专利名称：一种固态机械发酵木聚糖酶的生产方法
技术领域：
本发明涉及以固态机械发酵法生产木聚糖酶的方法，即通过微生物菌种筛选和培养基及固态发酵工艺的优化，生产低成本高活力木聚糖酶制剂的工艺。
背景技术：
从单子叶植物中来的木聚糖，有两种类型。其一是谷物胚乳中高度分支的阿拉伯木聚糖；其二是分支较少的阿拉伯木聚糖，在侧链具有糖醛酸和半乳糖残基，通常存在于高度木质化的组织中，例如草类的茎、玉米秸杆和大麦壳等。
木聚糖酶主要有两类，一类为(1→3)-β-D-木聚糖酶；另一类为(1→4)-β-D-木聚糖酶。(1→3)-β-D-木聚糖酶学名为(1→3)-β-D-木聚糖木聚糖水解酶，包括外切-β-(1→3)-β-D-木聚糖酶(EC.3.2.1.72)和内切-β(1→3)-β-D-木聚糖酶(EC.3.2.1.32)，它主要作用于(1→3)-β-D-木聚糖，生成D-木聚糖和D-木寡糖。迄今所知，这类木聚糖酶都来源于海洋细菌、绿藻、褐藻、红藻和陆地真菌。而内切型的(1→3)-β-D-木聚糖酶还没有检出过。(1→4)-β-D-木聚糖酶已被酶委员会定名的有内切型(1→4)-β-D-木聚糖木聚糖水解酶(EC.3.2.1.8)和外切型(1→4)-β-D-木聚糖木聚糖水解酶(EC.3.2.1.37)；它们能水解(1→4)-β-D-木聚糖。作用的底物包括阿拉伯木聚糖、阿拉伯葡萄糖醛酸木聚糖、阿拉伯-4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸木聚糖和葡萄糖醛酸木聚糖。因此通常所谓“D-木聚糖酶”就是指(1→4)-β-D-木聚糖酶。其主要来源于海洋和陆地的细菌、瘤胃的细菌和原生动物、腐生真菌和植物病原真菌、昆虫蜗牛、甲壳类、海藻和陆地植物的发芽物中。
由于木聚糖酶在饲料添加剂及造纸工业上纸浆漂白上的广泛应用，目前国内外都进行了这方面的研究，主要是利用微生物的液体发酵或固体发酵来生产酶。国外研究所涉及的微生物主要有霉菌、放线菌和细菌等。如巴西的R.C.Simao等利用Aspergillus tamarii所得的木聚糖活力为120u/ml(1996)；奥地利的Alois Sachslehner等利用Sckrotium rolfsill生产木聚糖酶产酶活力达104u/ml；加拿大的A.W.Khan利用细菌和真菌的培养物得到的酶活达104u/ml；印度的A.Archana和T.Satyanarayana利用Thermophilic Bacillus licheniformis A99固体发酵，酶活力达19.13ug-DBB(dry bacterial bran)；法国的P.L.pham等人利用Bacillussp.产酶活力达2388nkat/ml(Inkat定义为特定条件下酶催化底物每秒钟产生的1nmol)。
相对国外来说，国内有关木聚糖酶的研究较少，陈惠忠等利用黑曲霉(Aspergillus niger)An-76菌株，所产木聚糖酶活力达353.6Iu/ml；吴克等人利用黑曲霉A3菌株固体发酵，得到的固体酶粉活力达15395Iu/g；刘月英等利用棒曲霉22的液体发酵，所得酶活力为335.9Iu/ml；蔡敬民等利用芽孢杆菌L23，所得酶活力为30Iu/ml。国内的研究主要以霉菌为主。
国内外对木聚糖酶的生产主要有两大类方法，即液态深层发酵和固态发酵。液态深层发酵生产量较小，灭菌效果好，但生产成本高，一般适用于食品级小规模木聚糖酶的生产。固态发酵技术是使微生物在潮湿固体基质上生长的技术，与液态发酵相比，固态发酵具有产量高、成本低、产品酶系全、应用效果显著等特点。但是，现有的固态发酵存在着工艺水平低、投料操作繁琐、劳动强度大，在生产过程中又因人流、物流频繁接触，造成染菌等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用固态机械发酵生产木聚糖酶的方法，实现了机械化操作，可进行封闭地无杂菌污染的纯培养，避免繁琐的人工操作，并得到高活性的木聚糖酶。
本发明的技术方案如下
本发明所用菌种和菌种相应使用的培养基见下表表1 菌种及所用培养基
本发明的固态机械发酵木聚糖酶的生产方法，包括菌种培养、固态机械发酵、提纯、加入载体制成固体酶制剂或加入保护剂制成液体酶制剂工序。
其中菌种培养工序以黑曲霉(Aspergillus niger)IFFI 02439为生产菌种采用试管斜面菌种→摇瓶放大培养方法。
固态机械发酵工序由种子罐放大培养，固态机械发酵罐二级发酵，控制罐内温度28-30℃，发酵原料含水量控制60-70％，空气湿度控制75％-85％，通风量8-12m3/h，罐压0.01-0.02Mpa，接种量5-10％，发酵时间72-96小时；固体发酵罐所用的培养基(g/Kg)玉米芯粉(过20目筛)300-350克，麸皮120-140克，玉米浆4-6克，NH4NO32-4克，K2HPO43-5克，MgSO4·7H2O0.4-0.6克，水800-1000毫升，pH 5.0，经三个大气压121℃，灭菌60分钟。
提纯将固体发酵物料加入一定量水浸提、经压榨、超滤膜浓缩、加入载体、微颗粒干燥、制成固体酶制剂，其中固体木聚糖酶活力为3000IU/g。
固体精酶制剂测定指标如下(1)产品酶活力木聚糖酶活力3000IU/g。
(2)感官指标产品为黄色粉剂，色泽均一。
(3)理化指标制剂能通过3号标准筛；水分含水量低于8％。
(4)卫生指标固体酶制剂每克细菌总数小于1万个。
本发明所述的摇瓶放大培养是将黑曲霉菌种于三角瓶摇床振荡培养，温度28-30℃，转速180-250转/分钟，接种量1-3％，培养48-60h；摇瓶放大培养所用的培养基(g/L)半纤维素15-20克，NH4NO32-4克，酵母粉2-4克，KCL0.4-0.6克，K2HPO40.5-1.5克，FeSO40.01-0.0克，MgSO4·7H2O0.3-0.6克，CoCL20.01-0.03克，吐温0.5-1.5克。pH5.5。
本发明所述的种子罐放大培养是将黑曲霉菌种于发酵罐中增殖培养，发酵罐内温度28-30℃，通风量9-13m3/h，发酵罐压0.02-0.09Mpa，接种量1-3％，时间60-72小时；种子罐放大培养所用的培养基(g/L)半纤维素20-30克，NH4NO32-4克，玉米浆2-4克，KCL0.4-0.6克，K2HPO40.5-1.5克，FeSO40.01-0.03克，MgSO4·7H2O0.3-0.6克，CoCL20.01-0.03克，吐温0.5-1.5克。pH 5.5。
本发明所述的固体发酵罐控制参数罐内温度28-30℃，发酵原料含水量控制60-70％，空气湿度控制75％-85％，通风量8-12m3/h，固态发酵罐罐压0.01-0.02Mpa，接种量5-10％，发酵时间72-96小时；固体发酵罐所用的培养基(g/Kg)玉米芯粉(过20目筛)300-350克，麸皮120-140克，玉米浆4-6克，NH4NO32-4克，K2HPO43-5克，MgSO4·7H2O0.4-0.6克，水800-1000毫升。pH 5.0。121℃，灭菌20分钟。
本发明所述的超滤膜浓缩，超滤压力小于0.1Mpa，浓缩时间3-5小时/吨滤液，每批滤液被浓缩成300-400升。
本发明采用的具体生产工艺如下(1)斜面菌种培养黑曲霉菌种使用相应培养基，并加入1.5-2.5％琼脂，接种量5-10％，在28-30℃条件下静止培养20-48小时，放入4℃冰箱保存。
(2)摇瓶二级扩大培养黑曲霉菌种于500毫升三角瓶摇床振荡培养，温度28-30℃，转速180-250转/分钟，接种量1-3％，培养48-60h。摇瓶放大培养培养基(g/L)半纤维素15-20克，NH4NO32-4克，酵母粉2-4克，KCL0.4-0.6克，K2HPO40.5-1.5克，FeSO40.01-0.03克，MgSO4·7H2O0.3-0.6克，CoCL20.01-0.03克，吐温0.5-1.5克。pH5.5。
按上述培养基成份配比物料分装入三角瓶中，每瓶100毫升，然后置于高压灭菌锅中，121℃，灭菌20分钟，自然冷却后接种黑曲霉菌种。
(3)种子罐放大培养黑曲霉菌种于种子罐中增殖培养，发酵罐内温度28-30℃，通风量9-13m3/h，发酵罐压0.02-0.09Mpa，接种量1-3％，时间60-72小时。种子罐放大培养基(g/L)半纤维素20-30克，NH4NO32-4克，玉米浆2-4克，KCL0.4-0.6克，K2HPO40.5-1.5克，FeSO40.01-0.03克，MgSO4·7H2O0.3-0.6克，CoCL20.01-0.03克，吐温0.5-1.5克。pH 5.5。
按上述培养基成份配比物料装入种子罐中，经三个大气压121℃灭菌45分钟，使其自然冷却后接种黑曲霉菌种。
(4)物料混合、物料蒸煮灭菌、无菌输料固体发酵罐所用的培养基(g/Kg)玉米芯粉(过20目筛)300-350克，麸皮120-140克，玉米浆4-6克，NH4NO32-4克，K2HPO43-5克，MgSO4·7H2O0.4-0.6克，水800-1000毫升，pH 5.0，将固态发酵原料中各成份在蒸球中混合均匀，经三个大气压121℃，灭菌60分钟；将种子罐中将黑曲霉均匀喷洒接种于固态发酵原料中，无菌传送到固态发酵罐中发酵。
(5)固体发酵罐发酵发酵罐内温度28-30℃，发酵原料含水量控制60-70％，空气湿度控制75％-85％，通风量8-12m3/h，固态发酵罐罐压0.01-0.02Mpa，接种量5-10％，发酵时间72-96小时。
(6)浸提将已固态发酵三-四天的固体发酵物料取出，倾入浸提槽中，加入一定量的水，固体发酵物料∶水＝1∶9(重量/体积比)，进行约3小时的浸提。
(7)过滤浸提后，上层清液先排放出来，剩余固体进行压榨。将浸提上层清液及压榨液经过板框式过滤机进行过滤。经过板框过滤的过滤液经过线绕式过滤机进行过滤，所得滤液放于储罐中。
(8)膜浓缩将储罐中滤液进行超滤膜浓缩，超滤压力小于0.1Mpa，浓缩时间3小时/6吨滤液，每批滤液被浓缩成300-400升。
(9)添加载体向浓缩酶液中加入淀粉作为载体，使其在浓缩酶液中的终浓度达到10％，并于匀浆中充分搅拌混匀。
(10)微颗粒干燥将已加入淀粉载体的浓缩酶液经过高速离心喷雾干燥机进行喷雾干燥制成固体精酶。此时的产品为固体木聚糖酶。
本发明所提供的采用固态机械发酵生产高活力的木聚糖酶的生产方法与现有技术相比具有如下的特点1、本发明针对目前固态发酵木聚糖酶活力不高，不能完全适应市场需要的特点，筛选到适合固态机械发酵，木聚糖酶活力高的黑曲霉菌种。采用木糖比色法酶活力达到或超过3000IU/G。
2、本发明生产木聚糖酶稳定的pH范围在3-7，在动物消化道不失去活力，适合饲料工艺要求。
3、本发明所采用机械化固态发酵技术工艺与目前多数企业采用的深层发酵工艺相比，设备投资少、生产成本低，从技术上提高了原料的利用率，解决了菌种好氧问题，从而提高了发酵活力，扩大了产能，为进一步实现自动化规模生产提供了技术支持。
本发明的固体精酶制剂做了如下的测定(1)产品酶活力木聚糖酶活力3000IU/g。
(2)感官指标产品为黄色粉剂，色泽均一。
(3)理化指标粒度制剂能通过3号标准筛。
水分含水量低于8％。
(4)卫生指标固体酶制剂每克细菌总数小于1万个。
本发明产品是饲用复合酶制剂的重要组份。国内尚无生产。主要用于配合饲料中消除是国内饲料复合酶制剂急需且尚待开发的基酶产品。木聚糖酶应用于饲料，既可补充畜禽内源酶的不足，在日粮中添加相应的外源酶，有助于提高畜禽健康水平和生产性能，又可解除饲料中抗营养因子NSP，利于畜禽消化吸收利用，进而全面提高配合饲料的营养价值。木聚糖酶应用于饲料，还具有良好的安全性和减少环境污染的作用。
本产品可用于生产具有高附加值的功能性食品甜味剂-低聚木糖。也可用于造纸工业方面的纸浆生物漂白工艺，具有巨大的经济价值和绿色环保社会价值。同时可用于食品加工工业如蔬汁加工；可用于纺织工业，如棉麻织物整形处理；还可用于环保处理方面，实现农作物废弃物无害化处理。
说明书附1为固态机械发酵木聚糖酶的生产流程流程图。
图2为木糖标准曲线，横坐标表示葡萄糖毫克数，纵坐标表示O.D.值。
具体实施例方式
实施例11、斜面菌种培养黑曲霉菌种使用的培养基如下 然后加入2.5％琼脂，在30℃条件下静止培养48小时，放入4℃冰箱保存。
2、摇瓶二级扩大培养黑曲霉菌种于500毫升三角瓶摇床振荡培养，温度28℃，转速180转/分钟，接种量1％，培养48h。摇瓶放大培养培养基(g/L)半纤维素15克，NH4NO32克，酵母粉2克，KCL0.4克，K2HPO40.5克，FeSO40.01克，MgSO4·7H2O0.3克，CoCL20.01克，吐温0.5克。pH5.5。按上述培养基成份配比物料分装入三角瓶中，每瓶100毫升，然后置于高压灭菌锅中，121℃，灭菌20分钟，自然冷却后接种黑曲霉菌种。
3、种子罐放大培养黑曲霉菌种于1吨发酵罐中增殖培养，发酵罐内温度28℃，通风量9m3/h，发酵罐压0.02Mpa，接种量1％，时间60小时。种子罐放大培养基(g/L)半纤维素20克，NH4NO32克，玉米浆2克，KCL0.4克，K2HPO40.5克，FeSO40.01克，MgSO4·7H2O0.3克，CoCL20.01克，吐温0.5克。pH5.5。按上述培养基成份配比物料分别装入两个种子罐中，经高温高压121℃灭菌20分钟，使其自然冷却后接种黑曲霉菌种。
4、物料混合、物料蒸煮灭菌、无菌输料固态发酵罐培养基(g/Kg)玉米芯粉(过20目筛)300克，麸皮120克，玉米浆4克，NH4NO32克，K2HPO43克，MgSO4·7H2O0.4克，水800毫升。pH 5.0。将固态发酵原料中各成份按上述比例混合，在蒸球中混合均匀，经三个大气压121℃，灭菌60分钟，冷却后，将种子罐中将黑曲霉均匀喷洒接种于固态发酵原料中，无菌传送到固态发酵罐中发酵。
5、固体发酵罐发酵发酵罐内温度28℃，发酵原料含水量控制60％，空气湿度控制80％，通风量9m3/h，固态发酵罐罐压0.02Mpa，接种量10％，发酵时间84小时。
6、浸提将已固态发酵三-四天的固体发酵物料取出，倾入浸提槽中，加入一定量的水，固体发酵物料∶水＝1∶9(重量/体积比)，进行约3小时的浸提。
7、过滤浸提后，上层清液先排放出来，剩余固体进行压榨。将浸提上层清液及压榨液经过板框式过滤机进行过滤。经过板框过滤的过滤液经过线绕式过滤机进行过滤，所得滤液放于储罐中。
8、膜浓缩将储罐中滤液进行超滤膜浓缩，超滤压力小于0.1Mpa，浓缩时间3小时/6吨滤液，每批滤液被浓缩成300升。
9、添加载体向浓缩酶液中加入糊精作为载体，使其在浓缩酶液中的终浓度达到10％，并于匀浆中充分搅拌混匀。
10、微颗粒干燥将已加入糊精载体的浓缩酶液经过高速离心喷雾干燥机进行喷雾干燥制成固体精酶。此时的产品为固体木聚糖酶。
固体精酶制剂(1)产品酶活力木聚糖酶活力3000IU/g。
(2)感官指标产品为黄色粉剂，色泽均一。
(3)理化指标粒度制剂能通过3号标准筛。
水分含水量低于8％。
(5)卫生指标固体酶制剂每克细菌总数小于1万个。
实施例21、斜面菌种培养黑曲霉菌种使用的培养基如下 然后加入2.5％琼脂，在30℃条件下静止培养48小时，放入4℃冰箱保存。
2、摇瓶二级扩大培养黑曲霉菌种于500毫升三角瓶摇床振荡培养，温度30℃，转速250转/分钟，接种量3％，培养60h。摇瓶放大培养培养基(g/L)半纤维素20克，NH4NO34克，酵母粉4克，KCL0.6克，K2HPO41.5克，FeSO40.03克，MgSO4·7H2O0.6克，CoCL20.03克，吐温1.5克。pH5.5。按上述培养基成份配比物料分装入三角瓶中，每瓶100毫升，然后置于高压灭菌锅中，121℃，灭菌20分钟，自然冷却后接种黑曲霉菌种。
3、种子罐放大培养黑曲霉菌种于1吨发酵罐中增殖培养，发酵罐内温度30℃，通风量13m3/h，发酵罐压0.09Mpa，接种量3％，时间72小时。种子罐放大培养基(g/L)半纤维素30克，NH4NO34克，玉米浆4克，KCL0.6克，K2HPO41.5克，FeSO40.03克，MgSO4·7H2O0.6克，CoCL20.03克，吐温1.5克。pH 5.5。按上述培养基成份配比物料分别装入两个种子罐中，经高温高压121℃灭菌20分钟，使其自然冷却后接种黑曲霉菌种。
4、物料混合、物料蒸煮灭菌、无菌输料固体发酵罐所用的培养基(g/Kg)玉米芯粉(过20目筛)350克，麸皮140克，玉米浆6克，NH4NO34克，K2HPO45克，MgSO4·7H2O0.6克，水1000毫升，pH 5.0，将固态发酵原料中各成份在蒸球中混合均匀，经三个大气压121℃，灭菌60分钟；将种子罐中将黑曲霉均匀喷洒接种于固态发酵原料中，无菌传送到固态发酵罐中发酵。
5、固体发酵罐发酵发酵罐内温度30℃，发酵原料含水量控制70％，空气湿度控制90％，通风量13m3/h，固态发酵罐罐压0.03Mpa，接种量15％，发酵时间96小时。6、浸提将已固态发酵三-四天的固体发酵物料取出，倾入浸提槽中，加入一定量的水，固体发酵物料∶水＝1∶9(重量/体积比)，进行约3小时的浸提。
7、过滤浸提后，上层清液先排放出来，剩余固体进行压榨。将浸提上层清液及压榨液经过板框式过滤机进行过滤。经过板框过滤的过滤液经过线绕式过滤机进行过滤，所得滤液放于储罐中。
8、膜浓缩将储罐中滤液进行超滤膜浓缩，超滤压力小于0.1Mpa，浓缩时间3小时/6吨滤液，每批滤液被浓缩成400升。
9、添加载体向浓缩酶液中加入糊精作为载体，使其在浓缩酶液中的终浓度达到10％，并于匀浆中充分搅拌混匀。
10、微颗粒干燥将已加入糊精载体的浓缩酶液经过高速离心喷雾干燥机进行喷雾干燥制成固体精酶。此时的产品为固体木聚糖酶。
固体精酶制剂(1)产品酶活力木聚糖酶活力3000IU/g。
(2)感官指标产品为黄色粉剂，色泽均一。
(3)理化指标粒度制剂能通过3号标准筛。
水分含水量低于8％。
(6)卫生指标固体酶制剂每克细菌总数小于1万个。
权利要求
1.一种固态机械发酵木聚糖酶的生产方法，其特征在于包括菌种培养、固态机械发酵、提纯、加入载体制成固体酶制剂或加入保护剂制成液体酶制剂工序；其中菌种培养工序以黑曲霉(Aspergillus niger)IFFI 02439为生产菌种采用试管斜面菌种，摇瓶放大培养方法；固态机械发酵工序由种子罐放大培养，固态机械发酵罐二级发酵。固体发酵罐所用的培养基(g/Kg)玉米芯粉(过20目筛)300-350克，麸皮120-140克，玉米浆4-6克，NH4NO32-4克，K2HPO43-5克，MgSO4·7H2O 0.4-0.6克，水800-1000毫升，pH 5.0，将固态发酵原料中各成份在蒸球中混合均匀，经三个大气压121℃，灭菌60分钟；将种子罐中将黑曲霉均匀喷洒接种于固态发酵原料中，无菌传送到固态发酵罐中发酵。控制固态发酵罐内温度28-30℃，发酵原料含水量控制60-70％，空气湿度控制75％-85％，通风量8-12m3/h，罐压0.01-0.02Mpa，接种量5-10％，发酵时间72-96小时；提纯将固体发酵物料加入一定量水浸提、经压榨、超滤膜浓缩、加入载体、微颗粒干燥、制成固体酶制剂，其中(1)固体木聚糖酶活力为3000IU/g；(2)感官指标产品为黄色粉剂，色泽均一；(3)理化指标制剂能通过3号标准筛；水分含水量低于8％；(4)卫生指标固体酶制剂每克细菌总数小于1万个。
2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述摇瓶放大培养所用的培养基(g/L)半纤维素15-20克，NH4NO32-4克，酵母粉2-4克，KCL 0.4-0.6克，K2HPO40.5-1.5克，FeSO40.01-0.03克，MgSO4·7H2O 0.3-0.6克，CoCL20.01-0.03克，吐温0.5-1.5克，pH 5.5。
3.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述的种子罐放大培养所用的培养基(g/L)半纤维素20-30克，NH4NO32-4克，玉米浆2-4克，KCL 0.4-0.6克，K2HPO40.5-1.5克，FeSO40.01-0.03克，MgSO4·7H2O 0.3-0.6克，CoCL20.01-0.03克，吐温0.5-1.5克，pH 5.5。
全文摘要
本发明公开了一种固态机械发酵木聚糖酶的生产方法，包括菌种培养、发酵、提纯、精制等工序，其中的发酵工序由种子罐放大培养；固态机械发酵罐二级发酵，控制罐内温度28－30℃，发酵原料含水量控制60－70％，空气湿度控制75％－85％，通风量8－12m
文档编号C12N1/14GK1920016SQ20061001543
公开日2007年2月28日 申请日期2006年8月25日 优先权日2006年8月25日
发明者丁友昉, 王德培, 杨扬 申请人:天津达美科技有限公司