,500g离心4分钟去除细胞。用PK溶液2.0TM软件包(SummitResearch Services，Montrose，CO)计算PK值。
通过对人IL-7特异的ELISA，测定每个时间点上一式四份血浆样品中所给予的IL-7的浓度。发现huFc-IL-7和重组IL-7的药代动力学行为显著不同。对于重组人IL-7，最高浓度(Cmax)是在注射后2.0小时(Tmax)的23.5ng/ml，而对于huFc-IL-7，Cmax是在注射后24小时的1588.7ng/ml。另外，尽管吸收重组人IL-7快于huFc-IL-7(β相半寿期为0.9小时对12.4小时)，但是在β相期间从循环中消除huFc-IL-7要比重组人IL-7慢大约9倍。因此，根据作为总药物接触测量值的AUC(曲线下面积)，接受huFc-IL-7的小鼠接触的所施用蛋白比接受重组人IL-7的小鼠高572倍。这些数据证明，huFc-IL-7融合蛋白的PK相对于游离的重组人IL-7显著提高。进一步发现，通过静脉内注射施予小鼠的huFc-IL-7融合蛋白，如huFcγ1-IL-7和huFcγ2(h)(FN＞AQ)-IL-7、huFcγ1(YN＞AQ)(接头2)-IL-7以及huFcγ1(YN＞AQ，d)(接头2)-IL-7的PK分布图彼此相似。
实施例8骨髓(BM)移植后huFc-IL-7在淋巴细胞减少的小鼠中的功效在体内评价huFc-IL-7融合蛋白与重组人IL-7的功效。例如，T细胞耗尽的骨髓(BM)的移植术后，向淋巴细胞减少的小鼠施用huFcγ2(h)(FN＞AQ)-IL-7或重组人IL-7(Peprotech，Rocky Hill，NewJersey)，评估免疫细胞群的恢复。
基本上，在BM移植前以4小时间隔对受体小鼠进行两剂600cGy全身照射的剂量致死性照射，将在PBS中重悬的BM细胞注入受体小鼠的尾静脉。从前面的第5天开始，以规律的间隔向受体小鼠通过皮下施用等摩尔量的huFc-IL-7(7μg)或重组人IL-7(2.5μg)(Peprotech，Rocky Hill，NJ)。在整个试验期间，采集受体小鼠的血液样品，测量标本中的淋巴细胞浓度。
对于BM细胞移植，从BL/6.SJL (H2b，CD45.1)小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)的股骨和胫骨中无菌获得BM细胞，并在MACS柱(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)上通过除去磁性标记的T细胞而排除T细胞。用荧光标记的抗CD45、αβ-TCR(T细胞)和7-氨基放线菌素D(7-AAD，凋亡细胞)(Calbiochem，X)的抗体，通过FACS分析监测T细胞耗尽的程度。每个受体小鼠使用10×106活的(7-AAD阴性)BM细胞(含有低于1％的T细胞)。在同类系的BM移植中，使用B6(H2b，CD45.2)小鼠作为受体小鼠品系，在同种异体BM移植中选择B6C3F1(H2b/k，CD45.2)小鼠。
基本上根据Brocklebank和Sparrow(Brocklebank and Sparrow(2001)Cytometry46254)描述的方法测量淋巴细胞的浓度(如在表1中所示)。简言之，将荧光珠(TruCOUNTTMTubes，BD Biosciences，San Jose，CA)溶于40μl含有淋巴细胞特异性抗体混合物的PBS。随后，加入10μl抗凝血，混合并在黑暗中室温孵育30分钟。将红细胞在450μl红细胞裂解液(BD Biosciences，San Jose，CA)中裂解，样品通过流式细胞仪(BDFACSCaliburTM，BD Biosciences，San Jose，CA)分析。通过在淋巴细胞和荧光珠周围产生分离门(separate gate)并在每个门内读取事件的数量，测定特定淋巴细胞群(例如B细胞、T细胞或总白细胞)的浓度。通过将门控淋巴细胞区中的事件数除以门控珠区内的事件数，计算每微升进入门的淋巴细胞的数量。将该数乘以每个TruCOUNTTM管(由供应商提供)中珠的数量与样品体积的分数，最后乘以样品的稀释因子。
在一个实验中，在同类系的BM移植设置中评价淋巴细胞重建，使用上述具体的材料和方法。向受体小鼠注射7μg(125μgIL-7/kg体重)剂量的huFcγ2(h)(FN＞AQ)-IL-7，根据上述方法测量淋巴细胞。检测到供体淋巴为CD45.1阳性细胞，而检测到受体小鼠的内源性淋巴细胞为CD45.2阳性细胞。分别使用B220和CD3淋巴细胞标记物鉴定B淋巴细胞和T淋巴细胞。发现到49天时，供体淋巴细胞(CD45.1阳性细胞)已使受体小鼠的种群恢复到与非照射的对照小鼠同等水平，而内源性淋巴细胞(CD45.2阳性细胞)没有显著扩增。另外，用huFc-IL-7融合蛋白的处理不导致显著的毒性。这些结果证明融合蛋白有效扩增过继转移的淋巴细胞群。这些结果描述于图16。
在另一个实验中，使用可更好模拟临床移植背景的同种异体BM移植模型，比较huFc-IL-7融合蛋白与重组人IL-7，结果显示于表1。再次使用上述方法和材料。从移植后第5天到第56天，每隔一天(q2d)或每周一次(q7d)施用huFcγ2(h)(FN＞AQ)-IL-7和人IL-7(等同125μg IL-7/kg体重)。PBS处理的供体小鼠和经过照射的、用PBS处理的骨髓受体小鼠作为对照。
在用融合蛋白处理的受体小鼠中，当分别给予q2d或q7d时，移植后14或16天来自供体的B细胞(CD45.1+、B220+、CD19+)达到基线水平(由供体对照小鼠中B细胞血液浓度定义)。相反，在用重组人IL-7处理的受体小鼠中，两个剂量方案都没有产生效果；在用PBS处理的和用人IL-7处理的受体小鼠中B细胞数量需要在大约相同的时间(约28天)达到基线水平。除了加速B细胞重建，huFc-IL-7处理促进B细胞连续扩增到第33天与对照小鼠相比，q2d施用huFc-IL-7导致B细胞数量增加7倍，而q7d施用导致增加2.5倍。第33天后，B细胞数量下降，但是仍然比对照小鼠高大约2倍。而且，第33天后，血液中所施用的IL-7蛋白的水平下降，其部分可能是由于形成中和人融合蛋白的抗体所致。图14表示在用重组人L-7和huFC-IL-7处理过的经照射的骨髓移植的小鼠中B细胞重建的这些结果。
在关于来自供体的T细胞(CD45.1+、CD3+、TCRαβ+)中观察到了类似的结果。用huFc-IL-7融合蛋白的处理导致加速T细胞重建，而用重组人IL-7的处理则没有。在大约第49天达到最大T细胞水平。然而，用huFc-IL-7融合蛋白的q2d给药方案，T细胞数量仅达到基线以上(即供体小鼠血液中的T细胞浓度)，达到对照小鼠中T细胞数量的约1.5倍。图15表示在用重组人IL-7和huFc-IL-7处理的经照射的骨髓移植小鼠中T细胞重建的这些结果。
尽管在某种情况下在受体小鼠中有短暂高数量的供体B细胞和T细胞，但是在实验期间没有一只实验小鼠显示任何发病的迹象。在第55天，内部器官的分析在肝、肾、肺、脾、胸腺、淋巴结、胃、小肠和结肠中没有显示病理学异常。因此，该同种异体移植实验证明重度骨髓抑制后，huFc-IL-7融合蛋白在体内重建淋巴细胞中显著优于重组人IL-7。
表1huFc-IL-7融合蛋白对免疫细胞重建的效果。
每微升血中的细胞数处理天I.供体来源的 713 192733414755白细胞(CD45.1+)a.)同种异体PBSAVG 580.83576.8 4384.016805.6 20732.8 16395.2 21462.4 20329.6骨髓移植(BMT)到B6C3 SEM 324.51717.0 1474.28367.610065.3 7997.311230.2 9693.2小鼠中 huFc-IL-7，AVG 248.826597.0 130253.6 148048.0 194266.4 168794.0 127848.0 79175.2q2dSEM 89.3 4786.2 25106.8 18786.3 17131.1 25949.9 981.0 10740.2huFc-IL-7，AVG 278.45848.8 32308.0 64256.0 74103.2 69042.4 55989.6 58519.2q7dSEM 106.3762.92786.36081.48345.914497.4 5989.86583.8人IL- AVG 270.76020.0 6922.724278.7 37353.3 42166.7 33570.7 38138.77，q7dSEM 84.9 1229.2 1089.75235.32697.04691.4764.5 3273.6人IL- AVG 229.04603.0 4963.027443.0 27027.0 27797.0 32675.0 33205.07，q7dSEM 31.9 435.6654.1 2513.81813.44084.66307.84894.7b.)B6.SJL PBSAVG 30744.5对照小鼠 SEM 3018.6每微升血中的细胞数处理天II.供体来源的B细胞 713 192733414755(CD45.1+CD19+R220+)a.)同种异体PBSAVG 32.0 1013.3 4257.319294.7 22549.3 17842.7 23841.3 22296.0骨髓移植到B6C3SEM 5.7 25.7 661.1 2858.52625.41691.63783.71474.5小鼠中 huFc-IL-7，AVG 16.0 17830.0 122122.4 131862.4 169745.6 142972.0 98571.0 58661.6q2dSEM 5.7 3755.4 24028.4 16974.5 15413.6 22834.6 2599.19352.9
huFc-IL-7，AVG 14.4 2559.0 28124.0 53573.6 59999.2 52932.8 41489.6 42899.2q7dSEM 6.5 408.9 2464.1 4911.5 6337.210998.2 4821.1 5013.0人IL- AVG 5.3 1550.7 4316.0 17802.7 28061.3 30177.3 24720.0 26104.07，q7dSEM 3.5 403.5 542.73689.5 1484.52861.6 633.82085.3人IL- AVG 4.0 748.0 3179.0 19303.0 19203.0 17930.0 22460.0 21473.07，q7dSEM 1.6 56.1443.31666.1 1429.52511.6 4458.6 3199.5b.)B6.SJLPBSAVG 15572.6对照小鼠SEM 1631.4每微升血中的细胞数处理 天III.供体来源的T细胞 713 19 27 3341 47 55(CD45.1+CD3+abTCR+)a.)同种异体 PBSAVG 0.0 206.7 192.01808.0 3928.04453.3 6178.7 5622.7骨髓移植到R6C3小鼠中 SEM 0.0 121.6 46.2 245.0 546.7533.0 538.1210.0huFc-IL-7，AVG 0.0 124.0 839.05260.8 12252.8 15204.8 16628.0 13365.6q2dSEM 0.0 24.9155.51183.1 1734.8 1641.21524.5 1423.9huFc-IL-7，AVG 0.0 38.4228.02428.0 5492.0 9988.09252.8 8598.4q7dSEM 0.0 6.1 38.5 326.2 918.12475.82748.6 1185.9人IL- AVG 0.0 56.0144.01057.3 3068.0 5368.05081.3 7112.07，q7dSEM 0.0 3.3 42.5 160.1 154.0645.5 113.7409.9人IL- AVG 0.0 41.088.0 1493.0 2579.0 3918.05021.0 6043.07，q7dSEM 0.0 2.5 20.2 187.5 238.0694.6 724.21013.1b.)B6.SJLPBSAVG 10832.0对照小鼠SEM 1500.4实施例9在淋巴细胞减少的小鼠中huFc-IL-7对T细胞移植的效力也在T细胞移植模型中评估了huFc-IL-7融合蛋白的效力。大体上，将T细胞的同种(克隆)群转移到免疫缺陷的、照射过的小鼠中，向受体小鼠施用huFc-IL-7融合蛋白，评价T细胞重建的程度以及最终评估T细胞功能。
为了获得同质的T细胞群，从缺乏B细胞的P14 TCR-tg/RAG小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)中采集脾细胞。另外，这些小鼠的所有T细胞表达转基因的T细胞受体(TCR)——P14，其对病毒表位(LCMV的gp33)具有特异性。
将脾细胞的单细胞悬液静脉内注射到移植前4小时已用650Rads(亚致死剂量)照射过一次的RAG Cγ+免疫缺陷小鼠(Charles RiverLaboratories)的尾部。从第2天开始隔天向受体小鼠施用7μg融合蛋白huFcγ2(h)(FN＞AQ)-IL-7。对照组的受体小鼠施予PBS。通过流式细胞仪测量血液中是否存在P14T细胞(CD8+Vβ8.1+Vα2+细胞)，测定在对huFc-IL-7融合蛋白或PBS的反应中T细胞重建的程度。
发现在第35天，与对照小鼠(2,000细胞/μl)相比，施用huFc-IL-7融合蛋白的小鼠T细胞数量增加17倍(35,000细胞/μl)。的确，T细胞重建的水平超过在未处理的P14TCR小鼠中见到的水平(23,000细胞/μl)。另外，在这些huFc-IL-7处理的小鼠中，上调了重建的T细胞的重要部分——细胞表面上的IL-2Rα受体亚基CD25。因此，不仅huFc-IL-7融合蛋白可用于扩增移植的T细胞，而且另外可预先处理移植的T细胞使其对细胞因子(如IL-2)反应。
实施例10无免疫应答患者的huFc-IL-7佐剂治疗设想了许多患者可能受益于huFc-IL-7佐剂治疗的临床情况。例如，正在研发新的治疗模式用于患有恶性疾病(如淋巴细胞白血病或髓性白血病)的儿科患者，其在重度骨髓抑制治疗后，通过同种异体造血干细胞移植以重建免疫系统。
为了显著增加用于这些患者的潜在的供体库，已经发现由G-CSF从匹配的无关供体或者具有1-3HLA基因座错配的单倍同一性供体中动员的外周血干细胞(PBSC)可能是细胞的来源，条件是移植体中没有T细胞(见Handgretinger等(2001)Annals NY Acad.Sciences938340-357)。这种排除显著降低急性移植物抗宿主移植排斥(GvHD)的发生；然而，据信由于低浓度的T细胞，因此免疫重建显著延迟。患者在移植后的至少前6个月有病毒感染的高风险，并且T细胞没有回到正常水平达一年(Handgretinger等，(2001)Annals NY Acad.Sciences938340-357；Lang等，(2003)Blood1011630-6)。因此，在这些患者中增加T细胞和其它免疫细胞种群的恢复率是有利的。
将得益于huFc-IL-7治疗的患者包括患有儿童期白血病的患者，如淋巴细胞白血病或髓性白血病的患者。患有这种紊乱的儿童将首先经历重度骨髓移植的治疗，其可能是基于化疗剂马利兰(busulfan)或结合化疗的全身照射。例如，根据患者的诊断和年龄，患者用全身照射(一般6次治疗，每次2Gy)、兔抗胸腺细胞球蛋白(每天10mg/kg，共3天)、依托泊苷(etoposide)(40mg/kg)以及环磷酰胺(120mg/kg)进行治疗。
为了获得用于移植的CD34阳性(pos)干细胞，共6天每天施用10微克/kg的G-CSF来动员组织相容性(同种异体)供体的外周血干细胞(PBSCs)，并在第5和第6天通过白细胞除去法收获。通常，获得并移植约20×106/kg CD34pos干细胞。在SuperMACS系统(磁性活化的细胞分选，Miltenyi Biotec)中通过用抗CD34抗体的阳性选择，从PBSCs中纯化CD34pos干细胞并洗脱。T细胞排除一般是在约5log到约10×103细胞/kg。通过FACS分选从移植物中排除聚合体和其它碎片。将细胞悬液通过中央静脉导管注入到患者中。另选地，移植物可包括纯化的其它免疫细胞群，如单倍同一性的NK细胞、DC、单核细胞以及CD34neg干细胞。
为了评估移植，进行绝对的中性粒细胞计数。一旦中性粒细胞水平保持50细胞/微升以上，则认为移植是成功的。通过FACS分析监测免疫细胞的重建，首先每周一次，一旦T细胞恢复开始，则每3个月一次。
为了增进免疫重建，患者用huFc-IL-7融合蛋白如huFcγ2h(FN＞AQ)-IL-7或huFcγ1(YN＞AQ)(接头2)-IL-7进行治疗。移植后大约3周(或者建立移植后)，患者接受皮下给予约1.5mg/m2剂量(或者0.15mg/m2到15mg/m2范围内的剂量)的huFcγ2h(FN＞AQ)-IL-7或huFcγ1(YN＞AQ)(接头2)-IL-7，约每周两次，共6到12个月，直到T细胞计数达到正常水平的50％。发现由于降低了病毒感染的风险(一种主要的移植后并发症)，而改善了患者的预后。进一步发现该治疗没有显著增加急性GvHD的风险。
除了施用huFc-IL-7蛋白，最佳地预防性施予其它药物。这些包括，例如阿昔洛韦、甲硝唑、flucanazole和复发新诺明。对于前3个月，可能每周给予患者免疫球蛋白以及G-CSF。
权利要求
1.包含直接或者通过接头分子连在一起的免疫球蛋白链和IL-7分子的IL-7融合蛋白，其与野生型IL-7相比是经过修饰的，其中IL-7中的修饰是(i)70和91位上的氨基酸残基是糖基化的，116位上的氨基酸残基是非糖基化的；和/或(ii)在IL-7部分内，在Cys2和Cys92、Cys34和Cys129、以及Cys47和Cys141之间有二硫键。
2.权利要求1的IL-7融合蛋白，其中IL-7的70和91位的氨基酸残基是糖基化的，IL-7的116位的氨基酸残基是非糖基化的，在IL-7部分内在Cys2和Cys92、Cys34和Cys129、以及Cys47和Cys141之间有二硫键。
3.权利要求1的IL-7融合蛋白，其中116位的氨基酸残基是天冬酰胺。
4.权利要求1的IL-7融合蛋白，其中116位的氨基酸残基是非糖基化的。
5.权利要求1的IL-7融合蛋白，其中改变116位的氨基酸残基使得其不作为糖基化位点。
6.权利要求1的IL-7融合蛋白，其中IL-7分子包含缺失。
7.权利要求6的IL-7融合蛋白，其中截短的IL-7包含从SEQ ID NO1的96位氨基酸到114位氨基酸的18个氨基酸缺失。
8.权利要求1的IL-7融合蛋白，其中IL-7分子是人IL-7。
9.权利要求1的IL-7融合蛋白，其中IL-7是成熟的IL-7部分。
10.权利要求1-9中任一项的IL-7融合蛋白，其中免疫球蛋白链包含至少恒定结构域的一部分。
11.权利要求10的IL-7融合蛋白，其中恒定结构域选自CH1、CH2和CH3。
12.权利要求10或11的IL-7融合蛋白，其中恒定结构域是IgG1恒定结构域。
13.权利要求12的IL-7融合蛋白，其中IgG1恒定结构域的Asn297被修饰。
14.权利要求13的IL-7融合蛋白，其中Asn297修饰是Asn297Gln。
15.权利要求13的IL-7融合蛋白，还包含Tyr296的修饰。
16.权利要求15的IL-7融合蛋白，其中Tyr296修饰是Tyr296Ala。
17.权利要求10或11的IL-7融合蛋白，其中恒定结构域是IgG2恒定结构域。
18.权利要求17的IL-7融合蛋白，其中IgG2链包含IgG1铰链。
19.权利要求17或18的IL-7融合蛋白，其中IgG2恒定结构域的Asn297被。
20.权利要求19的IL-7融合蛋白，其中Asn297修饰是Asn297Gln。
21.权利要求19的IL-7融合蛋白，还包含Phe296的修饰。
22.权利要求21的IL-7融合蛋白，其中Phe296修饰是Phe296Ala。
23.前术权利要求中任一项的IL-7融合蛋白，其中融合蛋白的IL-7部分与野生型IL-7相比具有增强的生物学活性。
24.分离的DNA分子，其编码根据权利要求1-23中任一项的IL-7融合蛋白。
25.培养的宿主细胞，其包含权利要求24的DNA。
26.制备融合蛋白的方法，其包括用权利要求24的DNA转化宿主细胞，培养该宿主细胞并表达和收获IL-7融合蛋白。
27.适于治疗免疫紊乱或癌症的药物组合物，其包含药学上有效量的权利要求1-23中任一项的IL-7融合蛋白，任选包含可药用载体、稀释剂或赋形剂。
28.权利要求1-23中任一项IL-7融合蛋白的用途，用于制备治疗免疫缺陷和癌症的药物。
全文摘要
本发明涉及白介素－7(IL－7)融合蛋白、它们的生产方法及其用途。该融合蛋白包含直接或间接与IL－7融合的免疫球蛋白部分，为了改善生物学和药学性质，相对于野生型IL－7将其在特异位点进行修饰。本发明的蛋白质在治疗伴有免疫缺陷的紊乱中，特别是在治疗涉及T细胞缺陷的疾病中特别有用。
文档编号C12N15/62GK1898262SQ200480038907
公开日2007年1月17日 申请日期2004年12月21日 优先权日2003年12月30日
发明者S·劳德, S·D·吉利斯 申请人:默克专利有限公司