改良核酸表达的新序列的制作方法

专利名称：：改良核酸表达的新序列的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分子生物学和生物
技术领域：
。更特别地，本发明涉及改良可在宿主细胞中编码蛋白质的一或多种核酸的产生的手段和方法。可以在多种宿主细胞中产生的蛋白质在生物学和生物技术学中具有广泛应用，例如可用于生物制药学。这种产生方法已经确立，通常是使编码感兴趣蛋白质的核酸(也称作转基因)在宿主细胞中表达。与转基因的表达相关的一个问题是其是不可预知的，这是由于转基因由于基因沉默而将变得无活性的高度可能性(McBurneyetal.，2002)，因此对于转基因的高表达需要测试许多宿主细胞克隆。另外，一旦这种克隆已经确定，则所述转基因的表达通常是不稳定的，在延长的宿主细胞培养期间常常观测到转基因表达沉默的现象。在脊椎动物细胞中，这可能是由于异染色质在转基因座形成，阻止了转基因的转录所致(Whitelawetal，2001)。转基因沉默是随机的，其通常可以在转基因整合进基因组之中后立刻发生，或者只是在细胞分化之后发生。这样在延长的培养之后产生异质细胞群，其中一些细胞持续表达高水平的重组蛋白质，而其它细胞表达低水平或者不可检测水平的蛋白质(Martin&Whitelaw，1996，McBurneyetal.，2002)。用于产生异源蛋白质的细胞系衍生自单一细胞，通常对其按比例扩大并长期维持在1000升或更大体积的培养器中每毫升1千万个细胞以上的密度。这些大细胞群(1014-1016个细胞)由于转基因沉默而倾向于生产力明显下降(Migliaccioetal.，2000，Strutzenbergeretal.，1999)。克服上述问题的一种可能性是在表达系统中应用所谓的STAR序列。多种这样的STAR序列在WO03/004704中描述。这些序列可用于在一些类型宿主细胞中使用表达构建体而改良蛋白质生产的可预测性、产量和/或稳定性(WO03/004704；Kwaksetal，2003)。国际出版物WO03/106674描述了STAR序列在一些细胞系中表达编码重组蛋白质的核酸的应用。国际出版物WO03/106684描述了STAR序列表达编码多聚体蛋白质如抗体的核酸的应用。本发明提供了改良蛋白质生产的另外的手段和方法。发明概述一方面，本发明提供了包含选自如下一组的具有抗阻抑物活性的核酸序列的重组核酸分子a)SEQ.ID.NO.66，b)SEQ.ID.NO.66的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性，c)与a)或b)的核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性，及d)与a)-c)任一序列互补的序列；所述重组核酸分子进一步包含表达盒，所述表达盒包含与感兴趣核酸连接的异源启动子，且其中所述感兴趣核酸优选编码全部或部分感兴趣蛋白质。在一个优选的实施方案中，所述具有抗阻抑物活性的核酸序列位于所述表达盒中所述启动子的上游，在其特别优选的实施方案中，所述具有抗阻抑物活性的序列和所述启动子间隔少于2kb。在某些实施方案中，所述编码感兴趣蛋白质的核酸存在于多顺反子基因中，所述多顺反子基因进一步编码可选择标记基因。在某些实施方案中，所述分子进一步包含至少一个其它具有抗阻抑物活性的序列，所述至少一个其它序列选自a)SEQ.ID.NO.1-65任一序列；b)SEQ.ID.NO.1-65任一序列的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性；c)与a)或b)核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性；及d)与a)-c)任一序列互补的序列。本发明还提供了包含表达盒的重组核酸分子，其包含5’-抗阻抑物序列A-启动子-编码全部或者部分感兴趣蛋白质的核酸-抗阻抑物序列B-3’，其中抗阻抑物序列A和B可以相同或不同，并选自(i)SEQ.ID.NO.1-65任一序列；(ii)SEQ.ID.NO.1-65任一序列的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性；(iii)与a)或b)核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性；及(iv)与(i)-(iii)任一序列互补的序列，特征在于所述表达盒在所述抗阻抑物序列A和B之间进一步包含具有抗阻抑物活性的序列，该序列选自a)SEQ.ID.NO.66；b)SEQ.ID.NO.66的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性；c)与a)或b)核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性；及d)与a)-c)任一序列互补的序列。本发明进一步提供了包含本发明分子的细胞。优选所述细胞是哺乳动物细胞，在某些实施方案中所述细胞是CHO细胞。本发明进一步提供了一种生产感兴趣蛋白质的方法，包括培养包含编码感兴趣蛋白质的重组核酸分子的细胞，以在所述细胞中表达编码感兴趣蛋白质的所述核酸，其特征在于所述重组核酸分子包含具有抗阻抑物活性的、选自如下一组的核酸序列a)SEQ.ID.NO.66，b)SEQ.ID.NO.66的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性，c)与a)或b)核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性；及d)与a)-c)任一序列互补的序列。在一个优选的实施方案中，所述方法进一步包括分离所述感兴趣蛋白质。在优选的实施方案中，所述具有抗阻抑物活性的核酸序列位于控制感兴趣蛋白质表达的启动子的上游。在其优选的实施方案中，所述具有抗阻抑物活性的序列与所述启动子间隔少于2kb。在某些实施方案中，所述编码感兴趣蛋白质的核酸存在于多顺反子基因中，所述多顺反子基因进一步编码可选择标记基因。在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞，例如CHO细胞。本发明还提供了选自如下一组的具有抗阻抑物活性的核酸序列在增加感兴趣核酸表达中的应用a)SEQ.ID.NO.66；b)SEQ.ID.NO.66的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性；c)与a)或b)核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性；及d)与a)-c)任一序列互补的序列。另一方面，本发明提供了一种产生表达两种感兴趣多肽的宿主细胞的方法，所述方法包括a)向宿主细胞中导入一或多种核酸分子，所述一种核酸分子或多种核酸分子一起包含(i)与编码第一种感兴趣多肽和第一种可选择标记基因的序列功能性连接的启动子，及(ii)与编码第二种感兴趣多肽和第二种可选择标记基因的序列功能性连接的启动子，及(iii)具有抗阻抑物活性的至少一个序列，选自(a)SEQ.ID.NO.1-66任一序列，(b)SEQ.ID.NO.1-66任一序列的片段，所述片段具有抗阻抑物活性，(c)与(a)或(b)至少70％相同并具有抗阻抑物活性的序列，及(d)与(a)-(c)任一序列互补的序列；b)通过基本上同时选择表达所述第一种和第二种可选择标记基因而选择宿主细胞。本发明还提供了表达两种感兴趣多肽的方法，所述方法包括培养通过本发明的方法获得的宿主细胞以表达所述第一种和第二种多肽，及任选分离所述多肽。在一个实施方案中，所述具有抗阻抑物活性的序列选自a)SEQ.ID.NO.66，b)SEQ.ID.NO.66的片段，其中所述片段具有抗阻抑物活性，c)与a)或b)核苷酸序列至少70％相同的序列，其中所述序列具有抗阻抑物活性，及d)与a)-c)任一序列互补的序列。在某些实施方案中，所述两种多肽是多聚体蛋白质的一部分。发明详述抗阻抑物序列本发明使用的具有抗阻抑物活性的序列是当HP1或HPC2蛋白质与DNA结合(tether)时，能至少部分抵消这些蛋白质的阻抑作用的序列。适于本发明的具有抗阻抑物活性的序列(在本文有时也称作抗阻抑物序列或者抗阻抑物元件)在WO03/004704中揭示，其并入本文参考，在该文章中将其称作STAR序列(在本文中无论什么情况下将一序列称作STAR序列，则该序列具有本发明的抗阻抑物活性)。作为非限制性的例子，称作STAR1-65的65个抗阻抑物元件的序列(见WO03/004704)在本文分别以SEQ.ID.NO.1-65表示。根据本发明，一指定抗阻抑物元件的功能性片段或衍生物当其仍具有抗阻抑物活性时，被认为与所述抗阻抑物元件等同。这种抗阻抑物活性的存在可易于由本领域技术人员例如通过下述分析而检测。功能性片段或者衍生物可易于由分子生物学领域技术人员通过用指定的抗阻抑物序列起始产生缺失、添加、取代、翻转等而获得(见例如WO03/004704)。功能性片段或者衍生物还包含其它物种的直向同源物(ortholog)，其可以被本领域技术人员通过已知方法使用已知的抗阻抑物序列发现(见例如WO03/004704)。因此，本发明涵盖抗阻抑物序列的片段，其中所述片段仍具有抗阻抑物活性。对于指定序列的片段，相同性百分比是指在该片段中发现的参考天然序列的部分。本发明还涵盖与所述具有抗阻抑物活性的序列或其具有抗阻抑物活性的功能片段在核苷酸序列水平至少70％相同的序列，只要这些至少70％相同的序列仍具有本发明的抗阻抑物活性。优选地，所述序列与参考天然序列或其功能片段至少80％相同、更优选至少90％相同、更优选至少95％相同。根据本发明具有抗阻抑物活性的序列可以通过多种方法获得，包括但不限于从人基因组或者另一种生物体的基因组中克隆，或者通过例如利用对序列的了解例如通过PCR从这种基因组中直接扩增已知抗阻抑物序列，或者可以部分或全部化学合成。具有抗阻抑物活性的序列或其功能片段或衍生物在本发明通过其序列在结构上加以限定，另外限定为具有抗阻抑物活性的序列进行功能性限定，使用下文所述分析确定。本发明的具有抗阻抑物活性的任何序列应至少能通过如下的功能分析(见WO03/004704，实施例1，并入本文作参考)。将人U-2OS细胞(ATCCHTB-96)用pTet-Off质粒(ClontechK1620-A)及用编码含有LexADNA结合结构域和HP1或HPC2编码区的LexA-阻抑物融合蛋白的核酸(当与DNA结合时抑制基因表达的果蝇Polycomb群蛋白质；该分析对任一融合蛋白质均起作用)，在Tet-Off转录调节系统(GossenandBuiard，1992)控制下稳定转染。这些细胞在下文抗阻抑物活性分析中称作报道细胞。提供潮霉素抗性的报道质粒位于四个LexA操纵基因位点与控制zeocin抗性基因的SV40启动子之间含有一个多接头序列。可以将测试抗阻抑物活性的序列克隆在所述多接头中。合适的报道质粒如pSelect的构建在WO00/004704的实施例1和图1中描述。将该报道质粒转染进报道细胞中，将该细胞在潮霉素选择(25μg/ml；针对报道质粒的存在而选择)和四环素抑制(强力霉素，10ng/ml；防止LexA-阻抑物融合蛋白表达)下培养。在这些条件下生长一周后，将强力霉素的浓度降低至0.1ng/ml(或更低)以诱导LexA-阻抑物基因，两天后加入250μg/ml的zeocin。将细胞培养5周，直至对照培养物(用空白报道质粒转染，即在多接头中没有克隆的抗阻抑物序列)被zeocin杀死(在这个对照质粒中，SV40启动子被与LexA操纵位点结合的LexA-阻抑物融合蛋白抑制，导致在这种细胞中无效的zeocin表达，以在zeocin选择中存活)。如果一个序列克隆在报道质粒的多接头中，所述报道细胞在zeocin选择下存活5周，则所述序列具有本发明的抗阻抑物活性。这种集落的细胞在zeocin选择5周后仍可以在含有zeocin的新培养基上增殖，而用没有抗阻抑物序列的报道质粒转染的细胞在含有zeocin的新培养基上不能增殖。在这个分析中在5周后不能赋予在zeocin上这种生长的任何序列不能认为是本发明具有抗阻抑物活性的序列或者其功能片段或者功能衍生物。例如，已知的边界序列如VanderVlag等(2000)测试的那些序列，包括果蝇scs(KellumandSchedl，1991)、鸡β-球蛋白基因座的5’-HS4(Chungetal，1993，1997)或者MatrixAttachmentRegions(MARs)(Phi-Vanetal.，1990)，在这个分析中不存活。另外，当与报道基因两侧无抗阻抑物或者具有较弱的阻抑封闭序列如Drosophilascs相对比时，优选位于整合进U-2OS或CHO细胞基因组中的报道基因(例如荧光素酶，GFP)两侧的所述抗阻抑物序列或者其功能片段或者衍生物产生较高比例的报道基因过表达克隆。这可以使用例如pSDH载体或者相似的载体证实，如WO03/004704的实施例1和图2所述。本发明的抗阻抑物元件可具有生产蛋白质的三个结果的至少一个(1)在工业可接受水平提高鉴别表达蛋白质的宿主细胞系的可预测性；(2)使得宿主细胞系的蛋白质产量增加；和/或(3)使得宿主细胞系在延长的培养期间呈现更稳定的蛋白质产生。这些特性在下文更详细地论述(1)可预测性提高转基因表达盒的整合可以在整个宿主细胞基因组的随机位置发生。然而，许多基因组是转录沉默的异染色质。当所述表达盒在转基因两侧包括抗阻抑物元件时，整合的位置对表达具有减弱的作用。所述抗阻抑物元件削弱相邻异染色质使转基因沉默的能力。因此，含有可接受表达水平的转基因的宿主细胞比例增加。当转染同量的DNA时，抗阻抑物序列的掺入与无抗阻抑物序列的相同转基因相比确实导致多至10倍的集落建立。(2)产量在转基因整合后立即测定原始重组宿主细胞群中蛋白质的表达水平。群体中的个体表达水平不同。然而，当所述转基因被抗阻抑物元件保护时，可变性降低。这种降低的可变性在回收低水平表达的较少克隆中是最显著的。另外，具有抗阻抑物元件的群体通常具有显著高水平表达的个体。这些高产量的个体对于蛋白质的产生是有利的，无论对于收获还是改变细胞或者包含这种细胞的生物体的表型均有利。(3)增加的稳定性抗阻抑物元件增加重组宿主细胞系中转基因的稳定性，通过保证转基因在延长的培养期间不被转录沉默而实现。对比试验表明，在未被抗阻抑物元件保护的转基因逐渐沉默的条件下(5-25传代培养)，抗阻抑物元件保护的转基因持续高水平表达。这在蛋白质样分子的工业化生产期间是有利的，在此期间细胞培养时间持续延长，从几周延长至几个月。相似地，延长期间的表达稳定性在由于抗阻抑物保护的转基因的重组表达而产生的表型改变的植物或动物中是有利的。STAR67本发明提供了具有抗阻抑物活性的新序列，其被称作STAR67(SEQ.ID.NO.66)。当将这种抗阻抑物序列置于驱动感兴趣基因表达的启动子的上游时明显增加表达，如本发明提供的实施例所揭示，而迄今为止已知的有效抗阻抑物序列如STAR6或者STAR7看起来在这种构型中不太有利(它们特别在位于在转基因两侧时起作用，即当位于转基因的上游和下游时)。因此，STAR67提供了已知的抗阻抑物序列的一种替代，当其被置于启动子上游时与已知的这类抗阻抑物序列相对比时具有增加的益处。STAR67不是增强子-阻断剂，与测试这种性质的其它抗阻抑物序列相反(Kwaksetal，2003)，其提供了STAR67与其它以前公开的抗阻抑物序列之间的另一种不同之处。STAR67可以双向方式操纵，如实施例7所示。根据本发明，表达盒中STAR67序列的存在提供了改良的可预测性和/或产量和/或表达稳定性。本发明论证了STAR67与多种启动子组合在不同细胞系中起作用。表达盒本发明的核酸分子，包括STAR67，可以是任何形式，例如是DNA片段，任选存在于克隆载体如质粒、优选表达载体上，并且可用于例如使用标准重组DNA技术进行克隆。在本发明优选的实施方案中，核酸包含表达盒，其可用于在例如宿主细胞中表达感兴趣的序列。如本文所用，“表达盒”是指包含与希望表达的序列功能性连接的至少一个启动子的核酸序列，希望表达的序列优选是编码全部或部分感兴趣蛋白质的开放读框。所述启动子优选对于所述感兴趣核酸而言是异源启动子，异源启动子是指不是所述感兴趣序列的天然启动子的启动子。换而言之，已经使用了一些人类干预形式例如分子克隆将异源启动子与感兴趣核酸功能组合，在本文中异源启动子可以衍生自与感兴趣序列相同或者不同的生物体。优选地，表达盒进一步含有转录终止和聚腺苷酸化序列。也可以包括其它调节序列如增强子。本发明的表达单位进一步包含至少一个抗阻抑物序列，如STAR67。在某些优选的实施方案中，所述抗阻抑物序列，优选STAR67，被置于所述启动子的上游，优选所述抗阻抑物序列的3’末端与启动子序列起始点之间间隔少于2kb。在优选的实施方案中，所述抗阻抑物序列的3’末端与启动子序列的起始点之间间隔少于1kb，更优选少于500个核苷酸(nt)，更优选少于大约200、100、50或者30个nt。在某些优选的实施方案中，所述抗阻抑物序列直接克隆在启动子的上游，导致抗阻抑物序列的3’末端与启动子序列起始点之间仅间隔大约0-20个nt。为了获得编码重组蛋白质的核酸序列的表达，本领域技术人员熟知可以将能驱动这种表达的序列与编码所述蛋白质的核酸序列功能性连接，产生可表达形式的编码重组蛋白质的重组核酸分子。通常，所述启动子序列置于编码感兴趣蛋白质的序列的上游。可用的表达载体可在本领域获得，例如Invitrogen的pcDNA和pEF载体系列，BDSciences的pMSCV和pTK-Hyg，Stratagene的pCMV-Script等等。在编码感兴趣多肽的序列正确插入控制编码的多肽的转录和翻译的序列中的情况中，所得表达盒可用于产生感兴趣蛋白质，这即称作表达。驱动表达的序列可包括启动子、增强子等，及其组合。这些序列应能在宿主细胞中起作用，从而驱动与其功能性连接的核酸序列的表达。本领域技术人员知道可以使用多种启动子获得感兴趣基因在宿主细胞中的表达。启动子可以是组成型或者被调节的，可以得自多种来源，包括病毒、原核生物或者真核生物来源，或者是人工设计的。感兴趣核酸的表达可以从天然启动子或其衍生物或者从完全异源的启动子中表达(Kaufman，2000)。用于在真核细胞中表达的一些熟知和常用的启动子包含衍生自病毒如腺病毒的启动子，例如E1A启动子，衍生自巨细胞病毒(CMV)的启动子，如CMV立即早期(IE)启动子(在本文称作CMV启动子)(可得自例如pcDNA，Invitrogen)，衍生自猿猴病毒40(SV40)的启动子(Dasetal，1985)等等。合适的启动子也可以衍生自真核细胞，如金属硫蛋白(MT)启动子，延伸因子1a(EF-1α)启动子(Gilletal.，2001)，遍在蛋白C或UB6启动子(Gilletal.，2001；Schorppetal，1996)，肌动蛋白启动子，免疫球蛋白启动子，热激启动子等等。适合本发明的在真核细胞中获得表达的一些优选启动子是CMV启动子，哺乳动物EF1-α启动子，哺乳动物遍在蛋白启动子如遍在蛋白C启动子，或者SV40启动子(例如可得自pIRES，cat.no.631605，BDSciences)。测试启动子功能和强度由本领域技术人员常规进行，通常可例如包括在启动子序列之后克隆一个测试基因如lacZ、荧光素酶、GFP等，并测试该测试基因的表达。当然，启动子可以通过对序列进行缺失、添加、突变而改变，并测试其功能性以发现新的弱化的或者改良的启动子序列。本发明的表达盒可以是单顺反子、双顺反子或者多顺反子的。术语“双顺反子基因”是指能提供编码两种蛋白质/多肽的RNA分子的基因。术语“单顺反子基因”是指能提供编码一种蛋白质/多肽的RNA分子的基因。术语“多顺反子基因”是指能提供编码两或多种蛋白质/多肽的RNA分子的基因，双顺反子基因因此包含在多顺反子基因的范畴内。本发明所用术语“基因”可包含染色体DNA，cDNA，人工DNA，其组合等，并且也可以是其它核酸形式，例如RNA。在某些实施方案中，蛋白质表达单位包含一个多顺反子基因。包含一些顺反子的单位可以转录为单一mRNA。该RNA上存在的第二个及其它编码区的翻译可以多种方式实现，包括使用翻译再引发位点或者内在核糖体进入位点，优选后者。双或多顺反子单位的一个优势是可以易于选择表达感兴趣蛋白质的克隆，通过将编码可选择标记蛋白的核酸置于编码感兴趣蛋白质或多肽的核酸下游而进行。对于多聚体蛋白质的产生，可以使用两或多个表达盒。这个实施方案经证实提供良好结果，例如抗体重链和轻链的表达。根据本发明，至少一种表达盒，但优选每种表达盒，均应包含STAR序列。在另一个实施方案中，多聚体蛋白质的不同亚单位或部分存在于一个表达盒中。代替或除了置于表达盒中启动子上游的抗阻抑物序列的存在之外，在表达盒的两侧具有抗阻抑物序列经证实是非常有益的，这样包含转基因的表达盒的两侧具有两个抗阻抑物序列，这两个序列在某些实施方案中基本上彼此相同。当然，这也可以用STAR67进行，获得在两侧具有两个STAR67序列的表达盒。表达盒中一个STAR67序列的其它位置例如在转基因之后也是可能的，优选在转录终止和聚腺苷酸化信号之后，STAR67序列的3’末端面对转基因。本发明的表达盒可任选包含一个选择标记基因。术语“选择标记或者可选择标记”典型用于描述其存在可以直接或者间接在细胞中检测的基因和/或蛋白质，例如使选择剂失活并且保护宿主细胞免于该制剂的致死或者生长抑制作用的基因和/或蛋白质(例如抗生素抗性基因和/或蛋白质)。另一种可能性是所述选择标记诱导荧光或者颜色沉积(例如绿色荧光蛋白及衍生物，荧光素酶，lacZ，碱性磷酸酶等等)。在某些实施方案中，用于本发明的选择标记是zeocin，对于选择第二种表达盒使用嘌呤霉素。本领域技术人员已知可以获得及利用其它选择标记，例如新霉素、杀稻瘟素、嘌呤霉素、博来霉素、潮霉素、dhfr等等。术语“选择”典型是指使用选择标记/可选择标记和选择剂鉴别具有特殊遗传性质的宿主细胞的过程(例如宿主细胞含有整合进其基因组中的转基因)。本领域技术人员明白可以将选择标记组合。可能的抗生素例子如上文提供。特别有利的一种抗生素是zeocin，因为zeocin-抗性蛋白(zeocin-R)通过结合药物并使其无害而起作用。因此，易于滴定测定杀死低水平表达zeocin-R的细胞的药物量，同时使得高水平表达的细胞存活。常用的所有其它抗生素抗性蛋白是酶，并因此通过催化起作用(与药物不是1∶1)。当进行两步选择时，因此优选使用具有这种1∶1结合作用模式的抗生素抗性蛋白。因此，抗生素zeocin是优选的选择标记。为方便起见，在两步选择方法中，zeocin抗生素可以组合例如嘌呤霉素、杀稻瘟素或者潮霉素，例如可存在于单顺反子基因中。也可以将抗生素选择标记与提供诱导荧光或者提供颜色沉积的选择标记组合。可以使用不同的启动子，只要其在使用的细胞中起作用即可。在某些实施方案中，提供了一种表达盒，其在例如感兴趣蛋白质的开放读框与选择标记开放读框之间具有(弱)内在核糖体结合位点(IRES)作为具有降低翻译效力的蛋白质翻译起始位点的例子。蛋白质从IRES元件中的翻译比帽依赖性翻译的效力低从IRES依赖性开放读框(ORF)中翻译的蛋白质的量比从第一个ORF中翻译的蛋白质的量低20％-50％(Mizuguchietal.，2000)。另外，IRES元件的突变可以使其活性弱化，并使从IRES依赖性ORF中的表达降低至低于从第一个ORF中表达的10％(LopezdeQuinto&Martinez-Salas，1998，Reesetal.，1996)。当IRES依赖性ORF编码一种可选择标记蛋白时，其相对低翻译水平意味着必须存在绝对高的转录水平以选择重组宿主细胞。因此，选择的重组宿主细胞分离株必需表达高量的转基因mRNA。因为重组蛋白质是从帽依赖性ORF中翻译的，因此其可以大量产生，导致高产物产量。常规的表达系统是重组质粒或者重组病毒基因组形式的DNA分子。通过本领域已知方法将质粒或者病毒基因组导入(真核宿主)细胞中，并优选整合进其基因组中。在优选的实施方案中，本发明还使用这些类型的DNA分子输送其改良的转基因表达系统。本发明的一个优选实施方案是使用质粒DNA输送表达系统。质粒含有许多成分本领域已知的常规成分是复制起点和可选择标记以使得质粒在细菌细胞中增殖；在真核细胞中起作用以鉴别和分离携带整合的转基因表达系统的宿主细胞的可选择标记；编码感兴趣蛋白质的核酸，其高水平转录通过在真核细胞中起作用的启动子进行(例如人巨细胞病毒主要立即早期启动子/增强子，pCMV(Boshartetal.，1985)；及感兴趣的转基因和可选择标记的转录终止子(例如SV40聚腺苷酸化位点(Kaufman&Sharp，1982)。使用的载体可以是适于克隆DNA并且可用于转录感兴趣核酸的任何载体。当使用宿主细胞时，优选所述载体是一种整合载体。或者，所述载体可以是附加型复制载体。图1提供了表达盒的可能构型的一些非限制性示意图。这是质粒中以及整合进基因组中之后表达盒的DNA元件的构型。构建体A含有包含编码蛋白质的开放读框的一个表达单位(基因)。其位于弱化的EMCVIRES(Martinez-Salasetal1999；Mizuguchietal2000；Reesetal1996)和编码zeocin抗性可选择标记蛋白(zeo)的开放读框的上游。所述基因盒在其3’末端具有SV40转录终止子(t)。这种双顺反子转基因从CMV启动子中高水平转录。构建体B衍生自构建体A，但是将STAR67克隆在CMV启动子的上游。构建体C衍生自构建体B，但是将两种抗阻抑物元件(在这种情况中是STAR7)克隆在完整表达盒的两侧。表达盒中抗阻抑物序列的组合本发明示出组合启动子上游的第一个抗阻抑物元件及表达盒两侧的两个其它抗阻抑物序列提供了极佳的结果。特别地，当在CHO细胞中使用SV40启动子时，在没有抗阻抑物序列的条件下表达已经非常高，但是当将STAR67置于所述启动子上游及在完整表达盒两侧具有两个抗阻抑物元件如STARβ、STAR7或STAR40时，表达显著增强。因此，本发明的一个目的是提供包含表达盒的重组核酸分子，所述表达盒包含(从5’至3’)抗阻抑物序列A-启动子-编码感兴趣蛋白质的核酸-抗阻抑物序列B，特征在于所述表达盒在所述抗阻抑物序列A与B之间进一步包含一个抗阻抑物序列C。在一个优选的实施方案中，所述抗阻抑物序列C存在于所述启动子的上游，如上述标题为“表达盒”的段落中描述的构型。抗阻抑物序列A与B之间的表达盒可进一步包含如上述表达盒的元件，例如转录终止子序列、聚腺苷酸化信号、选择标记基因、增强子等等，并且可以是如上述单顺反子、双顺反子或者多顺反子。抗阻抑物序列A、B和C的两个或所有三个可以相同或所有三个可以不同。抗阻抑物序列A和B可以与抗阻抑物序列C相同或不同。在某些实施方案中，抗阻抑物序列A和B彼此(基本)相同。在一个实施方案中，抗阻抑物序列C是STAR67或者其功能片段或衍生物。抗阻抑物序列A和B可以是任何抗阻抑物序列，在某些实施方案中包含SEQ.ID.NO.1-65之一或其功能片段或衍生物。在某些实施方案中，表达盒含有一个多顺反子基因，在其优选的实施方案中，所述多顺反子基因包含编码感兴趣蛋白质和选择标记基因的序列。或者，选择标记基因在单独的启动子控制下存在。在某些实施方案中，在STAR序列A与B之间可以存在第四个抗阻抑物序列D。在这种实施方案中，所述抗阻抑物序列D优选位于编码感兴趣蛋白质的核酸的下游。再者，这个抗阻抑物序列D与重组核酸分子中的其它抗阻抑物序列可以相同或不同，其可以是任何抗阻抑物序列，在某些实施方案中其选自SEQ.ID.NO.1-66任一序列或其功能片段或衍生物。由于至少一些抗阻抑物序列可以是有方向的(WO00/004704)，因此在表达盒两侧的抗阻抑物序列(抗阻抑物序列A和B)可以彼此相反方向放置，由此这些抗阻抑物的3’末端向内面向表达盒(及彼此向内面向)。因此，在优选的实施方案中，抗阻抑物元件的5’末端面向DNA/染色质，其对转基因的影响通过所述抗阻抑物元件而降低。对于表达盒中启动子上游的抗阻抑物序列而言，3’末端面向启动子。除非特别指出，则序列表中的抗阻抑物元件的序列(SEQ.ID.NO.1-66)是以5’至3’方向提供的。本发明的细胞包含本发明的STAR序列和/或表达盒的核酸分子可用于改良核酸的表达，优选在宿主细胞中的表达。术语“细胞‘V’宿主细胞”及“细胞系‘V’宿主细胞系”典型分别是指通过本领域已知的方法在细胞培养中可以保持并且具有表达异源或者同源蛋白质的能力的细胞及其同种群。本发明的宿主细胞优选是真核细胞，更优选是哺乳动物细胞，如啮齿动物细胞或者人细胞或者不同细胞的融合体。在某些非限制性实施方案中，所述宿主细胞是U-2OS骨肉瘤、CHO(中国仓鼠卵巢)、HEK293、HuNS-1骨髓瘤、WERI-Rb-1成视网膜细胞瘤、BHK、Vero、非分泌性小鼠骨髓瘤Sp2/0-Ag14、非分泌性小鼠骨髓瘤NSO、NCI-H295R肾上腺癌或者PER.C6细胞。在本发明的某些实施方案中，宿主细胞是表达腺病毒的至少E1A、优选也表达E1B的细胞。作为非限制性的例子，这种细胞可以衍生自例如人体细胞，例如衍生自肾(例如HEK293细胞，见Grahametal，1977所述)、肺(例如A549，见例如WO98/39411所述)或者视网膜(例如HER细胞，商品名为PER.C6，见美国专利5,994,128所述)，或者衍生自羊水(例如N52.E6，见美国专利6,558,948所述)及相似地衍生自其它细胞。获得这种细胞的方法见例如美国专利5,994,128和US6,558,948所述。本发明应用的PER.C6细胞是在ECACC保藏号为96022940的细胞的上游或下游传代或者上游或下游传代的后代。先前已经示出这种细胞能高水平表达蛋白质(例如WO00/63403及Jonesetal，2003所述)。表达本发明所需蛋白质的这种宿主细胞可以通过将本发明的核酸分子、优选表达盒形式导入细胞中而获得。在另一个实施方案中，将STAR67序列定向整合进染色体区域中以改良已经整合进该基因组中的感兴趣基因的表达，例如天然发生的基因，任选在靶向所述基因上游的异源启动子控制下调节所述基因的表达。优选地，所述宿主细胞来自可以根据本领域技术人员已知的标准方法选择和增殖的稳定克隆。这种克隆的培养物能产生感兴趣的重组蛋白质。本发明的细胞优选能在无血清的培养基中悬浮生长。本发明的感兴趣蛋白质可以是任何蛋白质，可以是单体蛋白质或者多聚体蛋白质。多聚体蛋白质包含至少两个多肽链。感兴趣蛋白质的非限制性例子是酶、激素、免疫球蛋白链、治疗性蛋白质如抗癌蛋白质、血液凝聚蛋白如因子VIII，、多功能蛋白质如红细胞生成素、诊断性蛋白质、或者用于接种目的的蛋白质或其片段，所有这些蛋白质均为本领域技术人员所已知。在某些实施方案中，本发明的表达盒编码免疫球蛋白重链或轻链或其抗原结合部分、衍生物和/或相似物。在一个优选的实施方案中，提供了本发明的蛋白质表达单位，其中所述感兴趣蛋白质是免疫球蛋白重链。在另一个优选的实施方案中，提供了本发明的蛋白质表达单位，其中所述感兴趣蛋白质是免疫球蛋白轻链。当这两种蛋白质表达单位存在于同一(宿主)细胞中时，装配成多聚体蛋白质，更特别地装配成抗体。因此在某些实施方案中，感兴趣蛋白质是免疫球蛋白，如抗体，其是多聚体蛋白质。优选地，这种抗体是人或人源化抗体。在其某些实施方案中，这种抗体是IgG、IgA或者IgM抗体。免疫球蛋白可以由不同表达盒或者一个表达盒上的重链和轻链编码，其中编码每个链的基因可以在多顺反子转录单位中单独启动子的控制下，或者这两个链均可在多顺反子基因上编码。感兴趣蛋白质可以来自任何来源，在某些实施方案中是哺乳动物蛋白质，人工蛋白质(例如融合蛋白或者突变蛋白)，优选是人蛋白质。显而易见，当最终的目的不是生产蛋白质而是RNA自身时，也可以使用本发明的抗阻抑物序列和表达盒构型，例如从表达盒中生产增加数量的RNA，这可用于调节其它基因(例如RNAi，反义RNA)、基因治疗、体外蛋白质产生等目的。生产感兴趣蛋白质的方法一方面，本发明提供了一种表达感兴趣序列、优选编码感兴趣蛋白质的序列的方法，通过提供具有本发明的核酸分子或者表达盒的宿主细胞、培养该细胞并表达感兴趣序列而进行。术语“表达”典型用于描述细胞中特异的一或多种RNA产物或者特异的一或多种蛋白质的产生。在RNA产物的情况中，表达是指转录过程。在蛋白质产物的情况中，表达是指转录、翻译及任选翻译后修饰(例如糖基化、二硫键形成等)的过程。在分泌的蛋白质的情况中，表达是指转录、翻译、及任选翻译后修饰及随后的分泌过程。导入要在细胞中表达的核酸可以通过如本领域技术人员已知的几种方法之一进行，也依赖于导入的核酸的形式。所述方法包括但不限于转染、感染、注射、转化等。对细胞进行培养是使其能代谢和/或生长和/或分裂和/或产生感兴趣的重组蛋白质。这种培养可以通过本领域技术人员熟知的方法实现，包括但不限于为细胞提供营养。所述方法包括附着在表面生长、悬浮生长或其组合。培养可以例如在培养皿、滚瓶或者在生物反应器中进行，使用分批培养、补料分批培养、持续系统如灌注系统等方式进行。为了达到在细胞培养期间大规模(持续)产生重组蛋白质，优选使细胞能悬浮生长，及优选使细胞能在无得自动物或人的血清或者得自动物或人的血清成分的条件下培养。生长或者繁殖细胞的条件(见例如TissueCulture，AcademicPress，KruseandPaterson，editors(1973))及表达重组产物的条件为本领域技术人员所已知。通常，使哺乳动物细胞培养物的生产力最大化的原理、方案及实践技术可见于MammalianCellBiotechnologyaPracticalApproach(M.Butler，ed.，IRLPress，1991)所述。在一个优选实施方案中，从细胞或者培养基或者这两者中收集(分离)表达的蛋白质。然后使用本领域技术人员通常已知的方法进一步纯化，例如通过过滤、柱层析等。新的选择方法本发明揭示了一种产生表达两种感兴趣多肽的宿主细胞的新方法，所述方法提供了令人惊奇的良好结果，不使用抗阻抑物序列则几乎没有或没有集落出现，而存在抗阻抑物序列则导致克隆在选择下存活，这些克隆通常高水平表达感兴趣的两种多肽(实施例7，图11)。本发明因此提供了一种产生表达两种感兴趣多肽的宿主细胞的方法，所述方法包括a)向宿主细胞中导入一或多种核酸分子，所述核酸分子包含(i)与编码第一种感兴趣多肽和第一种可选择标记基因的序列功能性连接的启动子，及(ii)与编码第二种感兴趣多肽和第二种可选择标记的序列功能性连接的启动子，及(iii)至少一种抗阻抑物序列，其选自(a)SEQ.ID.NO.1-66任一序列，(b)SEQ.ID.NO.1-66任一序列的片段，所述片段具有抗阻抑物活性，(c)与(a)或(b)至少70％相同并具有抗阻抑物活性的序列，及(d)与(a)-(c)任一序列互补的序列；b)通过基本上同时选择表达所述第一种和第二种可选择标记基因而选择宿主细胞。选择的宿主细胞可便利地用于表达所述两种多肽，通过培养所述选择的宿主细胞进行。在一个实施方案中，两种核酸分子用于导入宿主细胞中，所述分子之一含有(i)，另一分子含有(ii)。在这个实施方案中，每个核酸分子优选含有至少一种所述抗阻抑物序列。在另一个实施方案中，使用含有(i)和(ii)两者的一个核酸分子，其然后必须含有至少一个所述抗阻抑物序列。在一个核酸分子上具有这两种多肽的编码序列的一个优势是在将核酸导入细胞之前仅需要一种核酸制品。另外，在这种实施方案中，一次整合对于两种多肽的编码序列即足够，从而避免了编码第一种多肽的核酸与编码第二种多肽的核酸整合位置不同或者具有不同拷贝数的可能性。在优选的实施方案中，所述两种多肽可以形成多聚体蛋白质如免疫球蛋白的部分。所述方法因此特别适于表达抗体。所述两个启动子可以相同或不同，可以是前述任何启动子。当使用含有(i)和(ii)两者的一个核酸分子时，这一个核酸分子上的两个转录单位的方向可例如是同向的或者彼此面向反向或者彼此向外反向的。在后者情况中，所述抗阻抑物序列可以置于两个启动子之间(例如图HB所示)。适合本发明这方面的一个抗阻抑物序列是SEQ.ID.NO.66(见实施例7)，但是其它抗阻抑物序列也可以起作用。这可易于由本领域技术人员使用本文揭示的方法测试，因此本发明这方面使用其它抗阻抑物序列也包含在本发明范围内。另外，抗阻抑物序列可以添加在一或两个转录单位两侧。标记基因必须是不同的，可例如选自如前述的标记基因。在某些实施方案中，一种可选择标记是zeocin，另一可选择标记是例如嘌呤霉素。然而，应清楚可以使用其它组合，这也包含在本发明这方面范围内。标记的表达应优选依赖于感兴趣多肽的表达。这可以通过将标记基因的表达与感兴趣多肽的表达联系起来而建立，例如使用多顺反子基因进行，例如使用如前述IRES序列。“基本上同时”选择是指至少在部分时间、优选至少一天、更优选至少两天、更优选至少五天，这两种选择剂均存在，这可以通过将这两种选择剂同时加入培养基中或者加入包含这两种选择剂的培养基而进行(例如实施例7所述)。应清楚在第一种选择剂已经存在于培养基中之后只是几小时或几天加入第二种选择剂在本发明仍意味着是基本上同时选择。这种情况有别于其中将细胞首先用第一种选择剂选择，一旦集落形成则将细胞在加入了第二种选择剂而没有第一种选择剂的新的培养基上选择的情况(连续选择，例如实施例5和WO03/106684所述)。通过基本上同时选择这两种可选择标记，本发明令人惊奇地提供了快速和强力的选择，从而消除了许多低产量的克隆，明显降低了发现具有所需表达特性的克隆的工作量。这对于生物技术工业特别有利，该行业在鉴别具有高表达水平的所需克隆之前通常需要筛选几百甚至几千个集落。另外，该系统提供了测试抗阻抑物元件、至少STAR67但也可以是其它抗阻抑物序列在这个系统中起作用的部分的功能性的可能性。这个简单筛选在许多情况中提供了几乎或者甚至完全显而易见的差异，因此有助于鉴别抗阻抑物序列的功能部分或衍生物，和/或有助于鉴定新的抗阻抑物序列。所述筛选甚至可用于发现新的抗阻抑物和/或表达增强序列(因为这种类型的筛选不是仅针对抗阻抑物活性而是针对增强表达的活性进行选择，因此其也可以发现具有后者而非前者活性的序列)。因此，本发明的另一方面提供了一种鉴别抗阻抑物和/或表达增强序列或其功能片段或衍生物的方法，所述方法包括a)向宿主细胞中导入一或多种核酸分子，所述一种核酸分子或多种核酸分子一起包含(i)与第一种可选择标记基因功能连接的启动子，及(ii)与第二种可选择标记功能连接的启动子，及(iii)要测试抗阻抑物和/或表达增强活性的至少一个序列；b)通过基本同时选择所述第一种和第二种可选择标记基因的表达选择宿主细胞。经过这种筛选存活的细胞很可能含有功能性抗阻抑物和/或表达增强元件。然后对这种元件可易于进一步分析，例如通过确定其序列和/或通过将其进行如上述抗阻抑物活性的其它功能测试而分析。在一个实施方案中，(i)和(ii)均在一个核酸分子上，例如由启动子分隔(第一个和第二个可选择标记向外反向)，在此之间可以克隆测试序列以进行分析。优选地，所述可选择标记基因不是高表达的，例如通过使用相对弱启动子直接驱动可选择标记基因，所述相对弱启动子是已知的和/或可以由本领域技术人员通过常规分析鉴别，或者例如使用强启动子进行转录，及使用IRES、优选如前述相对弱的IRES翻译标记基因。所述标记基因也可以便利地置于编码多肽的核酸序列的下游，并在多顺反子基因中例如通过IRES与其表达连接(例如实施例7所述，图11示出可能的构型)。这种多肽可同样是感兴趣的多肽，由此获得表达所述感兴趣多肽的直接可用克隆，但对于筛选目的也可以是其表达可易于量化的标记，例如GFP或其衍生物、SEAP、lacZ、荧光素酶等等。在这种组合中，多肽的表达可以直接量化以挑选在同时选择期间提供足够的集落及提供高转录水平的抗阻抑物和/或表达增强元件或其片段。当“随机”核酸(即仍未知其具有抗阻抑物或表达增强活性的核酸)，例如基因组片段形式，用作测试序列测试抗阻抑物和/或表达增强活性时，可以发现新的抗阻抑物和/或表达增强序列。当测试已知抗阻抑物序列时，这个分析可用于对其进一步鉴定。当测试已知抗阻抑物序列的片段时，所述分析将提供这种已知抗阻抑物序列的功能片段。除非特别指出，实践本发明应用本领域技术人员已知的免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学及重组DNA等常规技术。见例如Sambrook，FritschandManiatis，MolecularCloningALaboratoryManual，2ndedition，1989；CurrentProtocolsinMolecularBiology，AusubelFM，etal，eds，1987；theseriesMethodsinEnzymology(AcademicPress，Inc.)；PCR2APracticalApproach，MacPhersonMJ，HamsBD，TaylorGR，eds，1995；AntibodiesALaboratoryManual，HarlowandLane，eds，1988所述。本发明在如下实施例中得以进一步解释。所述实施例非以任何方式限制本发明。所述实施例只是为了阐明本发明。实施例实施例1STAR67载体的构建使用如WO03/004704所述遗传筛选方法分离到一种新的抗阻抑物序列，将这个新序列称作STAR67(SEQ.ID.NO.66)。测试了STAR67对转基因在哺乳动物细胞中表达的作用。在此我们描述了各种构建体的构建。材料和方法产生三种质粒(图1)A)CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMV对照)，B)STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMV-STAR67)，C)STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7(CMV-STAR677/7)构建体A的构建如下所述。将质粒pd2EGFP(Clontech6010-1)通过在BsiWI位点插入一个接头而修饰，产生pd2EGFP-link。通过退火寡核苷酸GTACGGATATCAGATCTTTAATTAAG(SEQ.ID.NO.67)和GTACCTTAATTAAAGATCTGATAT(SEQ.ID.NO.68)产生的这一接头导入PacI、BglII和EcoRV限制性核酸内切酶位点。这样产生了多克隆位点MCSII用以插入STAR元件。然后使用引物GATCAGATCTGGCGCGCCATTTAAATCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG(SEQ.ID.NO.69)和(AGGCGGATCCGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGG(SEQ.ID.NO.70)扩增pd2EGFP中的一个0.37kb区域，将其插入在pIRES(Clontech6028-1)的BglII位点，产生pIRES-stuf。这样在MCSI导入AscI和SwaI限制性核酸内切酶的位点，并且作为“填充片段”避免STAR元件与相邻启动子之间的潜在干扰。将pIRES-stuf用BglII和FspI消化以释放由填充片段、CMV启动子、IRES元件(两侧为多克隆位点MCSA和MCSB)及SV40聚腺苷酸化信号组成的DNA片段。将这个片段与通过BamHI和StuI消化产生的pd2EGFP-link的载体主链连接，产生pIRES-link。如下所述将zeocin抗性基因的开放读框插入pIRES下游的BamHI/NotI位点通过使用引物GATCGGATCCTTCGAAATGGCCAAGTTGACCAGTGC(SEQ.ID.NO.71)和AGGCGCGGCCGCAATTCTCAGTCCTGCTCCTC(SEQ.ID.NO.72)经PCR从质粒pCMV/zeo(Invitrogen，cat.no.V50120)中扩增zeocin-抗性ORF，用BamHI和NotI消化，并与BamHI/NotI-消化的pIRES-link连接，产生pIRES-link-zeo。将d2EGFP报道ORF导入pIRES-link-zeo中，这通过使用引物GATCGAATTCTCGCGAATGGTGAGCAAGCAGATCCTGAAG(SEQ.ID.NO.73)和AGGCGAATTCACCGGTGTTTAAACTTACACCCACTCGTGCAGGCTGCCCAGG(SEQ.ID.NO.74)扩增pd2EGFP(Clontech6010-1)，及将EcoRI-消化的d2EGFP表达盒插入pIRES-link-zeo质粒中的EcoRI位点而进行。这样产生构建体A，即CMV-d2EGFP-IRES-Zeo(CMV对照)。将STAR67克隆在CMV启动子上游AscI位点(在STAR67与启动子之间保留大约15个核苷酸)。这样产生构建体B，即STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMV-STAR67)。还将STAR67置于还含有STAR7(SEQ.ID.NO.7)的表达盒中进行了测试，所述STAR7被定向克隆在5’SalI和XbaI位点以及3’BglII和PacI位点以使STAR7位于整个表达盒的两侧。这是构建体C(CMV-STAR677/7)。实施例2在稳定转染的CHO细胞中STAR67增强从CMV、EF1α和UB6启动子的表达水平我们测试了CMV、EF1α和UB6启动子邻近存在STAR67是否影响这些启动子在CHO细胞中的表达水平。用于这个目的的构建体是实施例1所述的构建体A和B(图1)，它们针对各自的启动子进行修饰1CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMV对照)2STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMV-STAR67)3EF1α-d2EGFP-ires-Zeo(EF1α对照)4STAR67-EF1α-d2EGFP-ires-Zeo(EF1α-STAR67)5UB6-d2EGFP-ires-Zeo(UB6对照)6STAR67-UB6-d2EGFP-ires-Zeo(UB6-STAR67).材料和方法将图1所述质粒中的CMV启动子更换为UB6和EF1α启动子。UB6启动子如下克隆。如实施例1所述，将pd2EGFP质粒的0.37kbDNA填充片段经使用SEQ.ID.NO.69和70引物进行PCR扩增。将所得DNA填充片段克隆进pUB6/V5-His[InvitrogenV250-20]的BglII位点，产生pUB6-stuf。从pUB6-stuf中，将一个AscI-SacI片段克隆进CMV-d2EGFP-IRES-Zeo中，从中除去CMV启动子。用pEF1α/V5-His[InvitrogenV920-20]作为模板使用引物GATCGGCGCGCCATTTAAATCCGAAAAGTGCCACCTGACG(SEQ.ID.NO.79)和AGGCGGGACCCCCTCACGACACCTGAAATGGAAG(SEQ.ID.NO.80)经PCR扩增EF1α启动子。将PCR片段克隆进CMV-d2EGFP-IRES-Zeo的AscI和PpuMI位点，从中除去CMV启动子。将中国仓鼠卵巢细胞系CHO-K1(ATCCCCL-61)在HAMS-F12培养基+10％胎牛血清及2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素中在37℃/5％CO2条件下培养。使用SuperFect(QIAGEN)根据厂商所述将细胞用质粒转染。简而言之，将细胞接种在培养容器中并生长过夜至70-90％铺满。将SuperFect试剂与质粒DNA以6μl/μg比率组合(例如对于10cmPetri培养皿，使用20μgDNA和120μlSuperFect)并加入细胞中。在过夜保温后，将转染混和物用新鲜培养基置换并进一步保温转染的细胞。在过夜培养后，将细胞经胰蛋白酶消化并接种在具有新鲜培养基的新鲜培养容器中。在再次过夜保温之后，加入zeocin至浓度为50μg/ml并进一步培养细胞。过三天后，将培养基用含有zeocin(100μg/ml)的新鲜培养基置换并进一步培养。当可见各个集落时(大约转染后10天)，除去培养基，用无zeocin的新鲜培养基更换。分离各个克隆并移至无zeocin的24孔平板中。在分离集落1天后，向培养基中加入zeocin。在转染后大约3周评定d2EGFP报道基因的表达。两周后测定集落中的d2EGFP表达水平。当在转染后最初的两周后第一次测定d2EGFP时，将集落在无zeocin或者其它抗生素的培养基中培养。这持续至实验结束。结果图2示出了与无STAR67的“空白”对照CMV对照相比，含有克隆在CMV启动子上游的STAR67的构建体的转染产生了许多表达显著较高水平d2EGFP蛋白的CHO集落。当在转染后25天测定时，用CMV对照质粒转染的10个集落中d2EGFP信号平均值为34。在转染后60天，这10个集落中d2EGFP信号平均值降低为13，表明表达随着时间的推移是不稳定的。对比之下，当在转染后25天测定时用STAR67-CMV质粒转染的10个集落中d2EGFP信号的平均值为42，在转染后60天测定时为32。因此在转染后60天，在稳定转染的克隆中包含STAR67的CMV构建体比CMV启动子驱动的报道蛋白表达水平高2.5倍。重要的是在转染25天后，在第一次测定之后，通过将集落在无zeocin的培养基中培养而除去选择压力。因此，含有STAR67构建体的集落在无选择压力的条件下与不含STAR67构建体的集落相比随着时间的推移是更稳定的。图3示出了与无STAR67的“空白”对照EF1α对照相比，含有克隆在EF1α启动子上游的STAR67的构建体的转染产生了表达显著较高水平d2EGFP蛋白的许多CHO集落。当在转染后25天测定时，用EF1α对照质粒转染的10个集落中d2EGFP信号平均值为31。在转染后60天，这10个集落中信号平均值为26。对比之下，当在转染后25天测定时用EF1α-STAR67质粒转染的10个集落中d2EGFP信号的平均值为60，在转染后60天测定时为76。因此在转染后25和60天，在稳定转染的克隆中包含STAR67的EF1α构建体比EF1α启动子驱动的报道蛋白表达水平高2.9倍。图4示出了与无STAR67的“空白”对照UB6对照相比，含有克隆在UB6启动子上游的STAR67的构建体的转染产生了许多表达显著较高水平d2EGFP蛋白的CHO集落。当在转染后25天测定时，用UB6对照质粒转染的10个集落中d2EGFP信号平均值为51。在转染后60天，这10个集落中信号平均值为29，表明该表达随着时间的推移是不稳定的。对比之下，当在转染后25天测定时用UB6-STAR67质粒转染的10个集落中d2EGFP信号的平均值为218，在转染后60天测定时为224。因此在转染后25天，在稳定转染的克隆中包含STAR67的UB6构建体比UB6启动子驱动的报道蛋白表达水平高4.3倍。在60天后高7.7倍，这是由于对照集落的表达不稳定性和UB6-STAR67集落的稳定性所致。重要的是在转染25天后，在第一次测定后，通过将集落在无zeocin的培养基中培养而除去选择压力。因此，含有STAR67构建体的集落在无选择压力的条件下与不含有STAR67构建体的集落相比随着时间的推移是更稳定的。总之，STAR67增加从三种不同的彼此不相关的启动子的表达。实施例3在稳定转染的PER.C6细胞中STAR67增强从CMV、EF1α和UB6启动子的表达水平我们测试了在CMV、EF1α和UB6启动子邻近存在STAR67是否影响这些启动子在除了CHO细胞之外的另一种细胞类型即人PER.C6细胞中的表达水平。使用如实施例1中的相同构建体。材料和方法PER.C6细胞的转染、培养和分析将PER.Cβ细胞在DMEM培养基+吡哆醇+9％胎牛血清(非加热而失活)、8.9mMMgCl2、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素中在37℃/10％CO2条件下培养。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)如厂商所述将细胞用质粒转染。简而言之，将细胞接种在6孔平板中并生长过夜至70-90％铺满。将Lipofectamine试剂与质粒DNA以15μl/3μ比g率组合(例如对于10cmPetri培养皿，使用20μgDNA和120μlLipofectamine)，在25℃保温30分钟之后加入细胞中。在保温β小时之后，将转染混合物用新鲜培养基置换，并进一步保温转染的细胞。在培养过夜后，将细胞经胰蛋白酶消化并接种于(1∶15、1∶30、1∶60、1∶120稀释)新鲜petri培养皿(90mm)中的含有100μg/ml浓度的zeocin的新鲜培养基，进一步培养细胞。当可见集落时，通过刮擦分离各个集落并移至24孔平板中的含有zeocin的培养基中。当生长至大约70％铺满时，将细胞移至6孔平板中。将稳定的集落在6孔平板中扩增2周，之后在XL-MCLBeckmanCoulter流式细胞计量仪上确定d2EGFP信号。取d2EGFP信号的平均值作为d2EGFP表达水平的量值。2周后对集落再次测量。之后将集落在无zeocin的条件下进一步培养。结果图5示出了与无STAR67的“空白”对照CMV对照相比，含有克隆在CMV启动子上游的STAR67的构建体的转染产生了许多表达显著较高水平d2EGFP蛋白的PER.C6集落。当在转染后30天测定时，用CMV对照质粒转染的10个集落中d2EGFP信号平均值为37。在转染后60天，这10个集落中信号平均值降低为14，表明该表达随着时间的推移是不稳定的。对比之下，当在转染后30天测定时用STAR67-CMV质粒转染的10个集落中d2EGFP信号的平均值为101，在转染后60天测定时为45。因此在转染后60天，在稳定转染的克隆中包含STAR67的CMV构建体比CMV启动子驱动的报道蛋白表达水平高3.2倍。图6示出与无STAR67的“空白”对照EF1α对照相比，含有克隆在EF1α-启动子上游的STAR67的构建体的转染产生了许多表达显著较高水平d2EGFP蛋白的PER.C6集落。在转染30天后测定时，用EF1α对照质粒转染的10个集落中d2EGFP信号的平均值为5。在转染60天后这10个集落中d2EGFP信号平均值为6。对比之下，当在30天后测定时，用EF1α-STAR67质粒转染的10个集落中d2EGFP信号平均值为25，在转染后60天测定时为20。因此，在转染后30和60天，在稳定转染的克隆中包含STAR67的EF1α构建体比EF1α启动子驱动的报道蛋白表达水平高4倍。图7示出与无STAR67的“空白”对照UB6对照相比，含有克隆在UB6启动子上游的STAR67的构建体的转染产生了许多表达显著较高水平d2EGFP蛋白的PER.C6集落。在转染30天后测定时，用UB6对照质粒转染的10个集落中d2EGFP信号的平均值为4。在转染60天后这10个集落中d2EGFP信号平均值为2。对比之下，当在30天后测定时，用UB6-STAR67质粒转染的10个集落中d2EGFP信号平均值为27，在转染后60天测定时为18。因此，在转染后30和60天，在稳定转染的克隆中包含STAR67的UB6构建体比UB6启动子驱动的报道蛋白表达水平高7-9倍。因此，与无STAR67的构建体相对比，将STAR67置于启动子上游在PER.C6细胞中产生显著较高的蛋白质表达水平。因此STAR67在不同的彼此不相关的细胞类型中均起作用。实施例4STAR67组合其它抗阻抑物元件的新构型在CHO细胞中增强SV40启动子我们测试了SV40启动子邻近单独存在STAR67或者存在STAR67与另一种抗阻抑物元件(在这个实施例中是STAR7)的组合是否影响这个启动子的表达水平。用于这个目的的构建体是(见图8)1SV40-d2EGFP-ires-Zeo(SV40Control)2STAR67-SV40-d2EGFP-ires-Zeo(SV40-STAR67)3STAR7-SV40-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7(SV40-STAR7/7)4STAR7-STAR67-SV40--d2EGFP-ires-Zeo-STAR7(SV40-STAR677/7)材料和方法使用pIRES作模板，使用如下引物将SV40启动子经PCR扩增TTGGTTGGGGCGCGCCGCAGCACCATGGCCTGAAATAACCTCTGAAAGAGG(SEQ.ID.NO.81)和TTGGTTGGGAGCTCAAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCAAAAAAGCCTCCTC(SEQ.ID.NO.82)。将PCR片段克隆进CMV-d2EGFP-IRES-Zeo的AscI和SacI位点，从中除去CMV启动子。如实施例2所述转染CHO细胞、分离集落及增殖和分析。结果图8示出了与无抗阻抑物元件的“空白”对照(SV40对照)相比，含有克隆在SV40启动子上游的STAR67的构建体(SV40-STAR67)或者含有克隆在完整构建体两侧的STAR7的构建体(SV40-STAR7/7)的转染不产生表达明显较高水平d2EGFP蛋白的CHO集落。当在转染后40天测定时，用SV40对照质粒转染的18个集落中d2EGFP信号的平均水平为86。对比之下，当在40天后测定用SV40-STAR67质粒转染的18个集落中d2EGFP信号的平均水平为82，在40天后测定用SV40-STAR7/7质粒转染的18个集落中信号平均水平为91。因此，观测到这些抗阻抑物元件对CHO细胞中SV40启动子无明显作用。看起来在这些细胞中从SV40启动子的表达水平已经非常高，甚至高于用被认为是非常强的启动子的CMV启动子所观察到的表达水平。这种在CHO细胞中使用SV40启动子在无抗阻抑物元件的条件下的高背景表达，可以解释为什么观察到单独的STAR67或者位于转基因两侧的STAR7无明显作用。然而，当在40天后测定时，用SV40-STAR677/7质粒转染的18个集落中d2EGFP信号的平均水平为209，这比18个对照集落的平均水平(86)高2.4倍。因此，当STAR67元件与另一种抗阻抑物元件组合使用时，产生了许多示出显著较高d2EGFP表达水平的稳定转染的CHO集落。因此在这种新的构型中(5’-STAR序列A-STAR序列C-启动子-编码感兴趣蛋白质的核酸-STAR序列B-3’，其中在本实施例中STAR序列A和B是STAR7，STAR序列C是STAR67)，STAR元件的功能看起来均好于迄今为止揭示的构型。我们进行了其中两侧的STAR7元件由两侧的STAR6元件(SEQ.ID.NO.6)或者两侧的STAR4元件(SEQ.ID.NO.4)置换，组合SV40启动子上游的STAR67(分别为SV40-STAR676/6和SV40-STAR674/4，使用如上述相同命名法)的实验，使用这些组合也观测到改良的表达。这证实了两侧的STAR7元件可以用其它STAR序列置换，并仍观测到具有STAR序列的表达盒的新构型的改良作用。实施例5STAR67与STAR7的组合在稳定转染的CHO细胞中增强UB6驱动的抗体表达水平在实施例4中，我们示出STAR67与STAR7的组合增强了CHO细胞中d2EGFP蛋白的表达水平。在此我们测试了STAR67与STAR7的组合是否可用于产生抗体。我们选择抗EpCAM分子的抗体(Hulsetal，1999)作为测试蛋白，并使用UB6启动子。材料和方法质粒将重链cDNA(HC-EpCAM)克隆进包含UB6启动子的构建体中。将HC-EpCAM通过IRES序列与Zeocin抗性基因结合。将轻链cDNA(LC-EpCAM)也克隆进包含UB6启动子的构建体中。将LC-EpCAM通过IRES序列与嘌呤霉素抗性基因结合。这两个质粒代表UB6(HC+LC)对照质粒(图9)。为了测试STAR67和STAR7的作用，将STAR67克隆进这两个HC+LC构建体中UB6启动子的上游。STAR7克隆在完整表达盒的两侧5’和3’末端(图9)。这两个质粒代表STAR7-STAR67-UB6(HC+LC)STAR7。CHO细胞的转染和培养将中国仓鼠卵巢细胞系CHO-K1(ATCCCCL-61)如实施例2所述转染和培养，使用zeocin(100μg/ml)和嘌呤霉素(2.5μg/ml)进行选择。在转染后1天，向培养基中加入zeocin。当可见第一个集落时(大约加入zeocin7天后)，除去培养基并用含有嘌呤霉素的培养基置换。在大约7天后，分离集落并移至24孔平板中仅含有zeocin的培养基中。结果图9示出与没有STAR67和STAR7的“空白”对照UB6(HC+LC)对照相对比，含有克隆在UB6启动子上游的STAR67及克隆在完整表达盒两侧的两个STAR7元件的抗体构建体的转染产生了大量表达显著较高水平EpCAM抗体的CHO集落(使用抗人IgG抗体通过ELISA测定)。当在转染后25天测定时，用UB6(HC+LC)对照质粒转染的18个集落中EpCAM的产量平均为2.7pg/细胞/天。25天后除去选择剂zeocin和嘌呤霉素。转染后45天，这18个集落中EpCAM的产量平均为2.7pg/细胞/天。对比之下，当在转染后25天测定时，用STAR7-STAR67-UB6(HC+LC)-STAR7质粒转染的18个集落中EpCAM产量信号平均为6.7pg/细胞/天，在转染后45天测定时是7.7pg/细胞/天。因此，在转染30和45天后，在稳定转染的CHO克隆中包含STAR67/STAR7的UB6构建体与UB6启动子驱动的EpCAM表达水平相比高2.5-2.9倍。因此，与不含STAR67/STAR7的构建体相比，将STAR67置于启动子上游及将两个STAR7元件置于表达盒两侧导致CHO细胞中显著较高的EpCAM抗体表达水平。实施例6STAR67不是增强子阻断剂(enhancerblocker)，而STAR6和STAR7是增强子阻断剂已对其性质进行了测试的迄今为止所有已知STAR元件，包括STAR6和STAR7，均是增强子阻断剂(WO03/004704，Kwaksetal，2003)。增强子阻断剂活性是通过将STAR元件置于强增强子和启动子之间而测试。在此我们测试了STAR67是否是一种增强子阻断剂。材料和方法将d2EGFP基因使用引物TTGGTTGGTCATGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC(SEQ.ID.NO.75)和ATTCTCTAGACTACACATTGATCCTAGCAGAAGCAC(SEQ.ID.NO.76)经PCR扩增，并克隆进质粒pGL3-启动子(Promega)中，使用NcoI和XbaI限制位点代替萤光素酶基因以产生质粒pGL3-promoter-GFP。将一接头(通过退火寡核苷酸CGATATCTTGGAGATCTACTAGTGGCGCGCCTTGGGCTAGCT(SEQ.ID.NO.77)和GATCAGCTAGCCCAAGGCGCGCCACTAGTAGATCTCCAAGATATCGAGCT(SEQ.ID.NO.78)而产生)克隆进SacI和BglII位点，产生多克隆位点。原始的BglII位点基于接头的连接而被破坏，产生接头DNA内一新的唯一的BglII位点。使用BsaBI和BamHI将SV40-增强子从质粒pGL3-basic(Promega)中切下，并使用EcoRV和BglII位点克隆进pGL3-linker-promoter-GFP中，产生质粒pGL3-enhancer-promoter-GFP。使用KpnI和SacI位点将STAR40元件(SEQ.ID.NO.40)置于SV40增强子上游，以防止增强子对上游序列的作用。最后，使用SpeI和AscI限制位点将抗阻抑物元件STAR6、STAR7和STAR67置于SV40增强子和SV40最小启动子之间。CHO细胞的转染和培养中国仓鼠卵巢细胞系CHO-K1(ATCCCCL-61)如实施例2所述转染。在转染后1天，在EpicsXL流式细胞计量仪(BeckmanCoulter)上测定d2EGFP水平。结果图10示出STAR67不是增强子阻断剂，而STAR6和STAR7在相同分析中发挥增强子阻断剂作用。将STAR6、STAR7和STAR67克隆在d2EGFP基因上游的SV40增强子和最小SV40启动子之间。当在增强子与启动子之间无STAR元件克隆时，发生强转录激活作用(设定为100％)。当STAR6或STAR7置于增强子与启动子之间时，转录降低至背景水平，表明STAR6和STAR7是强增强子阻断剂。相反，当STAR67克隆在增强子与启动子之间时，相对的转录水平仍为对照组的80％，表明STAR67不是好的增强子阻断剂，这与如先前所述的STAR6和STAR7以及其它抗阻抑物元件(WO03/004704，Kwaksetal，2003)相反。实施例7STAR67增强稳定转染的CHO细胞中UB6和CMV驱动的抗体表达水平在实施例5中，我们示出使用含有重链和轻链的两种不同的质粒，组合STAR67和STAR7增强CHO细胞中EpCAM抗体表达水平。在本实施例中，我们测试了当重链和轻链被置于一个质粒上时STAR67是否可以用于产生EpCAM抗体。我们针对每个选择标记使用同时选择方法。材料和方法质粒重链cDNA(HC-EpCAM)在UB6启动子的控制下，并通过IRES序列与Zeocin抗性基因结合。轻链cDNA(LC-EpCAM)在CMV启动子的控制下，并通过IRES序列与嘌呤霉素抗性基因结合。基本上这些是实施例5中使用的构建体。将这两种表达盒置于一个质粒上，使这两个表达单位的转录具有相反方向。在对照质粒中，UB6与CMV启动子由一500bp填充片段间隔(EpCAM对照)(图10)。在另一个质粒中，将STAR67置于UB6与CMV启动子之间(EpCAMSTAR67)(图10)。CHO细胞的转染和培养将中国仓鼠卵巢细胞系CHO-K1(ATCCCCL-61)如实施例2所述转染和培养，使用zeocin(100μg/ml)和嘌呤霉素(2.5μg/ml)进行选择。在实施例5中，使用针对两种选择标记的相继选择方法。相反，在此这两种选择标记同时存在于培养基中。在转染后1天，向培养基中加入zeocin和嘌呤霉素。持续存在选择培养基直至分离集落(转染后大约14天)。在分离集落并移至24孔平板中之后，将细胞在存在zeocin和嘌呤霉素的条件下培养。结果图11示出含有克隆在UB6和CMV启动子之间的STAR67的抗体构建体的转染产生了许多表达EpCAM抗体的CHO集落(使用抗人IgG抗体通过ELISA测定)。当在转染后25天测定时，用EpCAMSTAR67质粒转染的19个集落中EpCAM产量的平均值为9.8pg/细胞/天。相反，令人惊奇地，用EpCAM对照质粒转染无集落存活。当只用zeocin或者嘌呤霉素进行选择时，EpCAM对照集落存活。然而，当通过对重链和轻链均施加选择压力而增加选择压力时，这些条件使得只有在转染的质粒中存在STAR67的集落存活。该结果还示出掺入STAR67对置于一个STAR67元件的上游和下游的两种启动子(UB6和CMV启动子)均具有有益作用。这表明STAR67可以双向方式操纵。EpCAM对照和EpCAMSTAR67质粒之间的差异是显著的，当选择压力较高时，只有EpCAMSTAR67转染导致集落建立。这使得有机会使用这种质粒构型鉴别STAR67中介导这种作用的区域。将STAR67的较小的重叠部分置于驱动EpCAM分子的UB6和CMV启动子之间。当STAR67的一部分有功能时，集落在zeocin和嘌呤霉素同时用作选择剂时存活。当STAR67的一部分没有功能时，在相同选择条件下无集落存活。因此，将STAR67置于启动子上游导致与没有这种抗阻抑物元件的构建体对比在CHO细胞中明显较高的EpCAM抗体表达水平。进行相似实验使用SV40启动子驱动抗-EpCAM抗体的重链和轻链的表达。在其它实验中，将STAR67用其它STAR序列置换。在进一步的实验中，改变编码重链和轻链的两个表达单位的方向，由此这两个单位的方向一致。在另一个实验中，将重链和轻链的表达单位分别置于不同的核酸分子上(如实施例5所述)，对所得克隆针对两个选择标记同时进行选择。在另一个实验中，改变宿主细胞类型。组合这些变化进行实验。附图描述图1本发明的示意图。A)含有(从5’至3’)转基因(编码例如d2EGFP基因)、IRES和可选择标记(zeo，赋予zeocin抗性)的在CMV启动子控制下的双顺反子基因。表达单位在其3’末端具有SV40转录终止子(t)。该构建体的名称是CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMV对照)。B)如A的构建体，但是STAR67克隆在CMV启动子的上游。该构建体的名称是STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMV-STAR67)。C)如B的构建体，但是上游和下游STAR7元件克隆在完整构建体的两侧。该构建体的名称是STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7(CMV-STAR677/7)。图2STAR67改良CHO细胞中CMV驱动的d2EGFP表达。对10个单独的稳定集落的d2EGFP信号平均值针对CHO细胞中指定构建体进行绘图。A)CMV对照；B)STAR67-CMV。X(10)10个集落的平均d2EGFP表达水平。见实施例2详述。图3STAR67改良CHO细胞中EF1α驱动的d2EGFP表达。与图2相同，但是使用EF1α启动子。A)EF1α对照；B)STAR67-EF1α。图4STAR67改良CHO细胞中UB6驱动的d2EGFP表达。与图2和3相同，但是使用UB6启动子。A)UB6对照；B)STAR67-UB6。图5STAR67改良PER.C6细胞中CMV驱动的d2EGFP表达。与图2相同，但是是在PER.C6细胞中。A)CMV对照；B)STAR67-CMV。图6STAR67改良PER.C6细胞中EF1α驱动的d2EGFP表达。与图3相同，但是是在PER.C6细胞中。A)EF1α对照；B)STAR67-EF1α。图7STAR67改良PER.Cβ细胞中UB6驱动的d2EGFP表达。与图4相同，但是是在PER.C6细胞中。A)UBβ对照；B)STAR67-UB6。图8STAR67组合其它STAR元件改良CHO-K1细胞中SV40驱动的d2EGFP表达。与图2相似，但在CHO细胞中使用SV40启动子及指定的构建体。对在转染60天后的18-20个单独的稳定集落的d2EGFP信号进行绘图。A)SV40对照，SV40-STAR67，SV40-STAR7/7；B)SV40对照及SV40-STAR677/7。见实施例4详述。图9STAR67改良CHO-K1细胞中UB6驱动的EpCAM抗体表达水平。见实施例5详述。A)无STAR元件的构建体；B)具有启动子上游STAR67和两侧STAR7元件的构建体。抗-EpCAM抗体浓度以pg/细胞/天表示。X(18)18个集落的平均产生水平。图10STAR67不是增强子阻断剂，而STAR6和7是。见实施例6详述。图11STAR67增强稳定转染的CHO细胞中UB6和CMV-驱动的抗体表达水平。见实施例7详述。A)含有抗-EpCAM重链(HC)和轻链(LC)的DNA分子，所述重链和轻链均在启动子之后，均与不同的可选择标记基因连接(同时选择用于这两种标记)无STAR元件的构建体。未发现集落；B)相同构建体，在两个启动子之间具有STAR67。抗-EpCAM抗体浓度以pg/细胞/天表示。X(19)19个集落的平均产生水平。参考文献Boshart，M，Weber，F，Jahn，G，Dorsch-Hasler，K，Fleckenstein，B，andSchaffner，W.(1985)AverystrongenhancerislocatedupstreamofanimmediateearlygeneofhumancytomegalovirusCell41，521-530.ChungJH，WhiteleyM，andFelsenfeldG.(1993)A5’elementofthechickenbeta-globindomainservesasaninsulatorinhumanerythroidcellsandprotectsagainstpositioneffectinDrosophila.Cell74505-514.ChungJH，BellAC，FelsenfeldG.(1997).Chara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