专利名称：用于制备IL－15/Fc融合蛋白的表达系统及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及包括至少一个编码白细胞介素-15/Fc(IL-15/Fc)融合蛋白的核酸的表达系统以及在其帮助下制备IL-15/Fc融合蛋白。而且，本发明涉及使用该表达系统制备IL-15/Fc融合蛋白的方法，而且还涉及该表达系统，该核酸，该宿主细胞或用于在宿主细胞中表达蛋白的CD5引导序列的用途。
在哺乳动物中的免疫事件基于作为类似于免疫网络的复杂的细胞和非细胞相互作用的多样性。在这个复杂的网络中的许多机制的功能仅仅在最近才被阐明。在1994年描述的包括白细胞介素-15因子的细胞因子(Grabstein等，1994，Science 264965-968)作为可溶解的信使在免疫网络中发挥重要作用。白细胞介素-15(IL-15)作为免疫调节剂、生长因子、趋化因子和生存因子在免疫系统的细胞的增殖、分化、活化和生存中起作用，该免疫系统例如，T细胞、单核细胞/巨噬细胞、NK细胞和其它的诸如角化细胞和其它的IL-15敏感细胞。除了作为免疫调节剂的功能，IL-15还在肌肉和脂肪组织的代谢的调控中发挥作用。
典型的，IL-15通过异源三聚体白细胞介素-15受体(IL-15R)结合到其效应器细胞。IL-15R由特异结合IL-15的α亚单位，也被IL-2识别的β亚单位和被白细胞介素家族的另外成员如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15识别的γ亚单位组成。
IL-15在复杂的自体免疫疾病和慢性炎症疾病，例如风湿性关节炎、牛皮癣、多发性硬化症、Crohn′s疾病、溃疡性结肠炎、小肠结肠炎、肺结节病或系统性红斑狼疮以及在移植器官、组织和细胞的免疫排斥中发挥作用。IL-15还在淋巴性白血病中发挥作用。
白细胞介素-15根据激活原则被治疗性地用于癌症患者和免疫缺陷性疾患中扩展淋巴细胞群，或者根据拮抗原则，通过使用阻断IL-15功能的试剂而在具有免疫系统病理性激活的疾病中应用。这些试剂可以是可溶的IL-15-受体多肽，抗IL-15或IL-15受体的抗体或它们可以是含有IL-15部分的融合蛋白，例如含有IL-15成份和免疫球蛋白成份的融合蛋白(在Fehninger和Caligiuri，2001，Blood 97(1)14-32中综述)。本文证明该白介素-免疫球蛋白有用。
可以在原核表达系统中制备白介素和免疫球蛋白的重组融合蛋白。这些表达系统的主要的不利之处是缺乏原核生产的蛋白的糖基化，这可能损害了该表达产品的功能和稳定性，并且因此限制了该表达产品的医学可用性。相反，白介素和免疫球蛋白的重组融合蛋白在替代的通常确保正确糖基化的诸如哺乳动物细胞的表达系统中具有相对低的表达效率的缺点(Zheng等，1999，J.Immunol.1634041-4048)。因此，还需要提供适合真核细胞的表达系统，其能够制备大量具有足够纯度的重组IL-15/Fc融合蛋白。
因此，本发明的目的是提供这种类型的改良的表达系统。
通过提供用于制备IL-15/Fc融合蛋白的表达系统而实现本发明的目的，该表达系统包括一个或多个核酸，该核酸包括a)至少一个编码IL-15/Fc融合蛋白的核酸，b)至少一个启动子c)至少一个编码CD5引导序列的核酸，该启动子和编码CD5引导序列的核酸被功能性的连接到编码IL-15/Fc融合蛋白的核酸上。
在根据本发明的表达系统的协助下，通过重组DNA技术的方法，例如在真核细胞中可以较大规模的制备IL-15/Fc融合蛋白。因此，本发明使得可以为商业目的制备IL-15/Fc融合蛋白。
重组DNA技术通常指例如向载体传送遗传信息的技术。这些载体使得该遗传信息能够被例如通过导入宿主而进一步处理，使得该遗传信息能够在新环境中扩增和表达。该遗传信息通常以核酸的形式存在，例如以基因组DNA或cDNA的形式存在，其包括一个或多个编码形式的所需基因产物的信息。可以作为载体的实例是质粒，在质粒中，核酸，例如cDNA为了扩增而可以被整合到在转录调控元件例如启动子、增强子、或沉默子的控制下的合适位置，从而在宿主细胞中表达。质粒进一步可以包括既影响所需表达产物的合成又影响后者在宿主细胞中的稳定和定位的要素，或者元件使得使用的质粒和表达产品可被选择的要素。
根据本发明，术语表达系统指一个或多个核酸———当与对转录必须的诸如核糖体、氨基酸和/或tRNAs等其它要素适当结合时，——该表达系统可能导致IL-15/Fc融合蛋白在适合的条件下，诸如在适合的宿主细胞中表达。
根据一个优选的实施方案，该表达系统由所述的一个或多个核酸组成。
为了在宿主细胞中使表达成为可能，表达系统的核酸还可以是一个或多个载体的部分，该载体可以通过本领域技术人员熟知的重组DNA技术的方法制备(Sambrook等.(eds.)，1989，Molecular CloningALaboratory Course Manual.Cold Spring Harbor Press，New York)。本领域技术人员已知本发明可以使用多种载体。用于在真核细胞中表达的合适的载体例如，酵母载体pYES(在啤酒酵母(S.cerevisiae)中表达；Invitrogen)和pICZ(在毕赤酵母(P.pastoris)中表达；Invitrogen).杆状病毒载体，例如pBacPAK9(在昆虫细胞中表达；Clontech)，以及还有大量的可以用于在哺乳动物细胞中异源表达的载体，例如Rc/CMV，Rc/RSV，pcDNA和其它SV40衍生的载体，其中除被表达的核酸序列之外，还可以插入适合的转录调控要素。
除了在选择的宿主中调节质粒复制的复制原点之外，合适的载体优选通常含有选择标记基因和识别限制性内切酶的位点，其使得核酸片段能被插入。通过合适的限制性内切酶识别位点可以将编码IL-15/Fc融合蛋白的核酸插入载体。
适合用于根据本发明表达系统的病毒载体系统包括，例如反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒载体和疱疹病毒或乳头状瘤病毒载体。
编码IL-15/Fc融合蛋白的核酸优选DNA或RNA，特别优选基因组DNA，cDNA或其组合。
IL-15/Fc融合蛋白的核酸编码IL-15/Fc融合蛋白。根据本发明的IL-15/Fc融合蛋白是含有两个融合部分，即IL-15组分和Fc组分的融合蛋白。除了功能蛋白之外还含有免疫球蛋白的融合部分的重组蛋白例如描述于Capon等(US 5,428,130)中。
给出了优选的由N端突变或未突变的IL-15部分和C端Fc部分组成的融合蛋白。该蛋白例如公开于WO 97/41232和Kim等(1998，J.Immunol.1605742-5748)中。
融合蛋白的IL-15部分选择性的调节与IL-15受体(IL-15R)的结合，该受体例如在活化的T细胞上表达。因此该IL-15部分可以是天然形成的IL-15及其突变。
在一个更优选的实施方案中，IL-15组分是野生型的IL-15。在这里，该IL-15可以是例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、牛、山羊、绵羊、马、猪、狗、猫或猴的任何种中的IL-15，优选人的IL-15。其还包括不同的剪切变体和天然发生的变体。更优选这里给出哺乳动物的核酸，特别是人或鼠科的核酸形式。
IL-15突变包括IL-15组分，相比较于天然发生的IL-15，含有突变，例如一个或多个删除、插入或取代或其组合。然而，使用的IL-15变体必须能够使IL-15/Fc融合蛋白结合IL-15R。例如这可以在使用标记的IL-15和具有IL-15受体的膜或细胞的放射性配体结合实验中检测(Carson WE等，1994，J Exp Med.，180(4)1395-1403)。
在一个优选实施方案中，该突变可以具有类似IL-15的作用(具有激动剂作用的组分)和其活性，相比较于IL-15，可以具有相同、降低或甚至增加的水平。可以用于含有具有激动剂作用的IL-15组分的IL-15/Fc融合蛋白的检测系统是通过所述的IL-15组分激活鼠科的CTLL-2细胞的增殖。
根据本发明，如果IL-15组分具有至少10％、优选至少25％、更优选至少50％，更优选100％，甚至更优选150％以及最优选至少200％的活性，则该组分具有激动剂作用。
具有激动剂作用的IL-15组分的活性指由IL-15组分引起的刺激反应与通过野生型的IL-15(野生型IL-15相应于100％活性)的刺激的百分比。在测试中既可以单独使用IL-15组分，也可以使用融合蛋白。
对于具有激动剂作用的IL-15组分，优选使用保守的氨基酸取代，其残基被具有相似特性的另一个残基取代。典型的取代是在脂肪族氨基酸的组中的取代、在具有脂肪族羟基侧链的氨基酸的组中的取代、在具有酸性基团的氨基酸的组中的取代、在具有酰胺衍生物的氨基酸组中的取代、在具有碱性基团的氨基酸的组中的取代或在具有芳基基团的氨基酸的组中的取代。典型的保守和半保守取代如下所述
在本发明的另一个实施方案中，使用具有拮抗剂作用的IL-15的组分。这种类型的组分抑制IL-15的作用或抑制IL-15与IL-15R结合，这种抑制可能是完全的或仅仅是部分的。用于具有有拮抗剂作用的IL-15组分的IL-15/Fc融合蛋白的检测系统是描述于WO 97/41232(BAF-BO3细胞增殖方法)中的检测系统。根据本发明，如果IL-15组分抑制至少10％、优选至少25％、更优选至少50％，最优选至少95％的IL-15介导的作用或IL-15与IL-15R的结合，则该IL-15组分具有拮抗剂作用。在测试中即可单独使用IL-15组分又可使用融合蛋白。
对于具有拮抗剂作用的IL-15组分，优选非保守的氨基酸取代，其残基被具有不同特性的氨基酸取代。进一步优选在与IL-15R相互作用的或用于信号传导的分子区域发生的取代。
在一个优选的实施方案中，使用的具有拮抗剂作用的IL-15组分是在WO 97/41232中描述的突变或在第56位置的氨基酸具有突变的IL-15组分(天冬氨酸，AAA21551)。最优选的突变是在白细胞介素-15的第149和/或156氨基酸位置的点突变，特别是用天冬氨酸替代谷氨酸(参见WO 97/41232)。在一个实施方案中，还可能结合描述的突变。
在一个实施方案中，融合蛋白的突变的IL-15部分与野生型的IL-15，优选人野生型的IL-15(例如，国家生物技术信息中心的数据，接受号AAA21551)或其它天然发生的变体(例如，国家生物技术信息中心的数据接受号为CAA63914和CAA71044的变体)具有至少65％，优选至少70％，更优选至少85％，仍然优选至少95％和最优选至少99％的同一性。
IL-15/Fc融合蛋白的第二个功能单位是Fc组分。该Fc部分指免疫球蛋白恒定的片段(c＝恒定)，其通过木瓜蛋白酶剪切而制得并且其氨基酸序列是高度保守的。该Fc片段是通常不结合抗原的抗体片段。根据本发明的Fc部分指优选上述定义的除了铰链区还包括恒定结构域CH2和CH3的免疫球蛋白片段。
该Fc组分源自任何抗体的Fc部分，例如IgA，IgD，IgG，IgE或IgM，优选IgM或IgG，更优选IgG1，IgG2，IgG3和IgG4亚类的Fc部分。
在本发明的一个特定实施方案中，融合蛋白的Fc部分是免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段，其缺乏IgG可变区的轻链和重链。可以使用的IgGs的实例是IgG1，IgG2，IgG2a，IgG2b，IgG3和IgG4。优选人或鼠的IgG1。
本发明可以使用抗体的整个Fc部分，或仅仅是其一部分。然而，Fc部分的所述部分优选以这样的方式设计即IL-15/Fc融合蛋白比没有免疫球蛋白组分的IL-15组分在血液循环中具有更长的半衰期。这可以通过将融合蛋白和IL-15组分给药，例如用注射的方法用于一个或多个实验动物的血流中，并比较血液循环中的半衰期而检测。通过半衰期增加至少10％，更优选至少20％，仍然优选至少50％和最优选至少100％来显示更长的半衰期。
该Fc部分还可以是具有至少一个突变的Fc部分。该突变的Fc可以采用上述的对于IL-15部分的突变方法。
一个实施方案中，融合蛋白的突变的Fc部分与鼠或人野生型免疫球蛋白，优选人IgG1-Fc或自然发生的变体相比具有至少65％，优选至少70％，更优选至少85％，仍然更优选至少95％并最优选至少99％的同一性。
在本发明一个优选的实施方案中，融合蛋白的Fc部分是天然的形式或具有保守氨基酸取代并含有完整FcR-和/或互补结合位点的形式。融合蛋白的Fc部分可以调节补体系统的活性并结合表达Fc受体的细胞，因此导致被融合蛋白的IL-15部分识别的细胞的消除。在调节补体激活和Fc受体结合的氨基酸位置的突变的引入，特别是非保守氨基酸的替代，使得关闭这些功能成为可能。这些突变的实例是那些Fc受体(FcR)结合位点或补体结合位点的突变(在天然人IgG1的氨基酸214，356，358和/或435位点或在天然鼠IgG2A的Leu 235，Glu318，Lys 320和/或Lys 322位点)。在这些位置的氨基酸取代通常导致Fc部分的渐退的(lytic)和补体-激活功能的缺失(WO 97/41232)。
进一步优选的实施方案中，人Fc部分的铰链区的位置4，更优选人IgG1(人IgG1的167位置)的半光氨酸被例如丙氨酸取代，以防止分子内的桥联并因此产生的表达的IL-15/Fc融合蛋白的聚积。
在另一个优选的实施方案中，Fc部分是人免疫球蛋白IgG1的Fc部分或鼠免疫球蛋白IgG2A的Fc部分，其除了铰链区，还包括重链区CH2和CH3。
在该IL-15/Fc融合蛋白中，IL-15组分通过直接或通过连接体而融合到免疫球蛋白组分中。该连接体优选由不超过25个氨基酸，更优选不超过15个氨基酸，仍然更优选不超过10个氨基酸和最优选不超过1、2、3、4或5个氨基酸组成。
在另一个优选的实施方案中，编码白细胞介素的人核酸或者结合到同样的编码Fc的人核酸或者结合到其它诸如小鼠或大鼠的种的编码Fc的核酸上。例如，编码IL-15的人核酸可以结合到同样的编码IgG1的人核酸上、编码IgG2A的鼠核酸上或编码IgG2B的大鼠核酸上。进一步的可能的核酸的结合对于本领域技术人员来讲是可以理解的。
对于IL-15/Fc融合蛋白的最优选的核酸是SEQ ID No.1序列的第979到2014位置，SEQ ID No.2的第1985到3020位置的序列，或SEQ ID No.3或者编码SEQ ID No.4或SEQ ID No.5的多肽序列的核酸。最优选包括编码IL-15/Fc融合蛋白的核酸的载体是SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的载体。
然而，术语“编码IL-15/Fc融合蛋白的核酸”还包括与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列或编码SEQ ID No.4或5的多肽的核苷酸序列具有至少大约60％，优选大约75％，特别优选大约90％并更特别优选大约95％同一性的核酸，相应的IL-15/Fc融合蛋白结合IL-15R，并相比较于没有免疫球蛋白组分的相应的IL-15/Fc融合蛋白(用于检测系统，参见上文)具有在血液中增加的半衰期。
术语“包含编码IL-15/Fc融合蛋白的核酸的载体”还包括与SEQ IDNo.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列具有至少大约60％，优选大约75％，特别优选大约90％并更特别优选大约95％同一性的核酸，相应的IL-15/Fc融合蛋白结合IL-15R，并相比较于没有免疫球蛋白组分的相应的IL-15/Fc融合蛋白(用于检测系统，参见上文)具有在血液中增加的半衰期。
该表达系统进一步包括启动子。该启动子及其功能是本领域技术人员已知的。该启动子例如可以衍生自病毒、细菌或真核生物。该启动子可以控制要表达的基因组成型转录或可以被诱导的，并因此使得基因表达被特异性调控成为可能。该启动子还可以是细胞或组织特异的，即限制在特定细胞类型中表达该基因产物。具有这些特性的启动子对于本领域技术人员而言是已知的。特别适合在宿主细胞中控制表达的启动子，例如，在酵母中表达的ADH2启动子，或在昆虫细胞中表达的多角体蛋白启动子。在哺乳动物细胞中调节基因产物强表达的启动子是，例如，病毒基因的病毒启动子，例如RSV(劳氏肉瘤病毒)启动子、SV40(猿猴病毒40)启动子和CMVi/e(巨细胞病毒立即早期多肽)启动子。根据本发明，优选CMV启动子。还包括CMV启动子的突变，该突变序列与天然发生的CMV启动子相比具有优选95％、更优选99％的同源性(Kouzarides等，1983，MoI Biol.Med.1(1)47-58)和/或该突变相比较于野生型启动子，具有优选从90-110％，更优选从95-105％的活性。
另外，该转录调控区可以，特别是当使用CMV启动子时，含有一个或多个内含子，优选内含子A(Chapman等，1991，Nucleic Acids Res.19(14)3979-3986)。此实施方案具有可能达到特别高量的IL-15/Fc融合蛋白的优点，例如通过向转录因子提呈合适的结合位点。还包括内含子A中的突变，该突变序列与天然发生的内含子，特别是内含子A相比具有优选80％，更优选90％并更优选95％的同源性(Chapman等，1991，Nucleic Acids Res.19(14)3979-3986)，和/或相比较于野生型的内含子，特别是内含子A具有优选从90-110％，更优选95-105％的活性。
根据本发明的表达系统的另一个要素是编码CD5引导子的核酸，即CD5淋巴细胞抗原的分泌信号序列(Jones等，1986，Nature 323(6086)346-349)。该分泌信号序列调节表达产物分泌到宿主细胞的培养基中。将编码CD5引导子的核酸与编码IL-15/Fc融合蛋白的核酸在表达系统中排列，以便该引导子能够调节该融合蛋白的分泌。转录和翻译之后，优选CD5引导子位于融合蛋白的表达产物的羧基端，但是也可以同等优选位于融合蛋白的氨基端。
令人惊讶的是，CD5引导子显示出在CHO细胞中调节表达产物分泌到细胞培养基中，比可比较的信号序列(参见实施例2，图8)高200-300倍。而且还包括在CD5引导子中的突变，该突变序列与天然发生的CD5引导子相比具有优选80％，更优选90％并更优选95％的同源性(Jones等，1986，Nature 323(6086)346-349)，和/或相比较于野生型的CD5引导子具有优选从80-120％，更优选90-110％的并更优选从95-105％的活性。
在表达系统中，启动子和编码CD5引导子的核酸被功能性地连接到编码IL-15/Fc融合蛋白的核酸上。功能性连接指就编码IL-15/Fc融合蛋白的核酸而言，启动子和编码CD5引导子的核酸以这样的方式排列，以便它们可以实施它们的功能。启动子的功能是调节融合蛋白的表达。如果两者都位于一个核酸上，该启动子通常在融合蛋白的5’端，或在3’端。引导子的功能是调节融合蛋白的分泌。如果编码引导子的核酸和编码融合蛋白的核酸位于一个核酸，该引导子通常位于融合蛋白的侧面。“功能性连接”优选指启动子和CD5引导子以与融合蛋白有关的方式排列，以便该启动子调控融合蛋白的表达并且该CD5引导子引起该融合蛋白的分泌。
在一个优选的实施方案中，表达系统另外含有至少用于选择标记基因的核酸，其例如能够使转染有表达系统的宿主细胞从非转染的细胞中选择出来。标记基因的实例是与抗生素联合使用的抗性调节基因。所述基因例如插入到表达载体并与适用于适当转染宿主细胞的抗生素一起使用。用于选择真核宿主细胞的已知抗生素的实例是氨苄青霉素、卡那霉素、zeocin和本发明的一个优选实施方案中的新霉素，所有这些使得宿主细胞能够通过表达相应的抗性调节基因而被筛选。本领域技术人员已知其它标记基因，例如选择基因tk或DHFR与相应的诸如HAT或氨蝶呤和甲氨蝶呤的选择试剂一同应用。其它合适的选择标记基因，例如维多利亚水母(A.Victoria)及其变体来源的绿色荧光蛋白基因，允许转染有表达载体的宿主细胞通过光学选择而不需要使用选择试剂处理。
优选使用编码色氨酸合成酶的基因作为选择地标记基因，相应的表达质粒被导入色氨酸合成酶缺陷的宿主细胞以用于选择和表达。
在进一步优选的实施方案中，表达系统还包括至少一个多腺苷酸化信号的核酸，通常，其除了终止转录，还影响RNA转录本的稳定性。其实例是来自SV40、β珠蛋白基因的多腺苷酸化序列，或在优选的实施方案中来自牛生长激素基因BGH(EP 173552)。多腺苷酸化信号的核酸以这样的方式作为表达系统的一部分，其能够改良融合蛋白的表达或其稳定性。通常将其连接到编码融合蛋白的核酸，以便该转录产物包括编码IL-15/Fc融合蛋白的核酸和多腺苷酸化信号。
在另一个实施方案中，例如在无细胞系统中，为了转录和/或翻译，该表达系统含有除了上述组分之外的表达所需要的组分。这种类型的可能组分的实例是转录因子、酶(例如肽基转移酶、aminoacyl-tRNS合成酶和RNA聚合酶)以及其它细胞蛋白(例如eIF4E，eFE1 andeEF2)，还进一步有辅助底物(ATP，GTP和镁离子)，优选tRNAs，氨基酸和/或核糖体。
在本发明一个优选的实施方案中，表达系统仅仅包括一个含有a)到c)的组分的核酸，如果合适还有d)，其中所有的均如上所定义。
在本发明一个高度优选的实施方案中，表达系统包括序列SEQ IDNo.1，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3中任何的核酸，或者编码SEQ IDNo.4或SEQ ID No.5的多肽的核酸。然而，还包括其序列与SEQ IDNo.1，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3序列之一的核酸或者与编码SEQID No.4或SEQ ID No.5的多肽的核酸之间具有至少大约60％，优选大约75％，特别优选大约90％并更特别优选95％同一性的核酸，相应的IL-15/Fc融合蛋白结合IL-15R，且相比较于相应的没有免疫球蛋白组分(用于检测系统，参见上文)的IL-15/Fc融合蛋白，其在血液中具有增加的半衰期。
在更优选的实施方案中，该表达系统包括核酸，在该核酸中从5’到3’排列下列组分CMV启动子，如果合适其后为内含子A，CD5引导子，IL-15/Fc融合蛋白，特别是具有在IL-15的149和/或156的氨基酸位置上存在天冬氨酸取代谷氨酰胺的点突变的IL-15，(参见WO97/41232)，和在铰链区的位置4的半胱氨酸被丙氨酸取代的人IgG1的Fc部分组成，如果合适还有多聚腺苷酸信号和如果合适，至少有一个标记基因。该标记基因，特别的还可以被安排在第二个核酸上。因此，这样的核酸(有或没有标记基因)也是根据本发明的核酸的优选实施方案。
本发明进一步涉及一个核酸，其包括IL-15/Fc融合蛋白、启动子、CD5引导子、如果合适还包括选择性标记基因，以及如果合适还包括多聚腺苷酸信号，所有的组分如上所述。在一个优选的实施方案中，该核酸含有SEQ ID No.1，SEQ ID No.2或SEQ ID No.3，或者编码SEQ ID No.4或SEQ ID No.5的多肽的核酸。然而，还包括其序列与SEQ ID No.1，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3序列之一的核酸或者与编码SEQ ID No.4或SEQ ID No.5的多肽的核酸之间具有至少大约60％，优选大约75％，特别优选大约90％并更特别优选95％同一性的核酸，相应的IL-15/Fc融合蛋白结合IL-15R，相比较于相应的没有免疫球蛋白组分(用于检测系统，参见上文)的IL-15/Fc融合蛋白，其在血液中具有增加的半衰期。
本发明进一步涉及包括根据本发明的表达系统或根据本发明的核酸的宿主细胞。
可以使用的宿主细胞可以是真核细胞，例如酵母细胞(例如啤酒酵母(S.cerevisiae)和毕赤酵母(P.pastori))、昆虫细胞(例如Sf9)或哺乳动物细胞。这种类型的哺乳动物细胞的实例是人胚胎肾细胞系HEK-293，从中国仓鼠卵巢细胞制备的CHO细胞系，及其衍生物例如，CHO-K1和CHO-DHFR，细胞系BHK，NIH 3T3，HeLa，COS-I，COS-7和NS.1。宿主细胞优选哺乳动物细胞，更优选CHO细胞及其衍生物，更优选CHO-K1细胞系。
在优选的实施方案中，宿主细胞是那些被表达系统的核酸稳定转染的细胞。在稳定转染的细胞的情况下，表达系统整合到靶细胞的基因组中并且以稳定的方式维持在基因组中。不同于瞬时转染，这里转染的基因不仅不降解，而且随着细胞的分裂而加倍并遗传到子代细胞中。后者因而保留了在很长的时间里制备所需蛋白的能力。
制备转染细胞特别是稳定转染细胞的方法是本领域技术人员已知的。例如可以通过电穿孔的方法转染宿主细胞，其中由于暂时施加电场而使细胞膜产生通透，从而允许核酸被吸收入细胞中，或者通过病毒载体转染或感染的方法。除了重组蛋白的瞬时表达，使用的表达系统还可以允许转染的宿主细胞的克隆选择，以便选择具有合适表达效率的克隆细胞系。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞是真核哺乳动物细胞，其含有至少一个根据SEQ ID No.1，SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的核酸，或者编码SEQ ID No.4或SEQ ID No.5的多肽的核酸。还包括其序列与上述序列具有至少大约60％，优选大约75％，特别优选大约90％，并更特别优选95％同一性的核酸，相应的IL-15/Fc融合蛋白结合IL-15R，其相比较于相应的没有免疫球蛋白组分(用于检测系统，参见上文)的IL-15/Fc融合蛋白在血液中具有增加的半衰期。
在一个特定的优选实施方案中，根据本发明的一个宿主细胞是CHO-K1细胞系(中国仓鼠卵巢细胞的亚克隆)，其稳定转染了至少一个根据SEQ ID No.1，SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3的核酸，或者编码SEQ ID No.4或SEQ ID No.5的多肽的核酸。还包括其序列与上述序列具有至少大约60％，优选大约75％，特别优选大约90％并更特别优选大约95％同一性的核酸，相应的IL-15/Fc融合蛋白结合IL-15R，其相比较于相应的没有免疫球蛋白组分(用于检测系统，参见上文)的IL-15/Fc融合蛋白在血液中具有增加的半衰期。
本发明进一步涉及制备如上定义的IL-15/Fc融合蛋白的方法，包括a.提供如上描述的宿主细胞，b.培养该宿主细胞，c.选择，如果合适并d.分离表达的IL-15/Fc融合蛋白。
可以使用的宿主细胞的实例如上所述。该细胞优选哺乳动物细胞，更优选CHO细胞及其衍生物，最优选CHO-K1细胞系。可以采用标准的方法用编码IL-15/Fc融合蛋白的核酸转染合适的宿主细胞(Sambrook等人，1989，supra)。
转染的宿主细胞可以是粘附细胞或悬浮培养。使用的宿主细胞优选存在于悬浮培养基中的细胞，避免在从粘附细胞向悬浮细胞的适应过程中的表达效率的降低。
可以使用标准的方法在发酵条件下，在适合的营养培养基中培养原代细胞和细胞系(Freshney，1993，Animal Cell CultureA practicalapproach，John Wiley & Sons，Inc.)，该条件适合所使用的宿主细胞在每个情况下对于盐浓度、PH、维生素、微量元素、选择试剂、温度、通气等的要求，并且其使得所需要的表达产物以最佳条件表达。有利的是，所使用的是不含血清或外源蛋白的营养培养基，其能确保表达产物相对高的纯度。
选择，特定的克隆选择，指一种方法，其中具有所需要特性的宿主细胞通过一步一步的筛选(thinning-out)而增殖。优选的克隆选择的方法选择那些确保表达产物的足够表达水平和/或高糖基化的方式和高唾液酸化的状态的宿主细胞克隆。糖基化方式和唾液酸化状态影响表达产物的半衰期、生物分布、免疫原性和纯化及其他行为。合适的测定糖基化方式和唾液酸状态的方法是本领域技术人员已知的，其包括使用IEF(等电点聚焦)的结合酶剪切和HPAEC-PAD(具有脉冲安培计的高效阴离子交换层析)。
本发明的方法还包括从宿主细胞中分离异源表达的IL-15/Fc融合蛋白的方法，或在一个优选的实施方案中，从宿主细胞的培养基中分离异源表达的IL-15/Fc融合蛋白的方法。可以根据本领域技术人员熟知的方法分离，如果合适，纯化重组蛋白，其包括，例如细胞裂解、差速离心、沉淀、凝胶过滤、亲和层析、离子交换层析和HPLC反相层析等。用于纯化重组蛋白的合适方法的一个例子是亲和层析，其中不溶的基质由于化学处理而与配体结合。有用的配体可以是具有能够结合该基质的活性化学基团的任何分子。通常选择配体以便能够以可逆的方式与需要纯化的多肽结合。在适合该分子与配体结合的条件下，将在宿主细胞预纯化的培养基中的需要被纯化的分子施加到基质上，通过随后的洗涤步骤，将未结合的分子从培养基中去掉。通过加入离解多肽与配体结合的溶液而可以洗脱需要纯化的多肽。另一个合适的方法是阴离子交换层析，其中通过过量的正电荷或负电荷而将需要纯化的多肽结合到基质上。在根据本发明方法的一个优选实施方案中，首先通过从宿主细胞中除去细胞培养基而纯化表达产物，然后可以通过离心和/或过滤步骤来除去细胞碎片。在优选实施方案中，通过蛋白-A亲和层析和阴离子交换层析的组合而从宿主细胞的预纯化培养基中纯化重组的IL-15/Fc融合蛋白，如果需要，然后进行凝胶过滤。通过这种方法获得的表达产物可以随后通过本领域技术人员已知的方法鉴定关于含量、同一性和纯度的特性，所述方法例如，BCA，光密度检测，SDS PAGE，Western Blot，ELISA，氨基酸分析，氨基末端测序，指纹法(MALDI)，分子量测定(HPLC-ESI)等。
从组合物中纯化IL-15/Fc的特别优选的方法包括a)将该组合物施加到亲和层析柱上，并从柱上洗脱第一次的IL-15/Fc洗脱液；b)将步骤a)的洗脱液施加到阴离子交换层析柱上并从柱上洗脱第二次IL-15/Fc洗脱液；c)将步骤b)的洗脱液施加到凝胶过滤柱上并从柱上洗脱第三次IL-15/Fc洗脱液。
在优选的实施方案中，根据本发明的方法使得制备的IL-15/Fc融合蛋白的量至少10pg/(细胞X天)，更优选至少15pg/(细胞X天)。
在更优选的实施方案中，纯化后的蛋白的纯度至少90％，更优选至少95％并且最优选至少99％。
本发明进一步涉及上述的表达系统、核酸或宿主细胞在制备IL-15/Fc融合蛋白中的用途，该用途通过如上描述的方法实施。
本发明还进一步涉及如上所描述的CD5引导子在CHO细胞及其衍生物，特别是CHO-K1细胞中表达蛋白的用途。令人惊讶的是，当使用CD5引导子时，该蛋白的表达或其释放到细胞培养上清中的蛋白相比较于没有引导子的表达高200-300倍。另外，在这些细胞中，CD5引导子显示出显著优越于其它引导子(参见实施例2，图8)。该蛋白可以是任何蛋白。在优选实施方案中，该蛋白的表达被CMV启动子特别是与内含子A联合调节。
通过下面的实施例和附图解释本发明，而非对其进行限定。
图1pcDNA3.1hCD5.6Ala7表达构建体的图谱的描述。
图2-3pcDNA3.1hCD5.6Ala7表达构建体的序列的描述(SEQ ID No.1)。
图4pMG10Ala7表达构建体的图谱描述。
图5-6pMG10Ala7表达构建体的序列描述(SEQ ID No.2)。
图7A突变的具有CD5引导子的人IL-15/Fc的核酸序列的描述(SEQ ID No.3)。
图7B突变的具有CD5引导子的人IL-15/Fc的氨基酸序列的描述(SEQ ID No.4)。
图7C突变的具有CD5引导子的人IL-15/Fc的氨基酸序列的描述(SEQ ID No.5)。
图8用含有在每个事例中显示的引导子序列的pcDNA3.1hCD5.6Ala7质粒转染CHO-K1细胞之后，细胞培养基上清中IL-15/Fc含量的描述。
图9用不同表达构建体转染CHO-K1细胞之后，细胞培养基上清中IL-15/Fc含量的描述。每个条代表在每种情况下两个独立实验的两次检测的平均值+SEM。
pcDNA3.1相应于pcDNA3.1hCD5.6Ala7载体。
pVS8-Ala7相应于具有IL-15/Fc构建体的pSwitch质粒(Valentis)。
pMG-Ala7相应于具有IL-15/Fc构建体的pMG质粒(Invivogen)。
pCINeo-Ala7相应于具有IL-15/Fc构建体的pCI-Neo质粒(Promega)。
实施例实施例1在CHO-K1细胞中生产IL-15/Fc为了生产用于生产IL-15/Fc的CHO-K1细胞系，应该形成IL-15/Fc的表达构建体，并根据其分泌特性、其含有的片段的同一性/整合性和适合的抗性基因对其最优化。
a)开始材料人IL-15/Fc表达构建体(突变的IL-15/人Fc)由美国波士顿哈佛医学院以色列之家Deaconness医学中心的免疫系(the Department ofImmunology of the″Beth Israel Deaconness Medical Center″(HarvardMedical School，Boston，USA))提供。
从MWG-Biotech(Ebersberg，Germany)获得寡核苷酸。从基因文库获得相关信号肽的序列。
限制性内切酶(BgIII，XBaI，BamHI，Smal，BstXI，ApaI)，Lipfectamin2000，其它分子生物学试剂(T4-DNA连接酶，T4-多核苷酸激酶)和质粒pSecTagA，pcDNA3.1从Invitrogen(Karlsruhe，Germany)或Amersham-Pharmacia(NheI，Protein A Sepharose Uppsala，Sweden)获得。
感受态E.coli XL10-GoId细胞从Stratagene(La Jolla，USA)获得.BCA试剂盒(Pierce)购自KMF Laborchemie(Sankt Augustin，Germany)。
质粒-DNA纯化试剂盒(Endofree-Maxi Kit，Endofree-Giga Kit)来自Qiagen(Hilden，Germany)。
抗体从BD-Pharmingen(鼠-抗-hIL-15；目录号554712；Heidelberg，Germany)和Dianova(山羊-抗-小鼠-POD；目录号15-036-003；山羊-抗-人-POD；目录号109-036-088；Hamburg，Germany)获得。
b)方法/结果起始质粒在pSecTagA载体骨架上含有包括融合到人IgG1的Fc部分(铰链区和CH2，CH3区)的突变的人IL-15的融合蛋白的cDNA。除了在此申请中引用的Fc部分是鼠Igγ2a外，该质粒的结构相应于Kim等描述的(J.Immunol，1605742-5748；1998)。
已经存在于pSecTagA载体中的Igk引导子用于通过IL-15/Fc部分的读码框(in-frame)克隆分泌该融合蛋白。为了此目的，从天然的IL-15序列中除去内在的信号序列。然而由于克隆，10个额外的氨基酸被插入到Igk引导子序列的3’端和IL-15编码序列的5’端之间，在蛋白加工之后，其仍留在分泌蛋白中。为了除去这些非特异的氨基酸并为了改善该蛋白的分泌特性，对其它分泌的或细胞表面的蛋白的多种引导子序列进行检测鼠Igk(Coloma et al，J.Immun.Methods 15289-104；1992；接受号X91670)，人CD5(Jones et al，Nature 323346-349；1986；接受号X04391)，CD4(Hodge et al，Hum.Immunol.3099-104；1991；接受号M35160)，MCP-1(Yoshimura et al Je.FEBS Lett.244487-493；1989；接受号M24545)和IL-2(Taniguchi et al，Nature 302305-310；1983；接受号K02056)(接受号基于国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information))。在除去Igk引导子和额外的氨基酸后，通过克隆双链寡核苷酸而用提及的信号肽序列替代引导子。通过测序对其同一性进行检测。随后，通过使用Lipfectamin2000瞬时转染HEK-293细胞而对获得的构建体进行检测。在根据Moll和Vestweber的方法(Methods in Molecular Biology，9677-84，1999)进行蛋白-A-Sepharose纯化之后，通过BCA方法检测用多种构建体转染的细胞的细胞培养基上清的蛋白含量。通过SDS凝胶的银染和对Fc或IL-15部分的蛋白印迹检测的方法对蛋白的同一性进行检测，以便确保融合蛋白的两个组分都存在。在描述的实验中，CD5引导子获得了最好的结果，因此被选作该载体的进一步优化。
进一步检测是否用含有外显子/内含子结构的基因组DNA取代Fc部分的cDNA也能够有助于改良蛋白表达。不得不被核剪切器除去的内含子的存在可以改良RNA从细胞核的输出和RNA的稳定性。因此，通过引入剪切供体和剪切受体的位点而将基因组Fc部分连接到IL-15cDNA序列。获得的质粒同样也被多种引导序列修饰并用上述方法检测。然而，通过蛋白印迹分析的蛋白质揭示存在多种不需要的剪切变体，从而决定继续使用Fc部分的cDNA。
结果，获得的质粒包括人CD5引导子和cDNA-Fc部分。
突变的IL-15/Fc表达构建体的测序揭示Fc部分含有3个已经存在于原始构建体中的突变。这些突变中的两个涉及在高度保守位置的氨基酸。第三个突变是在铰链区的位置4的Cys-Ala突变，其是为了防止分子内和分子间半光氨酸桥而故意插入的。
为了除去两个不需要的突变并保留该Cys-Ala突变，通过RT-PCR对Fc的cDNA进行亚克隆。使用的RNA来源是用编码VCAM-1-Fc融合蛋白的构建体转染的CHO-K1细胞系。扩增的Fc-cDNA片段被克隆入CD5-mutIL-15质粒，然后通过BamHI/XbaI限制性内切酶除去Fc部分。
在独特的限制性内切图谱的基础上以及通过随后的测序对获得的质粒再进行分析，并将其称为CD5-6Ala7。由于作为DNA-嵌入试剂的zeocin的使用能够产生突变，将IL-15/Fc的表达盒从原始的pSecTagA骨架上除去并克隆到含有在SV40启动子控制下的新霉素抗性基因的pcDNA3.1中。对获得的质粒的两条链进行测序，显示与IL-15/Fc表达盒完全对应。
通过瞬时转染CHO-K1细胞和对细胞培养基上清进行蛋白印迹分析再次检测构建体的蛋白表达。作为阳性对照，在平行实验中使用CD5-6Ala7质粒进行转染。
最后，以每孔5×105个细胞的密度将细胞一式三份的接种于6孔组织培养盘中。使用分别稀释在250μl Optimem1培养基中的2μg质粒和4μl Lipofectamin2000进行转染。在室温孵育30分钟后混合两个溶液，将混合液滴加到组织培养盘的培养基中。
转染2天后，除去培养基并通过针对人IL-15部分的蛋白印迹方法分析其IL-15/Fc含量20μl细胞培养上清与5μl的5×Laemmli缓冲液混合，并在85℃孵育5min。然后将样品在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳。然后使用半干印迹盒对凝胶进行印迹分析。使用在PBS中含有5％奶粉和0.1％Tween20的封闭液对印记进行处理。然后使用在封闭液中以1∶1000稀释度稀释的单克隆小鼠-抗-人-IL-15抗体孵育4小时。三次洗涤步骤之后(10min PBS，0.1％Tween20)，将印记用二级抗体，山羊-抗-小鼠过氧化物酶(稀释度1∶5000)，在室温另外孵育2小时。然后再对印迹洗涤3次，然后使用Lumilight溶液滴加到印迹表面，然后用X射线胶片暴露于该印迹。
在用CD5-6Ala7转染之后获得的在信号范围之内的特异蛋白印迹信号显示所有的三个平行转染的细胞培养物上清中含有IL-15/Fc蛋白。因此表明pcDNA3.1hCD5.6Ala7质粒(图1-3)可用于在CHO-K1细胞中表达蛋白。
c)结论制备了IL-15/Fc质粒，pcDNA3.1hCD5.6Ala7，其含有包括在CMV启动子控制下的CD5引导子和融合到人IgG1-Fc的cDNA的突变的人IL-15的表达盒。为了选择稳定的真核细胞克隆，引入新霉素抗性基因。对该质粒进行测序，显示100％的对应于相关的编码区，仅在载体骨架上有与之无关的轻微的偏差(个碱基对的重复3)。通过瞬时转染CHO-K1细胞对该构建体的功能进行验证。
实施例2使用含有编码所需要产物的DNA的质粒转染真核细胞系(如CHO-K1细胞)是标准的生产治疗蛋白的方法。然而，这种方法中产生的稳定细胞克隆的低的生产水平是众所周知的问题。因此有多种策略来提高已经存在的细胞系的产量。除了增加细胞中质粒拷贝的数目的尝试(例如，通过甲氨蝶呤/DHFR系统)，还可以进一步修饰表达构建体自身。除了强启动子(如CMV启动子)，引入内含子可能导致更好的RNA稳定性和更好的从细胞核的RNA输出，其输出通过细胞的剪切装置完成。然而，对于哪一个内含子/转基因的组合是合适的，必须进行检测。为了这个目的，多种内含子与人IL-15/Fc组合以便发现通过CHO-K1细胞增加IL-15/Fc产量的组合。
a)材料用作起始质粒的质粒是pcDNA3.1hCD5.6Ala7质粒。在图1对其进行了示意性描述。其序列公开为SEQ ID No.1。
检测系统使用CHO-K1细胞(DSM，Braunschweig，Germany，接受号ACC 110)或者HEK-293细胞(Qbiogene，Grünberg，Germany，AE80503，QBI-293A)。也使用E.coli细胞(XL10-GoId，Strategene，LaJolla，USA)。在标准的培养条件下培养细胞(5％CO2，37℃，潮湿空气)。CHO-K1细胞以1∶20的比例一周传代2次，而HEK-293细胞以1∶6的比例传代。CHO-K1细胞使用的培养基是DMEM-F 12+10％FKS+1％PEN/Strep，而HEK-293细胞使用的培养基是DMEM+Glutamax+10％FKS+1％ PEN/Strep。使用Optimeml培养基进行转染。所有的培养基购自Invitrogen，Karlsruhe，Germany(目录号31331-028；32430-027；51985-018)。使用的质粒是pCl-Neo(Promega)，其含有CMV启动子和嵌合内含子，人β球蛋白基因的5’剪切供体位点和可变区的IgG重链的3’剪切受体位点。pMG(Invivogen)是含有包括来自CMV的内含子A的延长的CMV启动子。pSwitch(Valentis)是合成内含子，IVS8。而且，使用下述酶和限制性内切酶ApaI，EcoRV，XbaI，Nrul，PacI，Smal，XhoI，T4-DNA连接酶，T4-DNA聚合酶，来自牛小肠的碱性磷酸酶。这些和其它的分子生物学的试剂(Lipofectamin2000)购自Invitrogen.NheI购自Amersham-Pharmacia(Uppsala，Sweden)，而质粒纯化试剂盒购自Qiagen，Hilden，Germany。扩展的高保真PCR系统(目录号1732641)购自Roche，Mannheim，Germany。
b)方法i)pcDNA3.1hCD5.6Ala7质粒的IL-15/Fc插入通过NheI/ApaI消化而分离。质粒首先通过ApaI限制酶消化而线性化，而且通过T4-聚合酶处理而使5’突出端平端化。然后通过随后的NheI消化而分离IL-15/Fc插入片段。将该片段与用NheI和SmaI消化的pcl Neo连接。
ii)除去pcDNA3.1hCD5.6Ala7的CMV启动子并用源自pMG的延伸的含有内含子A的CMV启动子取代该pMG质粒用PacI切割并通过T4-聚合酶处理而使突出端平端化。第二次XbaI处理之后，获得1.7kb的片段，其含有CMV启动子+内含子A，通过琼脂糖凝胶电泳纯化该片段。通过NheI和随后的NruI的限制性内切将CMV启动子从pcDNA3.hCD5.6Ala7中除去。将获得的片段在4℃与pMG-启动子-内含子过夜连接。
iii)通过PCR方法扩增IVS8内含子，并克隆到pcDNA3.1hCD5.6Ala7中的CMV启动子的3’端和IL-15插入片段之间。通过NheI限制内切酶消化而将质粒线性化，然后用来自牛小肠的碱性磷酸酶处理。通过PCR扩增内含子，使用含有XbaI限制内切酶剪切位点的引物，并使用扩展的高保真PCR系统在下述条件下扩增使用的反应混合物含有2μl dNTPs(Qiagen，Taq core kit，2mmol/每个)，25pmol引物，5μl 10x缓冲液，0.75μl高保真Taq聚合酶，1μl(大约15ng)pSwitch-XhoI/EcoRV片段，并用水补足终体积为50μl。PCR程序如下(25个循环)95℃5min，94℃15s，55℃30s，72℃30s，72℃5min。使用XbaI剪切PCR产物，从0.8％-琼脂糖凝胶上洗脱，并与线性化的质粒连接。将获得的质粒转化到E.coli XL10 Gold中，并用小量分析法分析获得的质粒。显示合适的限制内切酶图谱的每个质粒的一个克隆被用于随后的没有内毒素的质粒制备。
在瞬时转染HEK-293或CHO-K1细胞后分析IL-15/Fc的表达。转染前一天，以每孔5×105个细胞的密度将细胞一式两份的接种于6孔组织培养盘中。根据Felgner等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847413-7417；1987)的方法进行转染，使用分别稀释在250μl Optimem1培养基中的2μg质粒和4μl Lipofectamin2000进行转染。混合两个溶液，在室温孵育30分钟后，将混合液滴加到细胞培养盘的细胞培养基中。转染2天后，除去培养基并通过针对IL-15/Fc的Fc部分的ELISA方法分析其IL-15/Fc含量。
c)结果转染有不同表达构建体的HEK-293细胞的IL-15/Fc的分泌几乎不受其它载体组分的影响。相反，由CHO-K1细胞表达的IL-15/Fc在将内含子插入IL-15/Fc构建体之后，以200-300的系数增加。原始构建体pcDNA3.1hCD5.6Ala7获得的分泌蛋白水平很难被检测到(低于10ng/ml)，当用pMG10Ala7转染细胞后，插入的内含子则导致IL-15/Fc的水平大约为300ng/ml(图4-6；SEQ ID No.2)。显示IL-15/Fc在CHO-K1细胞中的表达水平的ELISA数据在图4中描述。由于在转染pMG构建体之后的表达水平是最高的，选用后者制备稳定的CHO-K1表达细胞系。
最后，第一次对质粒进行单链测序。构建体中的两条链均在含有IL-15/Fc盒、新插入的CMV启动子和内含子片段的区域被测序。含有IL-15/Fc盒的质粒在CMV启动子的调控下。源自CMV(质粒MG)的内含子A位于启动子和翻译起始之间。质粒含有位于IL-15/Fc片段下游的BGHpolyA位点；新霉素抗性基因由SV40启动子调控并且含有SV40 polyA位点。质粒含有用于在E.coli中选择和增殖的氨苄青霉素抗性基因。
d)讨论和结论为了增加稳定的CHO-K1-IL-15/Fc转染体的蛋白产量，通过在启动子和IL-15/Fc盒之间插入内含子来修饰质粒。重组的内含子-转基因-宿主细胞大大影响了蛋白表达，并且因此不可能预测内含子对在两种分析的细胞类型中增加IL-15/Fc表达最有效。
然而，通过插入内含子很难影响HEK-293细胞，大量增加的IL-15/Fc分泌在CHO-K1细胞中检测到。相比较于原始的IL-15/Fc表达载体，使用含有CMV启动子和来源于pMG的内含子A的质粒的CHO-K1细胞中的IL-15/Fc蛋白的表达增加了多于一个数量级。该质粒可以用于制备生产IL-15/Fc的细胞系，该细胞系可以用于制备用于临床前和临床研究中的IL-15/Fc，或用于工业生产的IL-15/Fc。
序列表序列表<110>豪夫迈-罗氏公司<120>用于制备IL-15/Fc融合蛋白的表达系统及其用途<130>C62387PC<150>04008881.7<151>2004-04-14<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>6458<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>质粒pcDNA3.1hCD5.6Ala7<400>1gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg60ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg120cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc180ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt240gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata300tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc360cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc420attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt480atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt540atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca600tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg660actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc720aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg780gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca840
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<223>质粒pMG10Ala7<400>2gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg60ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg120cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc180ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgta agctgcaata aacaatcatt attttcattg240gatctgtgtg ttggtttttt gtgtgggctt gggggagggg gaggccagaa tgactccaag300agctacagga aggcaggtca gagaccccac tggacaaaca gtggctggac tctgcaccat360aacacacaat caacagggga gtgagctgga tcgagctaga gtccgttaca taacttacgg420taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt480atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac540ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg600acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact660ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt720ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc780ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc840gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata900taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg960acctccatag aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg ccgggaacgg tgcattggaa1020cgcggattcc ccgtgccaag agtgacgtaa gtaccgccta tagagtctat aggcccaccc1080ccttggcttc ttatgcatgc tatactgttt ttggcttggg gtctatacac ccccgcttcc1140tcatgttata ggtgatggta tagcttagcc tataggtgtg ggttattgac cattattgac1200
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<223>具有CD5引导子的突变的IL-15/Fc DNA<400>3atgcccatgg ggtctctgca accgctggcc accttgtacc tgctggggat gctggtcgct60tcctgcctcg gaaactgggt gaatgtaata agtgatttga aaaaaattga agatcttatt120caatctatgc atattgatgc tactttatat acggaaagtg atgttcaccc cagttgcaaa180gtaacagcaa tgaagtgctt tctcttggag ttacaagtta tttcacttga gtccggagat240gcaagtattc atgatacagt agaaaatctg atcatcctag caaacaacag tttgtcttct300aatgggaatg taacagaatc tggatgcaaa gaatgtgagg aactggagga aaaaaatatt360aaagaatttt tggacagttt tgtacatatt gtcgacatgt tcatcaacac ttcggatccc420aaatctgctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga480ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct540
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<223>具有CD5引导子的人CRB-15的氨基酸序列<400>4Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly1 5 10 15Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp20 25 30Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr35 40 45Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met50 55 60Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp65 70 75 80Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn85 90 95
Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys100 105 110Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Asp Ser Phe Val115 120 125His Ile Val Asp Met Phe Ile Asn Thr Ser Asp Pro Lys Ser Ala Asp130 135 140Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly145 150 155 160Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile165 170 175Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu180 185 190Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His195 200 205Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg210 215 220Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys225 230 235 240Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu245 250 255Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr260 265 270Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu275 280 285Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp290 295 300Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val305 310 315 320Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp325 330 335Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
340 345 350Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro355 360 365Gly Lys370<210>5<211>371<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有CD15引导子的鼠IL-15/Fc的氨基酸序列(人突变的IL-15，鼠IgG2A)<400>5Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly1 5 10 15Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp20 25 30Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr35 40 45Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met50 55 60Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp65 70 75 80Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn85 90 95Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys100 105 110Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Asp Ser Phe Val115 120 125His Ile Val Asp Met Phe Ile Asn Thr Ser Asp Pro Arg Gly Pro Thr
130 135 140Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly145 150 155 160Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met165 170 175Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu180 185 190Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val195 200 205His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu210 215 220Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly225 230 235 240Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile245 250 255Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val260 265 270Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr275 280 285Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu290 295 300Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro305 310 315 320Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val325 330 335Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val340 345 350His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr355 360 365Pro Gly Lys370
权利要求
1.含有一个或多个核酸的表达系统，其包括a)至少一个编码IL-15/Fc融合蛋白的核酸，b)至少一个启动子，c)至少一个编码CD5引导子的核酸，该启动子和该编码CD5引导子的核酸被功能性的连接到编码该IL-15/Fc融合蛋白的核酸。
2.根据权利要求1所述的表达系统，其中该启动子是CMV启动子。
3.根据权利要求1或2所述的表达系统，其中该启动子是转录调控单位的一部分，该转录调控单位还包括内含子，特别是内含子A。
4.根据权利要求1至3任何一项所述的表达系统，其中该融合蛋白的Fc部分是免疫球蛋白G的Fc片段。
5.根据权利要求1至4任何一项所述的表达系统，另外还包括d)至少一个编码选择标记基因的核酸。
6.根据权利要求1至5任何一项所述的表达系统，另外还包括至少一个多聚腺苷酸信号的核酸。
7.根据权利要求1至6任何一项所述的表达系统，另外还包括核糖体、氨基酸和/或tRNAs。
8.根据权利要求1至7任何一项所述的表达系统，其中仅包括一个核酸。
9.根据权利要求1至8任何一项所述的表达系统，其含有具有SEQ ID No.1，SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的序列的核酸或编码SEQID No.4或SEQ ID No.5的多肽的核酸。
10.一种核酸，其包括权利要求1至4所述的组分a)到c)以及可选择的包括权利要求5的组分d)。
11.一种核酸，其包括SEQ ID No.1，SEQ ID No.2或SEQ IDNo.3的序列，或者编码SEQ ID No.4或SEQ ID No.5的多肽的核酸。
12.一种宿主细胞，其含有根据权利要求1至9任何一项所述的表达系统或者根据权利要求10或11所述的核酸。
13.根据权利要求12所述的宿主细胞，其是哺乳动物细胞。
14.根据权利要求12或13所述的宿主细胞，其是CHO细胞系或其衍生物，特别是CHO-K1细胞系的细胞。
15.一种制备IL-15/Fc融合蛋白的方法，其包括a.提供根据权利要求12至14任何一项所述的宿主细胞，b.培养该宿主细胞，c.选择，如果需要并d.分离表达的IL-15/Fc融合蛋白。
16.根据权利要求15所述的方法，其中该宿主细胞是哺乳动物细胞，优选CHO细胞系或其衍生物的细胞，特别优选CHO-K1细胞系的细胞。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中制备的IL-15/Fc融合蛋白的量至少为10pg/(细胞x天)，优选的量为至少15pg/(细胞x天)。
18.根据权利要求1至9任何一项所述的表达系统、根据权利要求10或11所述的核酸、或根据权利要求12至14任何一项所述的宿主细胞在制备IL-15-Fc融合蛋白中的用途。
19.CD5引导子在CHO细胞及其衍生物，特别是在CHO-K1细胞中表达蛋白的用途。
20.根据权利要求19所述的用途，其中该蛋白的表达受CMV启动子的调控，特别是与内含子A联合的CMV启动子的调控。
全文摘要
本发明涉及含有一个或多个核酸的表达系统，其包括至少一个编码白细胞介素15/Fc(IL－15/Fc)融合蛋白的核酸，至少一个启动子，至少一个编码CD5引导子的核酸，如果需要，至少一个编码选择标记基因的核酸；本发明涉及包括所述表达系统的组分的核酸，并且涉及含有该表达系统或该核酸的宿主细胞。而且，本发明涉及使用该表达系统制备IL－15/Fc融合蛋白的方法，并涉及该表达系统、该核酸、该宿主细胞或用于在宿主细胞表达CD5引导子的用途。
文档编号C12N15/62GK1942481SQ200580011056
公开日2007年4月4日 申请日期2005年4月13日 优先权日2004年4月14日
发明者A·埃尔曼, I·德勒埃, T·莫尔, S·扎恩 申请人:豪夫迈－罗氏公司