专利名称：性病混合感染pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术，特别是同步检测性病混合感染的聚合酶链式反应试剂盒，简称性病混合感染PCR检测试剂盒。
背景技术：
性传播疾病(性病)是一类主要通过已感染与未感染者之间的性接触而传播的疾病。在我国性病已成为上升幅度最快的传染病之一，性病的发病率、发现的性病病原体的种类及与其他传染病有关的问题不断增加，性病的频发也显著加快了艾滋病的传播速度。目前已发现的可经性途径传播的病原体已由原来的4种扩展为现今的20余种，包括细菌、真菌、病毒、衣原体、支原体、螺旋体、寄生虫等7大类。据估计，大约有50％的性病感染者无症状，若诊断延误或治疗不及时不仅会成为重要的传染源，加速性病的传播，而且会导致并发症和后遗症的发生，造成慢性炎症、不孕不育甚至癌变等。随着性病的增多，混合感染的问题也越来越严重，混合感染通常以一种性病临床表现和症状比较典型，而其他一种或几种性病的症状较隐匿，极易造成漏诊漏治。
采取强有力的行为干预措施积极预防病原体的传播是阻断传染病发生与流行的有效手段，而快速准确地甄别病原体携带者是实施有效的预防和治疗的前提，对于降低性病尤其是艾滋病在我国的流行具有积极意义。传统上，性病病原学诊断方法包括培养法和非培养法。培养法敏感、特异，是某些性病筛查的标准方法，但培养法耗时长、对标本的采集与运送都有较高的要求、且某些病原体难以或尚不能进行体外培养(如人乳头瘤病毒)。非培养法(如涂片镜检、血清学试验等)方便，但敏感性低，对于症状不明显或无症状感染者难以检出。聚合酶链式反应(PCR)技术结合了培养法与非培养法的优点具有更高的敏感性与特异性，能够进行感染早期或无症状感染等病原体载量较低的检测；标本采集方便，可使用非侵入性标本(如患者自取的阴道或外阴标本、尿液等)；对标本运送条件要求不高；检测快速。目前国内已开发出来的PGR检测试剂盒均为一病一盒，不利于混合感染性病的筛查。
发明内容
本发明的目的旨在克服现有技术的不足而提供一种检测快速、对标本运送条件要求不高、标本采集方便、具有更高敏感性与特异性，对多种STD病原体进行同步检测的性病混合感染PCR检测试剂盒。
本发明的目的是这样实现的一种性病混合感染PCR检测试剂盒，该检测试剂盒包括预处理液、扩增管和阳性模板，所述的阳性模板在血液型扩增管中为含乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、梅毒螺旋体、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒或其中任意组合或单种病原体的特定基因序列的质粒载体；在分泌液型扩增管中为含白色念珠菌、解脲支原体、淋球菌、沙眼衣原体或其中任意组合或单种病原体的特定基因序列的质粒载体。
——所述的预处理液为0.1-1.0mol/L氢氧化钠溶液。
——所述的扩增管分为血液型或/和分泌液型。
——所述的扩增管由DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸、缓冲液、镁离子、混合引物和水组成。
——所述质粒载体的特定基因序列为以下所列基因或其中任意组合血液型的乙型肝炎病毒S基因、人免疫缺陷病毒gag基因、人乳头瘤病毒主要农壳蛋白L1基因、梅毒螺旋体TP0574基因、人巨细胞病毒UL123基因、单纯疱疹病毒UL30基因；分泌液型的白色念珠菌自主复制序列、解脲支原体脲酶复合体ureB基因ureC基因、淋球菌B蛋白基因、沙眼衣原体DRP3基因。
——所述的扩增管中的混合引物在血液型中为针对乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、梅毒螺旋体、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒或其中任意组合或单种病原体的特异序列而设计的引物；在分泌液型中为针对白色念珠菌、解脲支原体、淋球菌、沙眼衣原体或其中任意组合或单种病原体的特异序列而设计的引物。
——所述的混合引物为以下所列核苷酸或含其中核苷酸序列，N代表4种任意脱氧核苷三磷酸；(1)血液型乙型肝炎病毒5’-NNNNNCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCCGGANNNNN-3’5’-NNNNNTAGGGTTTAAATGTATACCCAAAGNNNNN-3’人免疫缺陷病毒5’-NNNNNAGAGGATCCAGGGGCAAATGGTANNNNN-3’5’-NNNNNTCCCGGTACCTGTCATGCTGTCANNNNN-3’人乳头瘤病毒5’-NNNNNGTGGGGGAACCTGTGCCTGATNNNNN-3’5’-NNNNNTGTACCATTTGGGGGAGGCGANNNNN-3’梅毒螺旋体5’-NNNNNTTAGTAACGCTTGGGTCAGTCNNNNN-3’5’-NNNNNTTGTTGGTTGTAGGCTGTGGCNNNNN-3’人巨细胞病毒5’-NNNNNAGCCATTGGTGGTCTTAGGGANNNNN-3’5’-NNNNNTTGGGCTAACTATGCAGAGCANNNNN-3’单纯疱疹病毒5’-NNNNNCCACCTGACGGTGTATTACAANNNNN-3’5’-NNNNNGCGCGACCGTCTCCTCTACCTNNNNN-3’
(2)分泌液型白色念珠菌5’-NNNNNTAGCGATGAGGTAGTGCAAGNNNNN-3’5’-NNNNNGCTGCAGCTACGATTGTTAGNNNNN-3’解脲支原体5’-NNNNNTCCAGGTAAATTAGTACCAGGNNNNN-3’5’-NNNNNTCTCCTAATCTAACGCTATCANNNNN-3’淋球菌5’-NNNNNGCTACGCATACCCGCGTTGCTNNNNN-3’5’-NNNNNCGAAGACCTTCGAGCAGACATNNNNN-3’沙眼衣原体5’-NNNNNAGCACTCCAATTTCTGACTGTNNNNN-3’5’-NNNNNTCGATGATTTGAGCGTGTGTANNNNN-3’本发明是一种对10种性病病原体——乙型肝炎病毒(HBV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1)即艾滋病病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、梅毒螺旋体(TP)、人巨细胞病毒(HCMV)、单纯庖疹病毒(HSV)、白色念珠菌(CA)、解脲支原体(UU)、淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)实现同步检测的联合PCR检测试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理-扩增-电泳检测结果。试剂盒的扩增管分为血液型(检测乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、梅毒螺旋体、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒)和分泌液型(检测白色念珠菌、解脲支原体、淋球菌、沙眼衣原体)两种，将10种性病病原体基因引物及PCR反应体系所需的试剂按血液型和分泌液型预先加入扩增管中，一人一份，无需分装，使用者只需将预处理后的样本加入扩增管启动扩增反应即可，从而避免操作过程中可能出现的交叉污染，简单快速地完成检测工作。本试剂盒对多种性病病原体进行同步检测，适合性病混合感染的筛查，单份样本一次反应即可检测多种病原体，克服了目前国内性病检测试剂盒尚不齐全，一病一盒的弊病。试剂盒灵敏性高，适合感染早期及无症状感染者的检测。试剂盒使用简单、检测快速，对于较大范围的感染人群或高危人群的普查以及传染源的检测均具有较高的使用价值。
试剂盒中的引物针对每种病原体的特异序列而设计，扩增产物特异性强，10种病原体扩增产物分子量大小呈梯度变化，清晰可辨。试剂盒还设有无感染的阳性模板，扩增产物对照检测，结果一目了然。
图2是本发明扩增管的分配制表。
图1是本发明性病样本的PCR产物分析图。
在图1中M为阳性分子量标准；1-4为不同样本扩增产物。
具体实施例方式
实施例1引物序列的设计
1)乙型肝炎病毒(hepatitis B virus)S(HBsAg)基因(155bp-835bp)及其上、下游部分序列56bp-841bp，片段长度786bp。
上游引物5’-CCTGCTGGTGGCTCCAGTTCCGGA-3’下游引物5’-TAGGGTTTAAATGTATACCCAAAG-3’2)人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type 1)gag基因(790bp-2295bp)1216bp-1841bp，片段长度626bp。
上游引物5’-AGAGGATCCAGGGGCAAATGGTA-3’下游引物5’-TCCCGGTACCTGTCATGCTGTCA-3’3)白色念珠菌(Candida albicans)自主复制序列27bp-710bp，片段长度684bp。
上游引物5’-TAGCGATGAGGTAGTGCAAG-3’下游引物5’-GCTGCAGCTACGATTGTTAG-3’4)解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)脲酶复合体ureB基因(495-869bp)和ureC基因(908bp-2704bp)521bp-981bp，片段长度461bp。
上游引物5’-TCCAGGTAAATTAGTACCAGG-3’下游引物5’-TCTCCTAATCTAACGCTATCA-3’5)人乳头瘤病毒(human papillomavirus type 6b)主要衣壳蛋白L1基因(5789bp-7291bp)6575bp-7012bp，片段长度438bp。
上游引物5’-GTGGGGGAACCTGTGCCTGAT-3’下游引物5’-TGTACCATTTGGGGGAGGCGA-3’6)淋球菌(Neisseria gonorrheae)pJD1质粒；B蛋白基因(2912bp-3553bp)3141bp-3531bp，片段长度391bp。
上游引物5’-GCTACGCATACCCGCGTTGCT-3’下游引物5’-CGAAGACCTTCGAGCAGACAT-3’7)梅毒螺旋体(Treponema pallidum)TP0574基因(12870bp-14174bp)13810bp-14132bp，片段长度323bp。
上游引物5’-TTAGTAACGCTTGGGTCAGTC-3’下游引物5’-TTGTTGGTTGTAGGCTGTGGC-3’8)人巨细胞病毒(human cytomegalovirus)UL123基因外显子4(171006bp-172225bp)171800bp-172045bp，片段长度246bp。
上游引物5’-AGCCATTGGTGGTCTTAGGGA-3’下游引物5’-TTGGGCTAACTATGCAGAGCA-3’
9)沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)pLGV440隐蔽性质粒；DRP3基因(2225bp-3580bp)2544bp-2763bp，片段长度220bp。
上游引物5’-AGCACTCCAATTTCTGACTGT-3’下游引物5’-TCGATGATTTGAGCGTGTGTA-3’10)单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 2)UL30(DNA聚合酶)基因(63265bp-66987bp)66429bp-66544bp，片段长度116bp。
上游引物5’-CCACCTGACGGTGTATTACAA-3’下游引物5’-GCGCGACCGTCTCCTCTACCT-3’实施例2扩增管的组分配制扩增反应混合液的总体积为23μL，其组成如表1。
实施例3样品预处理与基因扩增将棉拭子放入500μl生理盐水中搅动，然后以12000r/min离心3min，弃上清，沉淀加入50μl预处理液，混匀，煮沸10min，12000r/min离心5min，取2μL上清添加至扩增反应管内，启动扩增反应。反应条件如下93℃3分钟变性；93℃45秒，55℃45秒，72℃1分钟共35个循环；72℃5分钟延伸。
实施例4结果检测直接从反应后的扩增管中取10μL加样，在含溴乙锭的1％琼脂糖凝胶上电泳(5V/cm，40分钟)，于紫外仪上观察，对照阳性分子量标准，若相应位置上出现条带则为该病原体阳性，如图1由图1可见样本3未检出病原体感染；样本1扩增产物条带大小为220bp，为沙眼衣原体(CT)单一感染；样本2与4两条扩增产物条带大小分别为391和220bp，为淋球菌(NG)与沙眼衣原体双重感染。
权利要求
1.一种性病混合感染PCR检测试剂盒，其特征在于该检测试剂盒包括预处理液、扩增管和阳性模板，所述的阳性模板在血液型扩增管中为含乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、梅毒螺旋体、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒或其中任意组合或单种病原体的特定基因序列的质粒载体；在分泌液型扩增管中为含白色念珠菌、解脲支原体、淋球菌、沙眼衣原体或其中任意组合或单种病原体的特定基因序列的质粒载体。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述的预处理液为0.1-1.0mol/L氢氧化钠溶液。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述的扩增管分为血液型或/和分泌液型。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述的扩增管由DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸、缓冲液、镁离子、混合引物和水组成。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述质粒载体的特定基因序列为以下所列基因或其中任意组合血液型的乙型肝炎病毒S基因、人免疫缺陷病毒gag基因、人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因、梅毒螺旋体TP0574基因、人巨细胞病毒UL123基因、单纯疱疹病毒UL30基因；分泌液型的白色念珠菌自主复制序列、解脲支原体脲酶复合体ureB基因ureC基因、淋球菌B蛋白基因、沙眼衣原体DRP3基因。
6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于扩增管中的混合引物在血液型中为针对乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、梅毒螺旋体、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒或其中任意组合或单种病原体的特异序列而设计的引物；在分泌液型中为针对白色念珠菌、解脲支原体、淋球菌、沙眼衣原体或其中任意组合或单种病原体的特异序列而设计的引物。
7.根据权利要求4和6所述的检测试剂盒，其特征在于混合引物为以下所列核苷酸或含其中核苷酸序列，N代表4种任意脱氧核苷三磷酸；(1)血液型乙型肝炎病毒5’-NNNNNCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCCGGANNNNN-3’5’-NNNNNTAGGGTTTAAATGTATACCCAAAGNNNNN-3’人免疫缺陷病毒5’-NNNNNAGAGGATCCAGGGGCAAATGGTANNNNN-3’5’-NNNNNTCCCGGTACCTGTCATGCTGTCANNNNN-3’人乳头瘤病毒5’-NNNNNGTGGGGGAACCTGTGCCTGATNNNNN-3’5’-NNNNNTGTACCATTTGGGGGAGGCGANNNNN-3’梅毒螺旋体5’-NNNNNTTAGTAACGCTTGGGTCAGTCNNNNN-3’5’-NNNNNTTGTTGGTTGTAGGCTGTGGCNNNNN-3’人巨细胞病毒5’-NNNNNAGCCATTGGTGGTCTTAGGGANNNNN-3’5’-NNNNNTTGGGCTAACTATGCAGAGCANNNNN-3’单纯疱疹病毒5’-NNNNNCCACCTGACGGTGTATTACAANNNNN-3’5’-NNNNNGCGCGACCGTCTCCTCTACCTNNNNN-3’(2)分泌液型白色念珠菌5’-NNNNNTAGCGATGAGGTAGTGCAAGNNNNN-3’5’-NNNNNGCTGCAGCTACGATTGTTAGNNNNN-3’解脲支原体5’-NNNNNTCCAGGTAAATTAGTACCAGGNNNNN-3’5’-NNNNNTCTCCTAATCTAACGCTATCANNNNN-3’淋球菌5’-NNNNNGCTACGCATACCCGCGTTGCTNNNNN-3’5’-NNNNNCGAAGACCTTCGAGCAGACATNNNNN-3’沙眼衣原体5’-NNNNNAGCACTCCAATTTCTGACTGTNNNNN-3’5’-NNNNNTCGATGATTTGAGCGTGTGTANNNNN-3’
全文摘要
本发明提供一种同步检测10种性病病原体——乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒即艾滋病病毒、人乳头瘤病毒、梅毒螺旋体、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、白色念珠菌、解脲支原体、淋球菌、沙眼衣原体的同步检测PCR试剂盒。试剂盒的扩增管分为血液型和分泌液型两种，使用者只需将预处理后的样本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速地完成检测工作。试剂盒能准确检测早期感染、潜伏感染、未知病原体和症状不明显的泌尿、生殖系统感染；且集成度高，一次可以检测10种性病病原体，适于混合感染的筛查；样本需要量小(微升级)，样本种类可为血液或生殖器(道)分泌液，成本低，敏感性高，操作简便，可杜绝交叉污染，适用于海关检疫、流行监测、医院筛查等。
文档编号C12Q1/68GK1865451SQ200510036099
公开日2006年11月22日 申请日期2005年7月26日 优先权日2005年7月26日
发明者曾庆平, 冯丽玲, 杨瑞仪, 符林春 申请人:广州中医药大学热带医学研究所