专利名称：根瘤菌与解磷芽孢杆菌共培养发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种共培养发酵方法，具体来说涉及一种根瘤菌与有解磷作用的巨大芽孢杆菌共培养发酵方法。
背景技术：
磷和氮都是植物生长发育所必需的重要营养元素。土壤中的磷绝大部分呈有机或无机磷化物状态，植物不能直接吸收，通过解磷菌就能将植物难以吸收利用的磷转化为植物可吸收利用的磷。空气中的氮则呈分子态，植物难以吸收，通过根瘤菌的固氮作用可以使植物充分吸收空气中的氮。因此根瘤菌和解磷菌的利用对于促进植物生长具有重要意义，如何将根瘤菌和解磷的巨大芽孢杆菌合二为一，是当前的研究热点。
目前传统工艺通常采用单菌株发酵后直接应用，按一定比例进行组合或混合施用。如果单菌株发酵后直接应用，就只能得到单一的固氮功能或解磷功能。单菌株发酵后按比例将两种菌进行组合或将两种菌混合施用，都需要增加混合的工序，因而容易造成污染。通过共培养发酵方法则能够产生增效作用，如在中国专利98124397.5中，发明者就是利用共培养发酵方法使固氮粪产碱菌与固氮巨大芽孢杆菌的作用得到增强。然而该发明只解决固氮问题，而用于根瘤菌和解磷巨大芽孢杆菌的共培养发酵方法则至今未有报道。而且因为根瘤菌较芽孢杆菌生长慢，如果按常规方法将这两种菌混合培养，存在着生长较快的芽孢杆菌压制根瘤菌的生长，最终必将导致其发酵液中芽孢杆菌数量很多而根瘤菌数量极少的现象。
相思是短周期工业用材树种，适应性广，耐干旱瘠薄，速生丰产，现已成为我国南方重要的速生丰产林和高效生态公益林树种。相思属含羞草亚科金合欢属树种，跟其它豆科植物一样，能与根瘤菌营共生固氮，将空气中植物不能吸收利用的分子态氮转化为植物能吸收利用的氨态氮，促进植物生长，豆科植物与根瘤菌共生固氮体系的固氮量约占全球生物固氮量的一半，在生物固氮中占有重要地位。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无污染的根瘤菌与有解磷作用的巨大芽孢杆菌共培养发酵方法，得到的发酵液具有较高的固氮活性和有效磷含量，尤其适用于相思树。
本发明先将根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)单独培养24-36小时，再与有解磷作用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium de Bary)在共培养发酵培养基中共培养48-60小时，得到的发酵液具有较高的固氮活性和有效磷含量，并且重金属含量低，不会对环境造成污染，用于相思树能大大提高其生长量，根瘤数量，根瘤重量，生物量等，从而实现了本发明的目的。
本发明的一种共培养发酵方法，其特征是包括以下的步骤
(1)将根瘤菌接种于共培养发酵培养基中，置于恒温旋转摇床，培养24-36小时；(2)在步骤(1)得到的含根瘤菌的共培养发酵培养基中接种有解磷作用的巨大芽孢杆菌，置于恒温旋转摇床，共培养48-60小时。
步骤(1)所述的根瘤菌可以是埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)AM01 CCTCC M205074，菌株自广东省广州市龙洞林场马占相思树木(Acacia.mangium Wild)根系根瘤分离而得，并已于2005年7月18日保藏在中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏单位地址是武昌珞珈山武汉大学校内，保藏编号为CCTCC M 205074；根瘤菌AM01的特征是细胞呈杆状，0.5～0.8μm×1.2～3.0μm，胞内含有聚-β-羟基丁酸颗粒，单鞭毛极生，在碳水化合物培养基上产生丰富的胞外多糖粘液。革兰氏染色阴性，菌落圆形，不透明，凸起，世代时间6.2小时；3-酮基乳糖反应、明胶液化、纤维素水解、柠檬酸盐利用、淀粉水解和酪氨酸水解均呈阴性，BTB试验产碱，蛋白胨肉汤生长试验阴性，利用果糖、肌糖、麦芽糖、蔗糖、甘氨酸和天门冬氨酸，硝酸盐还原阴性，在100μg·mL-1红霉素和质量分数1.0％NaCl中可以生长。
步骤(1)所述的根瘤菌还可以是辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobium Liaoningense)AJ02CCTCC M 205075，菌株自江西省赣州市黑荆树(Acacia.meamsii De Wild.)根系根瘤分离得到，并已于2005年7月18日保藏在中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏单位地址是武昌珞珈山武汉大学校内，保藏编号为CCTCC M 205075；根瘤菌AJ02的特征是细胞呈杆状，0.6～0.9μm×1.2～3.0μm，胞内含有聚-β-羟基丁酸颗粒，单鞭毛极生，在碳水化合物培养基上产生丰富的胞外多糖粘液，革兰氏染色阴性，菌落圆形，不透明，凸起，世代时间6.3小时；3-酮基乳糖反应、明胶液化、纤维素水解、柠檬酸盐利用、淀粉水解和酪氨酸水解均呈阴性，BTB试验产碱，蛋白胨肉汤生长试验阴性，利用果糖和天门冬氨酸，不利用肌糖、麦芽糖、蔗糖、甘氨酸，在100μg·ml-1红霉素和质量分数1.0％NaCl中不生长。
步骤(1)所述的共培养发酵培养基，总量按质量分数计为100％，其成分含有磷酸氢二钾0.08％，硫酸镁0.02％，氯化钠0.02％，谷氨酸钠0.05％，葡萄糖0.5％～0.7％，麦芽糖0.3％～0.5％和酵母粉0.15～0.3％，余量为蒸馏水，并使共培养发酵营养液的pH为6.8～7.0。
步骤(1)的根瘤菌的接种量最好是共培养发酵培养基体积的3％，所述的恒温旋转摇床为市面上出售的各型号，其转速最好是180～200r/min，培养温度最好是28℃～30℃。
步骤(2)所述的有解磷作用的巨大芽孢杆菌可以是巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium deBary)ACCC11107或巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium de Bary)ACCC11099，两菌种收录在中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心编写的《中国农业菌种目录》(中国农业科技出版社，出版日期2001年12月，P5)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心，地址是中国，北京，中关村南大街12号，保藏编号分别为ACCC11107和ACCC11099，它们抗逆性强、解磷能力强、胞外分泌物丰富、芽孢存活时间长。
步骤(2)的有解磷作用的巨大芽孢杆菌的接种量最好是步骤(1)中共培养发酵培养基体积的1％，恒温旋转摇床所述的恒温旋转摇床为市面上出售的各型号，其转速最好是180～200r/min，培养温度最好是28℃～30℃。
本发明所用的根瘤菌和巨大芽孢杆菌都采用通常的培养基和培养方法经过菌种培养和种子培养。
本发明通过先在共培养发酵培养基中单独培养根瘤菌，然后再与有解磷作用的巨大芽孢杆菌共培养，克服了根瘤菌较芽孢杆菌生长慢的问题，并且利用共培养技术的混合增效和互补作用增强了发酵菌剂在生产应用中的增产节肥效果，共培养发酵液中每毫升含活菌数约109～1010个菌，1毫升二次培养后的固氮活性＞25nmol还原的C2H2/小时，有效磷含量＞60％，发酵液中铅、汞、砷和镉等重金属含量低于农业部发布的《微生物肥料》(NT227-94)中所规定的指标，发酵菌剂在田间的应用不会对土壤造成重金属污染。与传统单菌株发酵工艺相比，节省了混合的工序。而且共培养的发酵液接种于相思能提高苗木高生长，根瘤数量，根瘤重量，生物量，且提高的比例大大优于单菌株发酵液或混合发酵液。因此本发明有望用于生产新一代多功能多菌株的菌肥，在绿色农林业生产上具有广泛的应用前景。
图1埃氏慢生根瘤菌AM01菌株在菌种培养基固体平板上的生长图2巨大芽孢杆菌ACCC11107菌株在菌种培养基固体平板上的生长图3埃氏慢生根瘤菌AM01菌株和巨大芽孢杆菌ACCC11107菌株共培养发酵液倍比稀释和涂根瘤菌培养基平板的单菌落形态；大菌落为解磷芽孢杆菌，小菌落为根瘤菌。
具体实施例方式
以下的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。
实施例1埃氏慢生根瘤菌AM01和巨大芽孢杆菌ACCC11107共培养发酵根瘤菌AM01和巨大芽孢杆菌ACCC11107菌种分别在菌种培养基固体平板上培养。芽孢杆菌ACCC11107在菌种培养基固体平板上28～30℃培养24小时，培养基组成是蛋白胨5g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂15g，用蒸馏水定容到1000mL，培养基pH7.0～7.2。培养基在压力103kPa，121℃灭菌30分钟。根瘤菌AM01在菌种培养基固体平板上28～30℃培养72小时，培养基组成是甘露醇10g，谷氨酸钠0.5g，K2HPO40.5g，MgSO4H2O 0.2g，NaCl 0.01g，酵母膏0.5g，琼脂1.5g，用蒸馏水定容到1000mL，培养基pH6.8～7.0。培养基在压力103kPa，121℃灭菌30分钟。
分别挑出上述菌种培养得到的根瘤菌AM01和巨大芽孢杆菌ACCC11107单菌落分别接种于盛有100mL种子培养基的500mL摇瓶中。巨大芽孢杆菌ACCC11107种子培养是在180～200r/min恒温旋转摇床，30℃培养48小时。培养基组成是蛋白胨5g，牛肉膏3g，NaCl 5g，用蒸馏水定容到1000mL，培养基pH7.0～7.2。培养基在压力103kPa，121℃灭菌30分钟。根瘤菌AM01的种子培养是在180～200r/min恒温旋转摇床，30℃培养48小时，培养基组成是甘露醇10g，谷氨酸钠0.5g，K2HPO40.5g，MgSO47H2O 0.2g，NaCl 0.01g，酵母膏0.5g，用蒸馏水定容到1000mL，培养基pH6.8～7.0。培养基在压力103kPa，121℃灭菌30分钟。
将根瘤菌AM01种子培养液30mL转入盛有1000mL共培养发酵培养基的3000mL摇瓶中，置于180～200r/min恒温旋转摇床，30℃培养24小时后再加入巨大芽孢杆菌ACCC11107种子培养液10mL，置于180～200r/min恒温旋转摇床，30℃共培养48小时。共培养发酵培养基的组成是K2HPO40.8g，MgSO47H2O 0.2g，NaCl 0.2g，谷氨酸钠0.5g，葡萄糖5g，麦芽糖5g，酵母粉3g，用蒸馏水定容到1000mL，pH6.8～7.0。培养基在压力103kPa，121℃灭菌30分钟。
实施例2埃氏慢生根瘤菌AM01和巨大芽孢杆菌ACCC11107共培养发酵液生物学特征取实施例1共培养后的发酵液用公知的乙炔还原方法测定其固氮活性，用公知的磷钼兰比色法测定其有效磷含量，用公知的平板稀释计数方法测定活菌数量，另外用同样的方法分别测定根瘤菌AM01单菌株发酵液，巨大芽孢杆菌ACCC11107单菌株发酵液和AM01与ACCC11107的发酵液按3∶1混合后的固氮活性，有效磷含量和活菌数量作为对比。结果见表1。
表1根瘤菌AM01和巨大芽孢杆菌ACCC11107共培养发酵液，单菌株发酵液和混合发酵液的生物学特征对比
实施例3辽宁慢生根瘤菌AJ02和巨大芽孢杆菌ACCC11107共培养发酵根瘤菌AJ02和巨大芽孢杆菌ACCC11107菌种分别在菌种培养基固体平板上培养。芽孢杆菌ACCC11107在菌种培养基固体平板上28～30℃培养24小时，培养基组成是蛋白胨5g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂15g，用蒸馏水定容到1000mL，培养基pH7.0～7.2。培养基在压力103kPa，121℃灭菌30分钟。根瘤菌AJ02在菌种培养基固体平板上28～30℃培养72小时，培养基组成是甘露醇10g，谷氨酸钠0.5g，K2HPO40.5g，MgSO47H2O 0.2g，NaCl 0.01g，酵母膏0.5g，琼脂1.5g，用蒸馏水定容到1000mL，培养基pH6.8～7.0。培养基在压力103kPa，121℃灭菌30分钟。
分别挑出上述菌种培养得到的根瘤菌AJ02和巨大芽孢杆菌ACCC11107单菌落分别接种于盛有100mL种子培养基的500mL摇瓶中。巨大芽孢杆菌ACCC11107的种子培养置于180～200r/min恒温旋转摇床，30℃培养48小时。培养基组成是蛋白胨5g，牛肉膏3g，NaCl 5g，用蒸馏水定容到1000mL，培养基pH 7.0～7.2。培养基在压力103 kPa，121℃灭菌30分钟。根瘤菌AJ02的种子培养置于180～200r/min恒温旋转摇床，30℃培养48小时，培养基组成是甘露醇10g，谷氨酸钠0.5g，K2HPO40.5g，MgSO47H2O 0.2g，NaCl 0.01g，酵母膏0.5g，用蒸馏水定容到1000mL，培养基pH6.8～7.0。培养基在压力103 kPa，121℃灭菌30分钟。
将根瘤菌AJ02种子培养液30mL转入盛有1000mL共培养发酵培养基的3000mL摇瓶中，置于180～200r/min恒温旋转摇床，30℃培养36小时后再加入巨大芽孢杆菌ACCC11107种子培养液10mL，置于180～200r/min恒温旋转摇床，30℃共培养60小时。共培养发酵培养基的组成是K2HPO40.8g，MgSO47H2O 0.2g，NaCl 0.2g，谷氨酸钠0.5g，葡萄糖7g，麦芽糖3g，酵母粉3g，用蒸馏水定容到1000mL，pH6.8～7.0。培养基在压力103kPa，121℃灭菌30分钟。
实施例4辽宁慢生根瘤菌AJ02和巨大芽孢杆菌ACCC11107共培养发酵生物学特征取实施例3共培养后的发酵液用公知的乙炔还原方法测定其固氮活性，用公知的磷钼兰比色法测定其有效磷含量，用公知的平板稀释计数方法测定活菌数量，另外用同样的方法分别测定根瘤菌AJ02单菌株发酵液，巨大芽孢杆菌ACCC11107单菌株发酵液和AJ02与ACCC11107的发酵液按3∶1混合后的固氮活性，有效磷含量和活菌数量作为对比。结果见表2。
表2根瘤菌AJ02和巨大芽孢杆菌ACCC11107共培养发酵液，单菌株发酵液和混合发酵液的生物学特征对比
实施例5将实施1得到的根瘤菌AM01和巨大芽孢杆菌ACCC11107共培养发酵液，以及根瘤菌AM01单菌株发酵液和巨大芽孢杆菌ACCC11107单菌株发酵液分别接种马占相思苗木，每株苗接种5mL菌液，然后分别测量试验苗木的苗高，根瘤数量，根瘤重量和生物量。结果见表3。试验结果经数理统计分析表明差异显著(P＝0.05)。
表3根瘤菌AM01和巨大芽孢杆菌ACCC11107共培养发酵液，单菌株发酵液对马占相思苗木的促生作用对比
实施例6用实施3得到的根瘤菌AJ02和巨大芽孢杆菌ACCC11107共培养发酵液，以及根瘤菌AJ02单菌株发酵液和巨大芽孢杆菌ACCC11107单菌株发酵液分别接种马占相思苗木，每株苗接种5mL菌液，然后分别测量试验苗木的苗高，根瘤数量，根瘤重量，地上部分生物量和地下部分生物量。结果见表4。试验结果经数理统计分析表明差异显著(P＝0.05)。
表4根瘤菌AJ02和巨大芽孢杆菌ACCC11107共培养发酵液，单菌株发酵液对马占相思苗木的促生作用对比
实施例7埃氏慢生根瘤菌AM01和巨大芽孢杆菌ACCC11099共培养发酵根瘤菌AM01和巨大芽孢杆菌ACCC11099菌种分别在菌种培养基固体平板上培养。芽孢杆菌ACCC11099在菌种培养基固体平板上28～30℃培养24小时，培养基组成是蛋白胨5g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂15g，用蒸馏水定容到1000mL，培养基pH7.0～7.2。培养基在压力103kPa，121℃灭菌30分钟。根瘤菌AM01在菌种培养基固体平板上28～30℃培养72小时，培养基组成是甘露醇10g，谷氨酸钠0.5g，K2HPO40.5g，MgSO47H2O 0.2g，NaCl 0.01g，酵母膏0.5g，琼脂1.5g，用蒸馏水定容到1000mL，培养基pH6.8～7.0。培养基在压力103kPa，121℃灭菌30分钟。
分别挑出上述菌种培养得到的根瘤菌AM01和巨大芽孢杆菌ACCC11099单菌落分别接种于盛有100mL种子培养基的500mL摇瓶中。巨大芽孢杆菌ACCC11099的种子培养置于180～200r/min恒温旋转摇床，30℃培养48小时。培养基组成是蛋白胨5g，牛肉膏3g，NaCl 5g，用蒸馏水定容到1000mL，培养基pH7.0～7.2。培养基在压力103kPa，121℃灭菌30分钟。根瘤菌AM01的种子培养置于180～200r/min恒温旋转摇床，30℃培养48小时，培养基组成是甘露醇10g，谷氨酸钠0.5g，K2HPO40.5g，MgSO47H2O 0.2g，NaCl 0.01g，酵母膏0.5g，用蒸馏水定容到1000mL，培养基pH6.8～7.0。培养基在压力103kPa，121℃灭菌30分钟。
将根瘤菌AM01种子培养液30mL转入盛有1000mL共培养发酵培养基的3000mL摇瓶中，置于180～200r/min恒温旋转摇床，30℃培养24小时后再加入巨大芽孢杆菌ACCC11099种子培养液10mL，置于180～200r/min恒温旋转摇床，30℃共培养48小时。共培养发酵培养基的组成是K2HPO40.8g，MgSO47H2O 0.2g，NaCl 0.2g，谷氨酸钠0.5g，葡萄糖5g，麦芽糖5g，酵母粉3g，用蒸馏水定容到1000mL，pH6.8～7.0。培养基在压力103kPa，121℃灭菌30分钟。
实施例8埃氏慢生根瘤菌AM01和巨大芽孢杆菌ACCC11099共培养发酵生物学特征取实施例7共培养后的发酵液用公知的乙炔还原方法测定其固氮活性，用公知的磷钼兰比色法测定其有效磷含量，用公知的平板稀释计数方法测定活菌数量，另外用同样的方法分别测定根瘤菌AM01单菌株发酵液，巨大芽孢杆菌ACCC11099单菌株发酵液的固氮活性，有效磷含量和活菌数量作为对比。结果见表5。
表5根瘤菌AM01和巨大芽孢杆菌ACCC11099共培养发酵液，单菌株发酵液的生物学特征对比
权利要求
1.一种共培养发酵方法，其特征是包括以下的步骤(1)将根瘤菌接种于共培养发酵培养基中，置于恒温旋转摇床，培养24～36小时；(2)在步骤(1)得到的含根瘤菌的共培养发酵培养基中接种有解磷作用的巨大芽孢杆菌置于恒温旋转摇床，共培养48～60小时。
2.根据权利要求1的一种共培养发酵方法，其特征是步骤(1)所述的根瘤菌是埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)AM01 CCTCC M 205074或辽宁慢生根瘤菌(BradyrhizobiumLiaoningense)AJ02 CCTCC M 205075。
3.根据权利要求1的一种共培养发酵方法，其特征是步骤(2)所述的有解磷作用的巨大芽孢杆菌是巨大芽孢杆菌ACCC11107或巨大芽孢杆菌ACCC11099。
4.根据权利要求1或2或3的一种共培养发酵方法，其特征是步骤(1)所述的共培养发酵培养基，总量按质量分数计为100％，其成分含有磷酸氢二钾0.08％，硫酸镁0.02％，氯化钠0.02％，谷氨酸钠0.05％，葡萄糖0.5％～0.7％，麦芽糖0.3％～0.5％和酵母粉0.15～0.3％，余量为蒸馏水，并使共培养发酵营养液的pH为6.8～7.0。
5.根据权利要求1或2或3的一种共培养发酵方法，其特征是步骤(1)所述的根瘤菌的接种量是共培养发酵培养基体积的3％，所述的恒温旋转摇床转速是180～200r/min，培养温度是28℃～30℃。
6.根据权利要求1或2或3的一种共培养发酵方法，其特征是步骤(2)所述的有解磷作用的巨大芽孢杆菌的接种量是步骤(1)中共培养发酵培养基体积的1％，所述的恒温旋转摇床的转速是180～200r/min，培养温度是28℃～30℃。
全文摘要
本发明涉及一种根瘤菌与有解磷作用的巨大芽孢杆菌共培养发酵方法，其特征是首先将根瘤菌接种于共培养发酵培养基中，置于恒温旋转摇床，培养24～36小时；然后在上述步骤得到的含根瘤菌的共培养发酵培养基中接种有解磷作用的巨大芽孢杆菌，置于恒温旋转摇床，共培养48～60小时。本发明克服了根瘤菌较芽孢杆菌生长慢的问题，并利用共培养技术的混合增效和互补作用增强了发酵菌剂在生产应用中的增产节肥效果，使接种了这种发酵液的相思苗木高生长，根瘤数量，根瘤重量和生物量等均大大提高，而且发酵菌剂在田间的应用不会对土壤造成重金属污染，因此本发明有望用于生产新一代多功能多菌株的菌肥，在绿色农林业生产上具有广泛的应用前景。
文档编号C12R1/11GK1757716SQ20051003610
公开日2006年4月12日 申请日期2005年7月25日 优先权日2005年7月25日
发明者康丽华, 马海宾, 江业根, 陈应龙 申请人:中国林业科学研究院热带林业研究所