用于药物用途的脂肪酶的制作方法

专利名称：：用于药物用途的脂肪酶的制作方法
技术领域：
：本发明涉及脂肪酶的药物用途，所述脂肪酶涉及包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269的疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)(同义词疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa))脂肪酶变体。脂肪酶可以与蛋白酶和/或淀粉酶组合。医学适应症(medicalindication)的实例是治疗消化性病症(digestivedisorder)、胰腺外分泌机能不全(pancreaticexocrineinsufficiency)(PEI)、膝腺炎、嚢性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病
背景技术：
：已知几种以胰酶补充剂形式存在的商业药物用于治疗胰腺外分泌机能不全。这些产品的活性组分是消化酶，主要为淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶，其通常产生于胰腺并分泌至小肠上部(十二指肠)。这些药物中使用的酶主要源自牛或猪的胰腺，然而市场也存在含有孩支生物酶的产品，例如产品Nortase,其包含来自米才艮霉(Rhizopusoryzae)的月旨肪酶、来自米曲霉(Aspergillusoryzae)的蛋白酶和来自米曲霉的淀粉酶。US5614189(EP600868)描述源自疏棉状腐质霉的脂肪酶在胰酶替代疗法中的用途，例如在对患有嚢性纤维化的患者的治疗中。所述脂肪酶来自疏棉状腐质霉DSM4109，具有SEQIDNO:2的氨基酸1-269的氨基酸序列。WO00/54799描述在治疗I型和II型糖尿病中，有脂肪分解、蛋白水解和淀粉分解活性的、生理上可以接受的酶混合物的用途。WO02/060474描述来自德氏根霉(Rhizopusdelemar)的浓缩脂肪酶、来自蜂蜜曲霉(Aspergillusmelleus)的中性蛋白酶和来自米曲霉的淀粉酶在对消化不良的治疗中的用途。WO01/62280描述在哺乳动物中治疗或预防胃肠病症时，与多功能交耳关剂交联的非真菌脂肪酶晶体、蛋白酶和淀粉酶的用途，其中脂肪酶晶体在约2.0-9.0的pH范围内具有活性。优选的脂肪酶来自假单胞菌属(Pseudomonas),优选的淀粉酶来自芽孢杆菌属(Bacillus)或曲霉属Aspergillus)，优选的蛋白酶是菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶或无花果蛋白酶。EP0828509描述在对外分泌胰腺机能不全的治疗中，特定的酸稳定性淀粉酶的用途，任选地可将所述淀粉酶与特定的酸稳定性脂肪酶和/或蛋白酶组合。优选的淀粉酶来自黑曲霉，优选的脂肪酶来自少根根霉(Rhizopus)或爪唾根霉(Rhizopusjavanicus)。WO00/60063描述一些疏棉状腐质霉脂肪酶的变体及其在洗涤剂中的用途。具体描述具有本文中SEQIDNO:1的氨基酸1-269的脂肪酶，然而未描述它的药物用途。WO04/111216和EP1428874都公开SEQIDNO:2的变体，包括SEQIDNO:l的变体，但是未公开其药物用途。在本领域中需要可选的，优选改进的用于药物用途的酶。发明简述本发明提供可选的，优选改进的用于药物用途的酶，即新脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶。优选地，根据本发明使用的酶在体内和/或体外具有改进的效能(e伍cacy);改进的pH稳定性分布(profile);改进的pH活性分布；对蛋白酶的降解稳定；在胆汁盐存在时稳定；和/或具有降低的变应原性。本发明涉及用作药物的脂肪酶，其中所述脂肪酶与SEQIDNO:1的氨基酸l-269有至少90%的同一性，条件为所述脂肪酶不是SEQIDNO:2的氨基酸1-269。脂肪酶可以与蛋白酶和/或淀粉酶组合使用。本发明还涉及这些脂肪酶在药物制造中的用途，所述药物用来治疗消化性病症、PEI、胰腺炎、嚢性纤维化、I型糖尿病，和/或II型糖尿病，这些用途任选地还包含使用蛋白酶和/或淀粉酶。本发明还涉及药物组合物，其包含这样的脂肪酶，以及至少一种可药用的辅助材料，任选地包括蛋白酶和/或淀粉酶。本发明还涉及消化性病症、PEI、胰腺炎(急性和/或慢性)、嚢性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的治疗方法，其通过施用治疗上有效量的这样的脂肪酶，任选地与蛋白酶和/或淀粉酶一起施用。发明详述酶本发明涉及脂肪酶的药物用途，其中所述脂肪酶具有，或包含，与SEQIDNO:1的氨基酸1-269具有至少90%同一性的氨基酸序列，条件为所述脂肪酶不是SEQIDNO:2的氨基酸1-269。在具体实施方案中，a)所述脂肪酶包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269，或b)所述脂肪酶是SEQIDNO:1的氨基酸1-269的变体，其中所述变体与SEQIDNO:1的氨基酸1-269的差异不多于25个氨基酸，并且其中(i)和SEQIDNO:1的氨基酸1-269比较，所述变体包含一个或多个氨基酸的保守取代和/或插入中的至少一种；和/或(ii)和SEQIDNO:1的氨基酸1-269比较，所述变体包含至少一个小缺失；和/或(iii)和SEQIDNO:1的氨基酸1-269比较，所述变体包含至少一个小的N-或C-末端延伸；和/或(iv)所述变体是具有SEQIDNO:2的氨基酸1-269的脂肪酶的等位变体；和/或(v)所述变体是具有SEQIDNO:1的氨基酸1-269的脂肪酶的片段。本发明还涉及这些脂肪酶用于药物制造的用途，所述药物用来治疗消化性病症、PEI、胰腺炎(急性和/或慢性)、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。本发明还涉及药物组合物，其包含这样的脂肪酶，和至少一种可药用的辅助材料，以及用于治疗上述疾病的方法，所述方法通过施用治疗上有效量的这样的脂肪酶。包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269的脂肪酶本身是疏棉状腐质霉(疏棉状嗜热丝孢菌)DSM4109(SEQIDNO:2)的脂肪酶的变体。在下文中，将用于本发明的组合物、方法和用途中的脂肪酶称作"本发明的脂肪酶"。在本文的上下文中，脂肪酶表示羧酸酯水解酶EC3丄1,，其包括活性如EC3.1.1.3三酰甘油脂肪酶、EC3.1.1.4磷脂酶Al、EC3.1.1.5溶血磷脂酶、EC3.1.1.26半乳糖酯酶(galactolipase)、EC3.1.1.32石粦月旨酶Al、EC3.1.1.73阿魏酸酯酶。在具体实施方案中，脂肪酶是EC3丄1.3三酰甘油脂肪酶。EC号引用NC-IUBMB，AcademicPress，SanDiego，California的EnzymeNomenclature1992,包括分别在Eur.J.Biochem.1994，223，1-5;Eur.J.Biochem.1995,232,1-6;Eur.J.Biochem.1996，237，1-5;Eur.J.Biochem.1997，250,1-6;和Eur.J.Biochem.1999,264,610-650出版的补充材料1-5。命名法经常性地补充和更新；参见,例如http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html的网站。如上所定义的本发明的脂肪酶不包括具有SEQIDNO:2的氨基酸1-269的脂肪酶。后者的序列与SEQIDNO:1的氨基酸1-269的差异在于双取代R231T+R233N。在SEQIDNO:1中的"双取代R231T+R233N"的表述指SEQIDNO:1的变体，在所述变体中的位置231和233的两个精氨酸残基(Arg，或R)，分别由苏氨酸(Thr，或T)和天门冬酰胺(Asn，或N)代替或取代。术语"位置"指序列表的SEQIDNO:1中正的氨基酸残基数。这两个取代不是保守的，如下所定义(因为它们用两个极性氨基酸代替了两个碱性氨基酸)。因此，在具体实施方案中，本发明的脂肪酶不具有由SEQIDNO:2的氨基酸1-269组成的氨基酸序列，所述序列相当于其中已经生成双取代R231T+R233N的SEQIDNO:1。与SEQIDNO:1的氨基酸l-269相比，包含保守取代、插入、缺失、N-末端延伸和/或C-末端延伸的脂肪酶，以及脂肪酶片段，能够通过本领域已知的任何方法从该分子制备，所述方法如定向诱变、随机诱变、共有衍生方法(consensusderivationprocesses)(EP897985)和基因改组(geneshuffling)(WO95/22625、WO96/00343)等。这些脂肪酶也可以是杂交酶或嵌合酶。本发明的变体脂肪酶当然具有脂肪酶活性。在具体实施方案中，变体脂肪酶的比活性是具有SEQIDNO:1的氨基酸1-269的脂肪酶的比活性的至少50%。在其它的具体实施方案中，变体脂肪酶的比活性是具有SEQIDNO:1的氨基酸1-269的脂肪酶的比活性的至少60、70、75、80、85、90或至少95%。比活性可以使用本文实施例1中脂肪酶试验方法的任一种测定，但是优选使用实施例1的LU-试验方法以LU/mg酶蛋白测量，并用如实施例5所述的氨基酸分析确定酶蛋白含量。本发明的脂肪酶变体允许的氨基酸改变对性质是较不重要的(ofaminornature),即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性，优选小数目的这样的取代或插入；小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端曱硫氨酸残基；小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能，例如多组氨酸序列(tract)、抗原表位或结合域来促进纯化的、延伸。在上文中，术语"小"独立地表明多至25个氨基酸残基。在优选实施方案中，术语"小"独立地表明多至24、23、22、21或多至20个氨基酸残基。在其它的优选实施方案中，术语"小"独立地表明多至19、18、17、16、15、14、13、12、11或多至10个氨基酸残基。在进一步优选的实施方案中，术语"小，，独立地表明多至9、8、7、6、5、4、3、2或多至1个氨基酸残基。在可选的实施方案中，术语"小"独立地表明多至40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26或多至25个氨基酸残基。本发明的脂肪酶具有的氨基酸序列与SEQIDNO:1的氨基酸l-269有不多于25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12或不多于11个氨基酸的差异；或者，它与SEQIDNO:1的氨基酸1-269的差异不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2或不多于1个氨基酸；在两种情况的任何一种中，优选地，将SEQIDN0:1中的双取代R231T+R233N除外，如上所定义。在可选实施方案中，本发明的脂肪酶具有的氨基酸序列与SEQIDNO:1的氨基酸1-269的差异不多于40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27或不多于26个氨基酸，优选地，将SEQIDNO:1中的双取代R231T+R233N除外，如上所定义。保守取代的实例是在以下组之内碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和曱硫氨酸)。可供选择地，保守取代的实例是在以下组之内碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和曱硫氨酸)。通常不改变比活性(spedficactivity)的氨基酸取代是本领域已#口的，并且由例3口H.NeurathandR.L.Hill,1979，/w，T7zeiVofe/ra,AcademicPress,NewYork描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。包含保守取代(用一个极性氨基酸交换另一个极性氨基酸)的本发明的变体脂肪酶的实例是SEQIDNO:1的氨基酸1-269的变体Asn33Gln(N33Q)。这是非糖基化变体，对于本发明而言，所述变体与SEQIDNO:1—样有效(参见实施例5)。本发明还同样涉及这种变体脂肪酶，以及SEQIDNO:1的氨基酸-5-269、-4-269、-3-269,和2-269的相应取代变体。在优选实施方案中，本发明的变体脂肪酶的每个取代都是保守的。包含小的N-末端延伸的本发明的变体脂肪酶的实例是SEQIDNO:1的氨基酸-5-269(-5至+269)、-4-269(-4至+269)，和-3-269(-3至+269),即分别带有SPI…、PIR…，和IRR…的N-末端(参见实施例5)。本发明的脂肪酶还可以是具有SEQIDNO:2的氨基酸1-269的脂肪酶的等位变体，优选地带有SEQIDNO:2中的双取代T231R+N233R(如上对于SEQIDNO:1所定义的，已作必要的修正)。可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。本发明的脂肪酶的等位变体的实例是源自疏棉状腐质霉的不同菌抹的脂肪酶。本发明的脂肪酶还可以是具有SEQIDNO:1的氨基酸1-269的脂肪酶的片段，而且所述片段仍然有脂肪酶活性。本文将术语片段定义为从SEQIDNO:1的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽，优选从SEQIDNO:1的成熟部分(其氨基酸l-269)缺失。优选地，缺失小数目的氨基酸，小如上所定义。更优选地，片,史包含至少244、245、246、247、248、249或至少250个氨基酸残基。最优选地，片段包含至少251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267或至少268个氨基酸残基。在可选的实施方案中，片段包含至少239、240、241、242或至少243个氨基酸残基。本发明的变体脂肪酶的实例，其为SEQIDNO:1的氨基酸1-269的片段，是具有SEQIDNO:1的氨基酸2-269(+2至+269)的氨基酸序列的变体，即，带有VSQ的N-末端(参见实施例5)。本发明还涉及(a)用作药物的脂肪酶，其中所述脂肪酶与SEQIDNO:1的氨基酸1-269有至少99.4%的同一性；(b)用作药物的包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269的脂肪酶，或其变体，其中所述变体与SEQIDNO:1的氨基酸1-269的差异不多于25个氨基酸，并且其中，与SEQIDNO:1的氨基酸1-269比较，所述变体包含(i)一个或多个氨基酸的保守取代和/或插入中的至少一种；和/或(ii)至少一个小缺失；和/或(iii)至少一个小的N-或C-末端延伸；和/或其中所述变体是(iv)具有SEQIDNO:2的氨基酸1-269的脂肪酶的等位变体；和/或(v)具有SEQIDNO:1的氨基酸1_269的脂肪酶的片段；任选地条件为所述变体丕是SEQIDNO:2的氨基酸1-269;以及(a)和(b)这样的脂肪酶根据本发明的相应的组合物、方法和用途。同一性百分比如下所述确定。具有下述氨基酸序列的脂肪酶是本发明的脂肪酶的优选实例(i)SEQIDNO:1的氛基酉吏+1至+269，(ii)SEQIDNO:1的氛基酸-5至+269,(iii)SEQIDNO:1的氨基酸-4至+269;(iv)SEQIDNO:1的氨基酸-3至+269;(v)SEQIDNO:1的氨基酸-2至+269;(vi)SEQIDNO:1的氨基酸-1至+269;(vii)SEQIDNO:1的氨基酸+2至+269，以及(viii)(i)-(vii)的脂肪酶中的两种或更多种的任意混合物。在具体实施方案中，用于根据本发明用途的脂肪酶选自(i)、(ii)的脂肪酶，和(i)和(ii)的任意混合物。优选(i)和(ii)的混合物包含至少5%，优选至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或至少95%的脂肪酶(i)，百分比用Edman方法通过N-末端测序确定，如实施例5所述。其它优选的混合物是(a)组合物，其包含35-75%,优选40-70%，更优选45-65%的脂肪酶(ii);(b)组合物，其包含20-60%，优选25-55%，更优选30-50%，最优选35-47。/。的脂肪酶(i);(c)组合物，其包含多至30%,优选多至25%,更优选多至20%，最优选多至lW/。的脂肪酶(vii);和(d)(a)、(b)和/或(c)的任意組合，如包含45-65。/。的脂肪酶(ii)、35-47。/。的脂肪酶(i),和多至16。/。的脂肪酶(vii)的纟且合物。本发明还涉及分离的上述脂肪酶(ii)-(vii)，以及任何上述脂肪酶混合物和脂肪酶组合物，特别用于本文所定义的药物用途。在进一步的具体实施方案中，将本发明的脂肪酶与其它脂肪酶组合使用。所述其它脂肪酶的实例是哺乳动物脂肪酶，和微生物脂肪酶。优选的哺乳动物脂肪酶是胰腺提取物，例如来自猪或牛(ox)，如胰酶制剂(pancreatin)。胰酶制剂可以以未包覆(未加工)产品的形式使用，或者以配方产品(formulatedproducts)的形式(包有肠溶衣的(entericcoated)(提供对胃酸的抗性)，或非功能性包覆的(包覆的，但不提供对胃酸的抗性))使用。胰酶制剂可能包含进一步的酶活性组分，如胰蛋白酶和/或胰淀粉酶。微生物脂肪酶可以是，例如基于或源自细菌或真菌脂肪酶。细菌脂肪酶可以源自，例如芽孢杆菌属或假单胞菌属，真菌脂肪酶可以源自，例如根霉属CR/2/zo;w力、念珠菌属(Om^^)或腐质霉属(7/Mw/co/a)的菌抹，如德氏根霉、爪哇根霉、米根霉，或疏棉状腐质霉的菌抹，具体是产品LipaseD2了m或LipaseDAmano200(^(月旨肪酶，EC3.1.1.3)，其可从AmanoPharmaceuticals,Japan以商业方法获得。本发明的脂肪酶还可与蛋白酶组合使用，有或没有(withorwithout)如下所述的淀粉酶。术语"蛋白酶"在本文中定义为水解肽4建的酶。它包括任何属于EC3.4酶组的酶(包括其十三个亚类的每一个，将这些酶在下文称作"属于EC3.4.-.-组")。蛋白酶的实例是哺乳动物蛋白酶，和微生物蛋白酶。优选的哺乳动物蛋白酶是胰腺提取物，例如来自猪或牛，如胰酶制剂。胰酶制剂可以以未包覆(未加工)产品的形式使用，或者以配方产品的形式(包有肠溶衣的，或非功能性包覆)使用。胰酶制剂可能包含进一步的酶活性组分，如胰脂肪酶、BSSL(BileSaltStimulatedLipase;胆汁盐刺激的酶)，和/或胰淀粉酶。微生物蛋白酶可以是，例如基于或源自细菌或真菌菌抹。蛋白酶可以特别源自曲霉属的菌林，如米曲霉或蜂蜜曲霉的菌林，具体是产品Prozyme6TM(中性、碱性蛋白酶EC3.4.21.63)，可从AmanoPharmaceuticals,Japan以商业方法获得。细菌蛋白酶的实例是来自芽孢杆菌属和拟诺卡氏菌属(^0^^//0/1^)的蛋白酶，如具有SEQIDNO:3的氨基酸1-274的氨基酸序列的地衣芽孢杆菌(6ac"/w//c/zem/w7m》蛋白酶，具有SEQIDNO:4的氨基酸1-188的氨基酸序列的拟诺卡氏菌属菌种蛋白酶，或具有SEQIDNO:5的氨基酸1-188的氨基酸序列的达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种(Nocardiopsisdassonvielleisubsp.Dassonvillei)蛋白酶。SEQIDNO:3的氨基酸1-274的蛋白酶可以例如用丹麦专利申请号为200500930、标题为"用于医药用途的蛋白酶"中所述方法制备，所述文献在2005年6月24日由SolvayPharmaceuticalsGmbH和NovozymesA/S提出申请。SEQIDNO:4-5的氨基酸1-188的蛋白酶可以例如如WO2001/58276或WO2004/111224中所述来制备。在优选实施方案中，本发明的蛋白酶与具有或包含下述之一的蛋白酶是至少70%同一的(i)SEQIDNO:3的氨基酸1-274，(ii)SEQIDNO:4的氨基酸1-188，和/或(iii)SEQIDNO:5的氨基酸1-188。在(i)、(ii)或(iii)的其它优选实施方案中，同一性程度是至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77°/。、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%。在(i)、(ii)或(iii)中任一的可选实施方案中，同一性程度是至少大约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%或至少69%。本发明的脂肪酶，含有或不含有如上所述的蛋白酶，还可与淀粉酶组合使用。在本文的上下文中，淀粉酶是催化淀粉和其它直链与支链寡糖和多糖的内部水解(endo-hydrolysis)的酶。淀粉的直链淀粉部分富含1,4-a-糖苷键，而支链淀粉部分更支链化，不仅包含1，4-a-糖香键，也包含l,6-a-糖苷键。在具体实施方案中，淀粉酶是属于EC3.2.1.1组的酶。在具体实施方案中，淀粉酶是哺乳动物淀粉酶或微生物淀粉酶。哺乳动物淀粉酶的实例是胰腺提取物，例如来自猪或牛，如胰酶制剂。胰酶制剂可以以未包覆(未加工)产品的形式使用，或者以配方产品的形式(包有肠溶衣的，或非功能性包覆)使用。胰酶制剂可能还包含进一步的酶活性组分，如胰蛋白酶和/或胰脂肪酶。微生物淀粉酶可以是例如基于或源自微生物或真菌菌抹，如芽孢杆菌属、假单胞菌属、曲霉属或根霉属。淀粉酶可以具体源自曲霉属的菌林，如黑曲霉、米曲霉或蜂蜜曲霉的菌才朱，例如源自米曲霉的产品AmylaseA1,其可乂人AmanoPharmaceuticals,Japan以商业方法获得；或源自蜂蜜曲霉的AmylaseEC,其可从Extract-Chemie，Germany以商业方法获得。优选的淀粉酶是(i)包含SEQIDNO:6的氨基酸1-481(例如其氨基酸1-481、1-484或1-486)、SEQIDNO:7的氨基酸1-481，和/或SEQIDNO:8的氨基酸1-483的淀粉酶。在优选实施方案中，淀粉酶是所具有或包含的氨基酸序列与以下之一是至少70%同一的淀粉酶(i)SEQIDNO:6的氨基酸1-481,(ii)SEQIDNO:7的氨基酸1-481，和/或(iii)SEQIDNO:8的氨基酸1-483。SEQIDNO:6-8的淀粉酶可以例如，如同时待审的丹麦申请号200500931中所述制备，所述申请标题是"用于医疗用途的淀粉酶"，由SolvayPharmaceuticalsGmbH和NovozymesA/S于2005年6月24日^是出申i青。在(i)、(ii)或(iii)中任一的其它优选实施方案中，同一性程度是至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%。在(i)、(ii)或(iii)中任一的可选实施方案中，同一性程度是至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%或至少69%。在一个实施方案中，本发明涉及与蛋白酶和/或淀粉酶组合使用的脂肪酶，其中(i)所述脂肪酶包含SEQIDNO:1的氨基酸2-269;(ii)所述蛋白酶是选自下组的蛋白酶a)具有SEQIDNO:3的氨基酸1-274的蛋白酶，b)具有SEQIDNO:4的氨基酸1-188的蛋白酶，和c)具有SEQIDNO:5的氨基酸1-188的蛋白酶；(iii)所述淀粉酶是选自下组的淀粉酶a)包含SEQIDNO:6的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO:7的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO:8的氨基S交1-483的淀粉酶。就本发明而言，特别优选的酶的组合如下(i)包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶，与具有SEQIDNO:3的氨基酸1-274的蛋白酶组合；(ii)包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶，与具有SEQIDNO:4的氨基酸l-188的蛋白酶组合；(iii)包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶，与具有SEQIDNO:5的氨基酸1-188的蛋白酶组合；(iv)包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶，与包含SEQIDNO:6的氨基酸1-481(例如其氨基酸1-481、1-484或l-486)的淀粉酶组合；(v)包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶，与具有SEQIDNO:7的氨基酸1-481的淀粉酶组合；(vi)包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶，与具有SEQIDNO:8的氨基酸1-483的淀粉酶组合；(vii)包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶，与具有SEQIDNO:3的氨基酸1-274的蛋白酶和包含SEQIDNO:6的氨基酸1-481的淀粉酶(例如其氨基酸1-481、1—484或l-486)组合；(viii)包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶，与具有SEQIDNO:3的氨基酸1-274的蛋白酶和具有SEQIDNO:7的氨基酸1-481的淀粉酶组合；(ix)包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶，与具有SEQIDNO:3的氨基酸1-274的蛋白酶和具有SEQIDNO:8的氨基酸1-483的淀粉酶组合；(x)包含SEQIDNO:1的氨基S吏1-269或2-269的脂肪酶，与具有SEQIDNO:4的氨基酸1-188的蛋白酶和包含SEQIDNO:6的氨基酸1-481(例如其氨基酸1-481、1-484或l-486)的淀粉酶组合；(xi)包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶，与具有SEQIDNO:4的氨基酸1-188的蛋白酶和具有SEQIDNO:7的氨基酸1-481的淀粉酶组合；(xii)包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶，与具有SEQIDNO:4的氨基S臾1-188的蛋白酶和具有SEQIDNO:8的氨基酸1-483的淀粉酶组合；(xiii)包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶，与具有SEQIDNO:5的氨基酸1-188的蛋白酶和包含SEQIDNO:6的氨基酸1-481(例如其氨基酸1-481、1-484或l-486)的淀粉酶组合；(xiv)包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶，与具有SEQIDNO:5的氨基酸1-188的蛋白酶和具有SEQIDNO:7的氨基S吏1-481的淀粉酶组合；和(xv)包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶，与具有SEQIDNO:5的氨基酸1-188的蛋白酶和具有SEQIDNO:8的氨基酸1-483的淀粉酶组合。其它优选的酶的组合如下(i)和SEQIDNO:1的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶，与和SEQIDNO:3的氨基酸1-274具有至少50%同一性的蛋白酶组合；(ii)和SEQIDNO:1的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶，与和SEQIDNO:4的氨基酸1-188具有至少50%同一性的蛋白酶组合；(iii)和SEQIDNO:1的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶，与和SEQIDNO:5的氨基酸1-188具有至少50%同一性的蛋白酶组合；(iv)和SEQIDNO:1的氨基酸l-269具有至少50%同一性的脂肪酶，与和SEQIDNO:6的氨基酸1-481具有至少50%同一性的淀粉酶组合；(v)和SEQIDNO:1的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶，与和SEQIDNO:7的氨基酸1-481具有至少50%同一性的淀粉酶组合；(vi)和SEQIDNO:1的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶，与和SEQIDNO:8的氨基酸1-483具有至少50%同一性的淀粉酶组合；(vii)和SEQIDNO:1的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶，与和SEQIDNO:3的氨基酸1-274具有至少50%同一性的蛋白酶及和SEQIDNO:6的氨基酸1-481具有至少50%同一性的淀粉酶组合；(viii)和SEQIDNO:1的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶，与和SEQIDNO:3的氨基酸1-274具有至少50%同一性的蛋白酶及和SEQIDNO:7的氨基酸1-481具有至少50%同一性的淀粉酶组合；(ix)和SEQIDNO:1的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶，与和SEQIDNO:3的氨基酸1-274具有至少50%同一性的蛋白酶及和SEQIDNO:8的氨基酸1-483具有至少50%同一性的淀粉酶组合；(x)和SEQIDNO:1的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶，与和SEQIDNO:4的氨基酸1-188具有至少50%同一性的蛋白酶及和SEQIDNO:6的氨基酸1-481具有至少50%同一性的淀粉酶组合；(xi)和SEQIDNO:1的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶，与和SEQIDNO:4的氨基酸1-188具有至少50%同一性的蛋白酶及和SEQIDNO:7的氨基酸1-481具有至少50%同一性的淀粉酶组合；(xii)和SEQIDNO:1的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶，与和SEQIDNO:4的氨基酸1-188具有至少50%同一性的蛋白酶及和SEQIDNO:8的氨基酸1-483具有至少50%同一性的淀粉酶组合；(xiii)和SEQIDNO:1的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶，与和SEQIDNO:5的氨基酸1-188具有至少50%同一性的蛋白酶及和SEQIDNO:6的氨基酸1-481具有至少50%同一性的淀粉酶组合；(xiv)和SEQIDNO:1的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶，与和SEQIDNO:5的氨基酸1-188具有至少50%同一性的蛋白酶及和SEQIDNO:7的氨基酸1-481具有至少50%同一性的淀粉酶组合；和(xv)和SEQIDNO:1的氨基酸l-269具有至少50%同一性的脂肪酶，与和SEQIDNO:5的氨基酸1-188具有至少50%同一性的蛋白酶及和SEQIDNO:8的氨基酸1-483具有至少50%同一性的淀粉酶组合。在(i)-(xv)的优选实施方案中，每个同一性程度是，独立地，至少51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%94%、95%、96%、97%、98%或至少99%。在一个实施方案中，本发明涉及脂肪酶与蛋白酶和/或淀粉酶的酶组合，其中(i)所述脂肪酶包含氨基酸序列，所述氨基S吏序列与SEQIDNO:1的氨基酸1-269具有至少90%同一性，条件是所述脂肪酶不是SEQIDNO:2的氨基酸1-269;(ii)所述蛋白酶与选自下组的蛋白酶具有至少70%同一性a)具有SEQIDNO:3的氨基酸1-274的蛋白酶，b)具有SEQIDNO:4的氨基酸1-188的蛋白酶，和c)具有SEQIDNO:5的氨基酸1-188的蛋白酶；和/或(iii)所述淀粉酶与选自下组的淀粉酶具有至少70%同一性a)具有SEQIDNO:6的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO:7的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO:8的氨基酸1-483的淀粉酶。在这个实施方案中，脂肪酶优选为a)包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269的脂肪酶，或b)是SEQIDNO:1的氨基酸1-269的变体的脂肪酶，其中所述变体与SEQIDNO:1的氨基酸1-269的差异不多于25个氨基酸，并且其中(i)与SEQIDNO:1的氨基酸1-269相比，所述变体包含一个或多个氨基酸的保守取代和/或插入中的至少一种；和/或(ii)与SEQIDNO:1的氨基酸1-269相比，所述变体包含至少一个小缺失；和/或(iii)与SEQIDNO:1的氨基酸l-269相比，所述变体包含至少一个小的N-或C-末端延伸；和/或(iv)所述变体是具有SEQIDNO:2的氨基酸1-269的脂肪酶的等位变体；和/或(v)所述变体是具有SEQIDNO:1的氨基酸1-269的脂肪酶的片段。通常，脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶(下文称作"酶，，，即本发明的酶)可以是天然或野生型酶(获得自动物，具体而言是哺乳动物，例如人或猪酶；自植物，或自微生物)，也可以是其任何显示期望的酶活性的突变体、变体、片段等，以及合成酶，如改组、杂交或嵌合酶，和共有酶。在特定的实施方案中，酶是低变应原性变体，将其设计成当曝露于动物包括人时产生降低的免疫应答。术语免疫应答可以理解为由曝露于酶的动物的免疫系统产生的任何反应。免疫应答的一种类型是变应性应答，其导致曝露的动物中IgE的水平增加。低变应原性变体可以使用本领域已知的技术制备。例如可将酶与聚合物基团屏蔽部分(polymermoietiesshieldingportion)或者免疫应答涉及的酶的表位结合。与聚合物的结合可涉及聚合物对酶的体外化学偶联，例如，如WO96/17929、WO98/30682、WO98/35026和/或WO99/00489所述。所述结合可以另外或可选地涉及聚合物对酶的体内偶联。这种结合可以用下述方法实现编码酶的核酸序列的基因工程，在酶中插入编码额外糖基化位点的共有序列和在能够将酶糖基化的宿主中表达酶，参见例如WO00/26354。提供低变应原性变体的另一种方法是编码酶的核酸序列的基因工程，以引起酶的自寡聚，致使所述酶单体可屏蔽其它酶单体的表位，并且由此降低寡聚体的变应原性。这些产品和它们的制备在例如WO96/16177中有所描述。免疫反应涉及的表位可以由各种方法鉴定，如WO00/26230和WO01/83559中所述的噬菌体展示方法，或EP561907中所述的随机方法。一旦将表位鉴定，可通过已知的基因操作技术，如定向诱变(参见例如WO00/26230、WO00/26354和/或WO00/22103)改变它的氨基酸序列以产生改变的酶的免疫性质，和/或可在足够接近表位处进行聚合物的结合，以使聚合物屏蔽所述表位。在具体实施方案中，酶是(i)在pH2-8稳定，优选也在pH3-7稳定，更优选在pH4-6稳定；(ii)在pH4-9，优选4-8有活性；(iii)对胃蛋白酶和其它消化蛋白酶(如胰蛋白酶(pancreasprotease),即主要为膝蛋白酶(trypsin)和胰凝乳蛋白酶)的降解稳定；和/或(iv)在胆汁盐存在时稳定和/或有活性。本发明的脂肪酶优选在胆汁盐存在时稳定，例如在0.1-50mM胆汁盐存在时，优选在0.5-20mM胆汁盐存在时，和甚至更优选在l-10mM胆汁盐存在时。在胆汁盐存在时，脂肪酶的稳定性例如可以作为在胆汁盐存在下温育后残余的脂肪酶活性来测量。在胆汁盐存在时，测量脂肪酶稳定性的合适方法在实施例部分给出(在1.8mM胆汁盐存在下，于pH6.5和25。C测量60分钟)。优选地，本发明的脂肪酶的残余脂肪酶活性比具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的比较脂肪酶的相应残余活性高至少1.1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6或至少2.7倍，所述试-睑优选地在下述条件进行在1.8mM胆汁盐存在下，于pH6.5和25。C温育60分钟。本发明的脂肪酶此外优选在消化蛋白酶存在时稳定，特别是胃蛋白酶，更特别在pH3.0。测定在猪胃蛋白酶存在时pH3.0的脂肪酶稳定性的合适方法在实施例部分给出(在75吗/mL猪胃蛋白酶存在下，于pH3.0和环境温度测量3小时)。优选地，本发明的脂肪酶的残余脂肪酶活性比具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的比较脂肪酶的相应残余脂肪酶活性高至少1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0或至少4.5倍。术语"与......组合"指根据本发明的脂肪酶、蛋白酶和/或淀粉酶的组合用途。组合用途可以是同时的、重叠的或顺序的，这三个术语通常按照医师的处方来解释。术语"同时的，，指酶同时有活性的环境，例如当它们作为一种或多种单独的药物产品同时施用时，或如果将它们在同一种药物组合物中施用。术语"顺序的"指这样的情况，其中一种和/或两种酶先作用，而第二种和/或第三种酶随后作用。顺序的作用能够这样获得将所述酶作为单独的药物制剂施用，中间有需要的间歇；或者作为一种药物组合物施用，其中对所述酶进行不同的配制(进行区分)，例如为了获得不同的释放时间，提供改进的产品稳定性，或为了最优化酶剂量。术语"重叠的，，指这样的情况，其中酶活性时期既不完全是同时的，也不完全是顺序的，即存在特定的时期，其中两种酶或全部酶都有活性。术语"一(a)",例如当用于本发明的蛋白酶、脂肪酶和/或淀粉酶的上下文中时，指至少一种。在具体实施方案中，"一"表示"一种或多种"或"至少一种”，其也表示一种、两种、三种、四种、五种等。用参数"同一性"描述两个氨基酸序列之间的相关性。就本发明而言，通过使用来自EMBOSS软件包(http://emboss.org)2.8.0版的Needle程序，确定两个氨基酸序列之间的比对。Needle程序执行Needleman,S.B.andWunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453所述的全局比对算法(globalalignmentalgorithm)。4吏用的取代矩阵(substitutionmatrix)是BLOSUM62，缺口开力丈罚分是(gap叩eningpenalty)10，缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)是0.5。本发明的氨基S臾序列("发明序列"；例如SEQIDNO:1的氨基酸1-269)与不同的氨基酸序列("外源序列"；例如SEQIDNO:2的氨基S臾1-269)之间的同一度这样计算将两个序列的比对中完全匹配的氨基酸数目，除以"发明序列，，的长度或"外源序列"的长度中较短的一个。结果以同一性百分比表示。当"发明序列"和"外源序列"在重叠的相同位置具有同一的氨基酸残基时(在下述比对实例中用"I"表示)，发生完全匹配。序列的长度是序列中氨基酸残基的数目(例如SEQIDNO:1的长度是269)。在下述完全假设的比对实例中，重叠是序列1的氨基酸序列"HTWGER-NL";或序列2的氨基酸序列"HGWGEDANL"。在所述实例中，缺口用"-"表示。假设的比对实例序列1:ACMSHTWGER—NL<formula>seeoriginaldocumentpage18</formula>序列2:HGWGEDANLAMNPS因此，序列l对序列2的同一性百分比是6/12=0.5，对应于50%。在具体实施方案中，多肽的氨基酸序列和，或对，SEQIDNO:l的氨基酸1-269的同一性百分比用如下方法确定i)使用Needle程序比对两个氨基酸序列，使用BLOSUM62置换矩阵，缺口开放罚分为10，并且缺口延伸罚分为0.5;ii)计数比对中完全匹配的数目；iii)将完全匹配的数目除以两个氨基酸序列中最短序列的长度，和iv)将iii)中除法的结果转换成百分比。对，或和，本发明其它序列如SEQIDNO:4的氨基酸l-188的同一性百分比，以类似方法计算。或者，两个氨基酸序列之间的同一性程度可以用程序"比对(align)"确定，所述程序"比对"为Needleman-Wunsch比对(即全局比对)。将序列通过所述程序比对，使用默认的记分矩阵BLOSUM50。缺口的第一个残基的罚分是12，并且对于缺口其它残基的罚分是2。Needleman-Wunsch算法在Needleman，S.B.andWunsch,C.D.，(1970)，JournalofMolecularBiology,48:443-453中有4苗述，并且所述对比程序由Myers和W.Miller在"OptimalAlignmentsinLinearSpace"CABIOS(computerapplicationsinthebiosciences)(1988)4:11-17中描述。"比对”是FASTA软件包v20u6版的一部分(参见W.R.PearsonandD.J.Lipman(1988)，"ImprovedToolsforBiologicalSequenceAnalysis",PNAS85:2444-2448,和W.R.Pearson(1990)"RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPandFASTA"MetodsinEnzymology183:63-98)。本发明的任何酶的样品序列或测试序列，与指定序列之间的同一性程度可以按照如下方法确定使用程序"比对，，来比对所述两个序列。确定比对中完美匹配的数目("N-完美-匹配")(完美匹配指比对的相同位置上为相同的氨基酸残基)。也确定两个进行比对的序列的共有长度(commonlength),即比对(重叠)中氨基酸的总数，包括比对产生的拖尾和前导缺口，如果存在任何这样的缺口("N-重叠")。将同一性程度作为"N-完美-对应"和"N-重叠"之间的比率计算(若转换成百分比同一性，则乘以100)。样品序列或测试序列与指定序列之间的同一性程度可以按照如下方法确定使用程序"比对"来比对所述序列。确定比对中完美匹配的数目("N-完美-匹配")(完美匹配指比对的相同位置上为相同的氨基酸残基)。确定样品序列的长度(氨基酸残基数)("N-样品，，)。将同一性程度作为"N-完美-匹配"和"N-样品"之间的比率计算(若转换成百分比同一性，则乘以100)。样品序列或测试序列，与指定序列之间的同一性程度也可以按照如下方法确定使用程序"比对"来比对所述序列。确定比对中完美匹配的数目("N-完美-匹配")(完美匹配指比对的相同位置上为相同的氨基酸残基)。确定指定序列的长度(氨基酸残基数)("N-指定")。将同一性程度作为"N-完美-匹配"和"N-指定"之间的比率计算(若转换成百分比同一性，则乘以100)。优选地，重叠是指定序列的至少20%("N-重叠"如上所定义，除以指定序列中氨基酸的数目("N-指定")，并且乘以100),更优选至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或至少95%。这表示当将样品序列与指定序列比对时，指定序列的氨基酸的至少20%(优选25-95%)最终包括于重叠中。或者，重叠是指定序列的至少20%("N-重叠"如上所定义，除以如上所定义的"N-样品"，并且乘以100),更优选为至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或至少95%。这表示当与指定序列比对时，样品序列的氨基酸的至少20%(优选25-95%)最终包括于重叠中。本发明的酶的活性能够使用任何合适的试验方法测定。通常，可使试验-pH和试验-温度适合于所述酶。试验-pH值的实例是pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。试验-温度的实例是30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90或95。C。优选的pH值和温度是在生理范围，如pH值4、5、6、7或8,和温度30、35、37或40。C。实验部分包括了合适的酶试验的实例。其它实例是用于蛋白酶和淀粉酶活性的FIP或Ph.Eur.试验。这些试验，例如，分别在共同待审的申请DK200500930和DK200500931中描述。药物在本上下文中，术语"药物"指化合物或化合物的混合物，其治疗、预防和/或减轻疾病的症状，优选治疗和/或减轻疾病的症状。药物可以由医师开出处方，或者可以是非处方(over-the-counter)产品。药物组合物本发明的酶的分离、纯化和浓缩可以通过常规方法进行。例如，它们可以通过常规程序从发酵培养液中回收，所述常规程序包括但不限于，离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，并用本领域已知的各种方法进一步纯化，所述方法包括但不限于，层析(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵;冗淀)、SDS-PAGE或才是取(参见，例如，ProteinPurification,J.-C.JansonandLarsRyden，editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。例如，SEQIDNO:1的脂肪酶可以，例如，基于美国专利号5，869，438(其中SEQIDNO:1是编码本文的SEQIDNO:2的脂肪酶的DNA序歹'J)制备，即通过下述方法在合适的宿主细胞中重组表达DNA序列，所述DNA序列是该美国专利的SEQIDNO:1的修饰体，修饰体反映本文的SEQIDNO:1和SEQIDNO:2之间的氨基酸差异。这些修饰能够通过定向突变实现，如本领i或所知。在具体实施方案中，将每个酶的浓缩固体或液体制备物单独制备。这些浓缩物也可以，至少部分地，单独进行配制，如下所详细解释的。在另外的具体实施方案中，将酶以固体浓缩物形式并入本发明的药物组合物中。酶能够通过本领域已知的各种方法形成固态。例如，固态可以是结晶，其中酶分子以高度有序的形式排列；或是沉淀物，其中酶分子排列形式有序性较低，或是无序形式。结晶可以例如在接近酶的pi的pH并在低电导率实现，所述电导率例如10mS/cm或更低，如EP691982所述。在具体实施方案中，根据本发明使用的脂肪酶是结晶脂肪酶，其可以如EP600868Bl的实施例1所述制备。脂肪酶晶体此外还可以如WO2006/044529所述的交联。各种沉淀方法在本领域已知，包括用盐沉淀，如石危酸铵，和/或碌u酸钠；用有机溶剂沉淀，如乙醇，和/或异丙醇；或用聚合物沉淀，如PEG(聚乙二醇)。或者，酶能够用本领域已知的各种方法通过去除溶剂(通常为水)而从溶液沉淀，所述方法例如冻千、蒸发(例如在减压下)，和/或喷雾干燥。在进一步具体的实施方案中，酶的固体浓缩物具有的活性酶蛋白含量为固体浓缩物中总蛋白含量的至少50%(w/w)。在仍进一步具体的实施方案中，活性酶蛋白的含量，相对于固体浓缩物的总蛋白含量是至少55、60、65、70、75、80、85、90或至少95%(w/w)。蛋白含量能够如本领域已知的进行测量，例如通过密度计扫描考马斯染色的SDS-PAGE凝胶，例如使用BIO-RAD的GS-800校准的光密度计；通过使用商业试剂盒，如ProteinAssayESL，定购号1767003,其可从Roche以商业方法获得；或基于WO01/58276的实施例8所述的方法。优选地，用密度计扫描考马斯染色的SDS-PAGE凝胶测定时，脂肪酶酶蛋白组成根据本发明使用的固体脂肪酶浓缩物的蛋白谱的至少50%，更优选至少55、60、65、70、75、80、85、90、92、94、95、96或至少97%。就实施例5中所解释的、在曲霉中表达并包含SEQIDNO:1的各种N-末端形式的混合物的脂肪酶而言，SDS-PAGE凝胶上的相关条带位于与34-40kDa的分子量对应的位置。就SEQIDNO:1的非糖基化变体N33Q而言，相关条带位于大约30kDa的位置。本发明的药物组合物包含酶，所述酶优选为浓缩酶制备物的形式，更优选为固体浓缩物，加上至少一种可药用的辅助或补充(subsidiary)材料，如(i)至少一种载体和/或赋型剂；或(ii)至少一种载体、赋型剂、稀释剂，和/或佐剂。均可药用的任选的其它组分的非限定性实例是崩散剂(disintegrator)、润滑剂、缓冲剂、增湿剂、防腐剂、增香剂、溶剂、增溶剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、推进剂和媒介物(vehicle)。通常，根据所述医学适应症，可以针对本领域已知的所有施用方式设计本发明的组合物，优选包括肠内施用(通过消化道)。因此，组合物可以为固体、半固体、液体或气体形式，如片剂、胶嚢、粉剂、颗粒剂(granule)、微球(microsphere),软膏、乳膏(cream)、泡沫、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球、洗剂(lotion)和气溶胶。医务工作者将了解选择最合适的施用途径，并理所应当地避免潜在的危险或其它不利的施用途径。下述方法和辅助材料因此仅也作为示例性而绝非用以限制。对于固体口服制备物,所述酶能够单独使用或与合适的添加剂组合使用，以制成小丸(pellet)、微丸(micropellet)、片剂、微片剂、粉剂、颗粒剂或胶嚢，例如，与常规载体组合使用，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；与赋型剂或粘合剂组合使用，如结晶状或微晶状纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶(acacia)、玉米淀粉或明胶；与崩散剂组合使用，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧曱基纤维素钠；与润滑剂组合使用，如巴西棕榈蜡，白蜡，虫胶，无水胶态硅石(waterlesscolloidsilica),从1500到20000的聚乙二醇(PEG，也称作术语聚乙二醇(macrogol))，具体而言是PEG4000、PEG6000、PEG8000，聚维酮(povidone)，滑石，monolein或硬脂酸镁；并且如果需要，与稀释剂、佐剂、緩沖剂、润湿剂、防腐剂如对羟基苯曱酸曱酯(E218)、着色剂如二氧化钛(E171),和增香剂如蔗糖、糖精、橙油、柠檬油和香兰素组合使用。口服制备物是用作治疗PEI的医学适应症的优选制备物的实例。还能够将所述酶非常常规地配制成液体口服制备物,通过将它们溶解、悬浮或乳化在水溶剂如水中，或非水溶剂中，如植物性或其它类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸的酯、丙二醇、聚乙二醇如PEG4000，或低级醇，如直链或分支的C1-C4醇，例如2-丙醇；并且如果需要，与常规补充材料或添加剂组合使用，如增溶剂、佐剂、稀释剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。此外，所述酶通常能够通过与各种基底(bases)例如乳化基底(emulsifyingbase)或水溶性基底(water-solublebase)混合制成栓剂用于直肠施用。所述栓剂可包括在体温熔化而在室温固化的运载体(vehicle)如可可豆油、碳蜡和聚乙二醇。使用脂质体作为递送运载体也是一种通常可能感兴趣的方法。脂质体与靶位点的细胞融合，并且细胞内递送腔室(lumen)的内容物。将脂质体保持与细胞接触一段足够融合的时间，使用各种方法以保持接触，例如分离、结合剂等。在本发明的一个方面，将脂质体设计成雾化用于肺部施用。可将脂质体与介导膜融合的纯化蛋白质或肽一起制备，如仙台病毒或流感病毒等。脂质可以是已知的脂质体形成脂质的任何有用组合，包括阳离子或两性离子的脂质，例如磷脂酰胆碱。剩余的脂质通常将是中性或酸性脂质，例如胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等。为制备脂质体，可以使用Kato等(1991)J.Biol.Chem.266:3361所述的方法。可以提供用于口服或直肠施用的单位剂型如糖浆、酏剂、粉剂和悬浮剂，其中每剂量单位，例如，一茶匙、一大汤匙、胶嚢、片剂或栓剂，包含预先定量的酶。相似地，用于注射或静脉内施用的单位剂型可将酶包含在作为无菌水、生理盐水或其它可药用载体的溶液的组合物中。术语"单位剂型，，用于本文指适合作为人和动物受试者单元剂量(unitary)的物理上的离散单位(physicallydiscreteunit)，每单位含有预先定量的酶，所预定的量足以产生期望效果。在具体实施方案中，本发明的药物组合物用于肠内施用，优选口服施用。在进一步的具体实施方案中，口服组合物是(i)包含酶晶体的液体组合物；(ii)(高度)纯化酶的沉淀的液体悬浮剂；(iii)包含固体或溶解的酶的凝胶；(iv)固定化酶或吸附于微粒上的酶等的液体悬浮剂；或(v)以含酶粉剂、小丸、颗粒剂或微球形式存在的固体组合物，如果需要，以片剂、胶嚢等形式存在的固体组合物，可任选地将所述固体组合物包覆，例如用酸稳定性的包覆物。在组合物的另一个具体的实施方案中，对酶进行区分(compartmentalize),即彼此分离，例如通过分离包覆的方法。在组合物的仍进一步的具体实施方案中，将蛋白酶与组合物的其它酶组分分隔，所述其它酶组分如脂肪酶和/或淀粉酶。酶的剂量将变化很大，依赖于将施用的特定的酶、施用频率、施用方式、症状的严重性和受试者对副作用的易感性等。某些特定的酶可能比其它的酶更有效。本发明的酶的固体口服制备物的实例包含(i)与SEQIDNO:1的氨基酸1-269具有至少90%同一性的本发明的脂肪酶；(ii)与选自下组的蛋白酶具有至少70%同一性的蛋白酶a)具有SEQIDNO:3的氨基酸1-274的蛋白酶，b)具有SEQIDNO:4的氨基酸1-188的蛋白酶，和c)具有SEQIDNO:5的氨基酸1-188的蛋白酶；和/或(iii)与选自下组的淀粉酶具有至少70%同一性的淀粉酶a)具有SEQIDNO:6的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO:7的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO:8的氨基酸1-483的淀粉酶；其中优选地，(i)、(ii)和(iii)的酶的预期每日临床剂量如下(全部以mg酶蛋白每kg体重(bw)表示)对于(i)的脂肪酶0.01-1000、0.05-500、0.1-250或0.5-100mg/kgbw;对于(ii)的淀粉酶0.001-250、0.005-100、0.01-50或0.05-10mg/kgbw;对于(iii)的蛋白酶0.005-500、0.01-250、0.05-100或0.1-50mg/kgbw。本发明的酶的固体口服制备物的优选实例包含(i)包含SEQIDNO:1的氨基酸2-269的脂肪酶，和(ii)包含SEQIDNO:6的氨基酸1-481的淀粉酶，和/或(iii)包含，优选具有，SEQIDNO:3的氨基酸1-274的蛋白酶。(i)、(ii)和(iii)的酶的预期每日临床剂量的实例如下(全部以mg酶蛋白每kg体重(bw)表示)对于(i)的脂肪酶0.1-250、0.5-100或1-50mg/kgbw;对于(ii)的淀粉酶0.01-50、0.05-10或0.1-5mg/kgbw;对于(iii)的蛋白酶0.05-100、0.1-50或0.5-25mg/kgbw。为了口服施用时更好的稳定性，可对酰胺(肽)键以及氨基和羧基末端进行修饰。例如，可将羧基末端酰胺化。本发明的药物组合物的具体实施方案，其适合于治疗消化性病症、PEI、胰腺炎、嚢性纤维化、I型糖尿病，和/或II型糖尿病，可通过将本发明的酶并入小丸中来制备。所述小丸通常可包含10-90%(重量/重量，相对于所得小丸的干重)生理上可以接受的有机聚合物，10-90%(重量/重量，相对于所得小丸的千重)的纤維素或纤维素衍生物，和80-20%(重量/重量，相对于所得小丸的干重)的酶，在每种情况下，使有机聚合物、纤维素或纤维素衍生物和酶的总量满足100%。生理上可以接受的有机聚合物可选自下组聚乙二醇1500、聚乙二醇2000、聚乙二醇3000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、聚乙二醇20000、羟丙基甲基纤维素、聚氧化乙烯、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯的共聚物和所述有机聚合物的混合物。聚乙二醇4000优选作为生理上可以接受的有机聚合物。纤维素或纤维素衍生物可以例如选自纤维素、乙酸纤维素、纤维素脂肪酸酯、硝酸纤维素、纤维素醚、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、曱基纤维素、甲基乙基纤维素和曱基羟丙基纤维素。纤维素，特别是微晶纤维素优选作为纤维素或纤维素衍生物。所得小丸可以用合适的肠溶衣包覆，用其它非功能性包覆物包覆或不进行这种包覆地直接使用。此外，所得的小丸可以填充到胶嚢如硬明胶胶嚢或不含明胶的胶囊中，所述胶嚢的大小适合治疗上文详细描述的病症或疾病。在本发明的实施方案中，产生自不同酶类型，特别是产生自脂肪酶、蛋白酶和/或淀粉酶的小丸，可以填充到所述胶嚢中。当用不同酶类型填充胶嚢时，通过向胶嚢添加指定量的脂肪酶、蛋白酶和/淀粉酶中的任一种，可使单一酶类型(即脂肪酶、蛋白酶或淀粉酶)的定量适合于某种适应症组或某种患者亚组的特定需要，即可产生其中脂肪酶:蛋白酶:淀粉酶的特定比例不同的胶囊。本发明的脂肪酶的优选药物组合物在WO2005/092370中描述，特别是包含本文提到的优选exhibient的制剂。在特别优选的实施方案中，药物组合物包含单、二和三酰基甘油酯和聚乙二醇(PEG)C6-C22脂肪族羧酸的单酯和二酯的聚乙二醇甘油酯(macrogolglyceride)混合物，并且也可能包含小部分的甘油和游离聚乙二醇。包含于聚乙二醇甘油酯混合物中的聚乙二醇(PEG)优选是平均每分子具有6个到最多40个环氧乙烷单元的PEG，或优选是具有分子量在200-2000的PEG。本发明的另一个方面提供本发明的酶的药物组合物，其包含由表面活性剂、共表面活性剂(co-surfactant)和亲脂相组成的体系，所述体系具有大于或等于10的HLB(亲水-亲脂平衡，Hydrophilic-LipophilicBalance)值，和高于或等于30。C的熔点。在优选实施方案中，所述体系具有10-16的HLB值，优选12-15,和在30-600℃的熔点，优选在40-500℃。具体而言，通过HLB值和熔点表征的体系是单、二和三酰基甘油酯与聚乙二醇(PEG)和脂肪族羧酸的单和二酯的混合物，所述脂肪族羧酸具有8-20个碳原子，优选8-18个，而聚乙二醇优选每分子具有大约6至大约32个环氧乙烷单元，并且所述体系任选地包含游离甘油和/或游离聚乙二醇。这种体系的HLB值优选通过PEG的链长来调节。这种体系的熔点通过脂肪酸的链长、PEG的链长和脂肪酸链的饱和度来调节，并且因此由制备聚乙二醇甘油酯混合物的起始油(startingoil)来调节。"C8-C18脂肪族羧酸"指混合物，其中将辛酸(C8)、癸酸(CIO)、月桂酸(C12)、肉豆蔻酸(C14)、棕榈酸(C16)和硬脂酸(C18)以重要而可变的比例包含在内，如果这些酸是饱和的，还包括相应的不饱和C8-C18羧酸。这些脂肪酸的比例可根据起始油而变化。这样的单、二和三酰基甘油酯和聚乙二醇(PEG)与脂肪族羧酸的单和二酯的混合物，其中所述脂肪族羧酸带有8至18个碳原子，所述混合物可以例如通过聚乙二醇和起始油的反应获得，其中聚乙二醇的分子量在200-1500,并且所述起始油由带有脂肪酸的甘油三酸酯混合物组成，所述脂肪酸选自包含以下脂肪酸的组辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚麻酸，单独存在或作为混合物。任选地，这种反应的产物也可包含小比例的甘油和游离聚乙二醇。这些混合物可以商业方法获得，例如以商品名Gelucire⑧。本发明的一个有优势的实施方案提供商品名为Gelucire的商品，具体而言"Gelucire50/13"和/或"Gelucire⑧44/14",其代表适合用于根据本发明的药物制备物中的混合物。Gelucire50/13是混合物，包含单、二和三酰基甘油酯和聚乙二醇的单和二酯，分别带有40%至50。/。的棕榈酸(C16)和48%至58。/。的硬脂酸(C18)，组成结合脂肪酸(boundfattyacid)的主要部分。在每种情况下，辛酸(C8)和癸酸(C10)的比例少于3%，并且在每种情况下月桂酸(C12)和肉豆蔻酸(C14)的比例少于5%。Gelucire44/14是混合物，包含单、二和三酰基甘油酯和聚乙二醇的单和二酯，各比例如下棕榈酸(C16)是4-25。/。，硬脂酸(C18)5-35%,辛酸(C8)少于150/。，癸酸(C10)少于12%，月桂酸(C12)30-50％和肉豆蔻酸(C14)5-25％。Gelucire44/14能够例如通过使用棕榈仁油和聚乙二醇1500的醇解/酯化反应来制备。本发明的优选实施方案提供本发明的酶的药物组合物，其包含的体系含有单、二和三酰基甘油酯和C8-C18脂肪族羧酸的聚乙二醇单和二酯的混合物，并且还可能含有小比例的甘油和游离聚乙二醇，所述体系具有在4(TC-55。C的熔点和在12-15的HLB值。更优选地，所述体系具有在44°C-50°C的熔点和在13-14的HLB值。或者，所述体系具有大约44"C的熔点和14的HLB，或所述系统具有大约5(TC的熔点和13的HLB值。处理方法根据本发明使用的脂肪酶，任选地与蛋白酶和/或淀粉酶(本发明的酶)组"动物"包括所有动物，并且特别是人类。动物的实例是非反刍动物和反刍动物，如绵羊、山羊和牛，例如肉牛(beefcattle)和奶牛。在具体实施方案中，动物是非反刍动物。非反刍动物包括单胃动物，例如马、猪(包括但不限于，小猪、正在成长的猪(growingpigs)和母猪(sow));家禽，如火鸡、鸭和小鸡(chickens)(包括但不限于雏鸡(broilerchick)、蛋鸡(layer));牛犊(youngcalves);宠物如猫和狗；和鱼(包括但不限于鲑鱼(salmon)、鳟鱼(trout)、罗非鱼(tilapia)、鲶鱼(catfish)和鲤鱼(carp));和曱壳类动物(包括但不限于河奸(shrimp)和对奸(prawn))。在具体实施方案中，动物是哺乳动物，更具体为人类。例如，所述酶对于消化性病症如消化不良或胃弱(dyspepsia)等的治疗是有用的，所述消化性病症经常由消化酶的产生不足和/或向胃肠道中的分泌不足引起，所述消化酶通常分泌自胃和胰腺。此外，酶对PEI的治疗特别有用。PEI能够使用Borgstr6m测试(JOP.JPancreas(Online)2002;3(5):116-125)验证，并且它可能由以下疾病和症状导致，如胰腺癌、胰腺和/或胃的外科手术，例如胰腺的全部或部分切除术、胃4刀卩余术、后胃肠分;虎术(postgastrointestinalbypasssurgery)"列嗦口BillrothII式胃肠造口吻合术)；慢性胰腺炎；施-戴综合征(ShwachmanDiamondSyndrome);胰腺或总胆管的管梗阻(例如来自肿瘤)；和/或嚢性纤维化(遗传性疾病，其中浓粘液阻断胰管)。所述酶也可以是对急性胰腺炎的治疗有用的。所述酶对消化病症的作用可以如EP0600868中积ii舌描述的测定；其中实施例2描述用于测定在胃条件下的脂肪酶稳定性的体外消化性测试(digestibilitytest),而实施例3描述用于测定在胆汁盐存在下的脂肪酶活性的体外消化性测试。可以针对蛋白酶和淀粉酶建立相应的测试。WO02/060474也公开了合适的测试，例如(l)用于测定猪的测试伺料中脂质消化的体外测试，和(2)用胰腺分泌不足(pancreasinsufficient)的猪进行的体内试验，其中测定脂肪、蛋白质和淀粉的消化性。在具体实施方案中，使用实施例2的完全体内消化性试验测定本发明的脂肪酶的作用。作为另一个实例，酶对治疗i型和/或n型糖尿病(Diabetesmellitus)是有用的，特别是对糖尿病治疗中对经常伴随这种病症的消化性病症的辅助治疗，以减少晚期并发症为目的。可以通过一种或多种WO00/54799所述的方法来确定酶对糖尿病的效果，例如通过控制糖基化血红蛋白的水平，血糖水平，低血糖发作(hypoglycaemicattack),脂溶性维生素如维生素A、D和E的状态，胰岛素的必需每日剂量，体重指标，和高血糖期。本文描述并且提出权利要求的发明不限于本文公开的特定实施方案的范围，因为这些实施方案旨在说明本发明的几个方面。任何相当的实施方案应包含于本发明的范围内。事实上，除了本文所示和所述之外对本发明的各种修饰，根据前文的描述，对本领域的技术人员是显而易见的。这些修饰也应包含于所附权利要求的范围内。在发生冲突的情况下，按照包括定义在内的本
发明内容为准。本文引用的各种文献，所述文献的公开通过引用以其完整形式并入本文。实施例实施例1:酶试-验用于猪胰酶制剂(pancreatin)中脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶活性的试验已经由FIP(F战rationInternationalePharmaceutique)以及欧洲药典(EuropeanPharmacopoeia)和美国药典(UnitedStatesPharmacopoeia)公布。1FIP-单位=1Ph.Eur.-单位(欧洲药典)。所述试-验在例如F6d6rationInternationalePharmaceutique,ScientificSection:InternationalCommission中关于药用酶标准化部分中有所描述。a)"PharmaceuticalEnzymes,"Editors:R,RuyssenandA.Lauwers,E.StoryScientia，Ghent,Belgium(1978),b)欧洲药典。也参见DeemesteretalinLauwersA，Scharp6S(eds):PharmaceuticalEnzymes,NewYork,MarcelDekker,1997，p.343-385。适当的酶标准品可以从下述单位获得InternationalCommissiononPharmaceuticalEnzymes,CentreforStandards,Harelbekestraat72，B-9000Ghent。脂肪酶FIP试验及其它用于脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶的合适试验如下所述。脂肪酶FIP试验为了测定胰酶制剂的脂肪分解活性，使用欧洲药典5.1中公布的方法。除非另作说明，为了确定微生物脂肪酶的脂肪分解活性，使用FIP公布的用于米根霉脂肪酶的试验。脂肪酶pNP试马全底物对-硝基-苯基(pNP)戊酸(para-Nitro-PhenylValerate)试验pH:7.7试验温度40°C反应时间25分钟带有黄色的消化产物在405nm有特征吸收。用分光光度法确定它的量。一个脂肪酶单位是在给定的试验条件下，每分钟释放1樣i摩尔可滴定的丁酸的酶量。更详细的试-险描述AF95/6-GB,可向NovozymesA/S，Krogshoejvej36,DK-2880Bagsvaerd，Denmark请求获得。脂肪酶LU试验在这个试验中，0.16M三丁酸甘油酯(tributyrin)(甘油三丁酸酯，Merck1.01958.000)在pH7.00和30。C(+M。C)的脂肪酶催化降解，通过用0.025M脱气的(de-gassed)、不含C02的氢氧化钠(Sodiumhydroxidetitrisol,Merck9956)对释放的丁酸进行恒-pH滴定(pH-stattitration)来跟踪。将滴定剂的消耗作为时间的函数记录。将底物用0.6%w/v阿拉伯树胶乳化剂乳化(20.0g阿拉伯树胶、89.5gNaCl、2.05gKH2PO4、加水至1.51,加水直至全部溶解，加入2700ml甘油，调节pH至4.5。将90ml三丁酸甘油酯与300ml阿拉伯树胶乳化剂和1410ml脱矿质水(demineralisedwater)混合，并且使用例如Silverson乳化剂L4RT于7000rpm均质化3分钟，然后调节至pH4.75)。脂肪酶样品首先在0.1M甘氨酸緩冲液(glycinbuffer)pH10.8中稀释，然后在脱矿质水中稀释，使活性水平为1.5-4,0LU/ml。将15ml乳化的底物溶液倒入滴定容器。加入1.0ml样品溶液，并且在滴定过程中将pH保持在7.0。测定为维持恒定的pH每分钟加入的滴定剂的量。活性计算基于滴定曲线线性范围的平均斜率。可以使用已知活性的标准品作为校验水平(levelcheck)。1LU(脂肪酶单位)是在上述给定试验条件下，每分钟释放1微摩尔可滴定的丁酸的酶量。1kLU(千脂肪酶单位)-IOOOLU。更详细的试-验描述EB-SM-0095.02，可向NovozymesA/S,Krogshoejvej36，DK-2880Bagsvaerd，Denmark请求获得。脂肪酶恒定pH试验试验基于在0.65mM胆汁盐存在下从橄榄油乳剂中由脂肪酶催化释放脂肪酸。将底物用作为乳化剂的阿拉伯树胶乳化(将175g橄榄油用630ml阿拉伯树胶溶液(4000ml水中的474.6g阿拉伯树胶、64g氯化钙)在搅拌器中乳化15分钟；冷却至室温后，使用4MNaOH将pH调节至pH6.8-7.0)。为了测定，将19ml乳剂和10ml胆汁盐溶液(将492mg胆汁盐溶于水中，并补充至500ml)在反应容器中混合并加热至36.9°C至37.5°C。通过加入1.0ml酶溶液开始反应。释放的酸通过加入0.1M氢氧化钠自动于pH7.0滴定，共进行5分钟。从第一分钟和第五分钟之间滴定曲线的斜率计算活性。为了校准，在三种不同活性水平测定标准品。蛋白酶Suc-AAPF-。NA试验底物Suc-AAPF-pNA(SigmaS-7388)。试验緩冲液100mM琥珀酸、100mMHEPES(SigmaH-3375)、100mMCHES(SigmaC-2885)、100mMCABS(SigmaC-5580)、lmMCaCl2、150mMKC1、0.01%TritonX-100,用HC1或NaOH调节至pH9.0。试验温度25°C。将300(xl稀释的蛋白酶样品与1.5ml试验緩沖液混合，通过加入1.5mlpNA底物(50mg溶于1.0mlDMSO中，并用0.01%TritonX-100进一步稀释45x)开始活性反应，在混合后，用分光光度计监测A405的增加，作为对蛋白酶活性的测量。在活性测量之前将蛋白酶样品稀释，以确保所有活性测量结果都落在试验的剂量-反应曲线的线性范围中。蛋白酶AU试验变性的血红蛋白(0.65。/。(w/w)于含脲的6.7mMKH2P04/NaOH缓冲液pH7.50中)在25。C用蛋白酶降解10分钟，用三氯乙酸(TCA)将未降解的血红蛋白沉淀，并过滤去除。用Folin&Ciocalteu的苯酚试剂(l体积Folin-CiocalteuPhenolReagentMerck9001.0500加至2体积脱矿质水)测定滤液中TCA可溶的血红蛋白降解产物，所述苯酚试剂与几种氨基酸一起得到蓝色(在750nm测定)。活性单位(AU)参照标准品来测定和定义。变性的血红蛋白底物可以如下制备将1154g脲(Hamstoff,Merck8487)溶于1000ml脱矿质水中，加入240.3gNaOH，然后慢慢加入63.45g血红蛋白(Merck4300),然后加入315.6gKH2P04,加脱矿质水至3260g。将pH调节至7.63。更多细节和合适的Alcalase标准品可向NovozymesA/S,Krogshoejvej36，DK-2880Bagsvaerd,Denmark(试验号EB-SM-0349.01)请求获得。淀粉酶底物Phadebas片剂(PharmaciaDiagnostics;交联、不溶、蓝色的淀粉聚合物，将其与牛血清白蛋白和緩冲物质混合，并制成片剂)。试验温度37°C试验pH:4.3(或7.0，如果需要)反应时间20分钟在悬浮于水中后，用a-淀粉酶水解淀粉，得到可溶的蓝色片段。所得蓝色溶液于620nm测得的吸光度是a-淀粉酶活性的函数。一个真菌a-淀粉酶单位(lFAU)是在标准试验条件每小时分解5.26g淀粉(Merck，AmylumsolubileErg.B.6,批号9947275)的酶量。更详细的试验描述APTSMYQI-3207,可向NovozymesA/S，Krogshoejvej36,DK-2880Bagsvaerd，Denmark请求获得实施例2:体内消化性试验在雌性G6ttingen迷你猪(Ellegaard)体内在完全消化性研究中测试纯化的疏棉状腐质霉脂肪酶变体，所述脂肪酶变体具有SEQIDNO:1的氨基酸1-269(及其较少量的衍生物，所述衍生物包含SEQIDNO:1的氨基酸-5-269)。将效能(e伍cacy)与SEQIDNO:2的疏棉状腐质霉脂肪酶(如US5614189所述)的效能进行比较。通过结扎胰管诱发迷你猪的胰腺外分泌机能不全(PEI),并且配以回盲折返插管(ileo-caecalreentrantcannula),上述全部在氟烷麻醉下进4亍，并且体重为约25kg,如Tabelingetal.,J.1999，Studiesonnutrientdigestibilities(pre-caecalandtotal)inpancreaticduct-ligatedpigsandtheeffectsofenzymesubstitution,J.Anim.Physiol.A.Anim.Nutr.82:251-263和Gregoryetal.,J.1999.Growthanddigestioninpancreaticductligatedpigs,Effectofenzymesupplementationin"BiologyofthePancreasinGrowingAnimals"(SGPierzynowski&R.Zabielskieds)，ElsevierScienceBV,Amsterdam,pp381-393中所述。在研究开始之前，允许用至少4周的时间从外科手术中恢复。在研究开始前，通过粪便胰凝乳蛋白酶测试(可从ImmundiagnostikWiesenstrasse4，D-64625Bensheim，Germany以商业方法获4寻，目录号为K6990)确定每头猪的PEI状态。在研究过程中，猪在猪圈中，采用12:12小时的明-暗循环(light-darkcycle),而且允许自由饮水，并每日喂食两餐。为了评估脂肪酶的效能，喂养猪的250g测试餐包含180g两次研磨的饮食，Altromin902006加70g大豆油(Roth)，与1升水混合，和0.625gCr203(三氧化二净各标记)，并且在喂食前即刻混入不同量的两种脂肪酶中的一种或另一种至所述测试餐中。施用的每种脂肪酶的量如表l的括号中所示，即以FIPU脂肪酶/餐(脂肪酶FIP单位，参见实施例l)表示的活性。测试餐包含16.3%蛋白质、28.9%淀粉和32.9%脂肪，并按照猪的营养需要包括维生素、矿物质和痕量元素。每种酶剂量喂食至少14天即对猪喂食高脂肪饮食加上每种新酶剂量9天，其后5天收集所有粪便，称重并在-2(TC储存。将每头猪的冷冻粪便冷冻干燥、再次称重并研磨。然后将5天中每一天的研磨样品的等分试样(根据每日粪便的产生)集中并且混合在一起；即，对于每头猪每种酶剂量得到一个集中样品。从每份集中样品中确定干物质和粗脂肪的含量(Naumann&Bassler1993;DiechemischeUntersuchungvonFuttermittdn,3.edition,VDLUFA-Verlag,Darmstadt(VDLUFA=VerbandDeutscherLandwirtschaftlicherUntersuchungs－undForschungsanstalten))。在冻干后于103。C温育8小时之后，按重量估计干物质；在浓盐酸中煮沸30分钟后，用汽油醚提取6小时，之后根据重量确定粗脂肪；将&203氧化成铬酸盐，如PetryandRappinZeitungfiirTierphysiologie(1970),vol.27,p.181-189.(Petry&Rapp1970;Z.Tierphysiol.27;181-189)所述，通过365nm处(分光光度计)消光(extinction)计算铬含量。根据下述公式，用标记方法评估消化性值(脂肪吸收系数；CFA):CFA(%)=100－「饲料中的％Cr2O3.粪便中的％脂肪.100]/[粪便中的％Cr203.饲料中的％脂肪]表l:酶补充对CFA(脂肪吸收系数)的影响<table><row><column>酶补充</column><column>0</column><column>低</column><column>中</column><column>高</column></row><row><column>无补充</column><column>29,2±7,6</column><column></column><column></column><column></column></row><row><column>疏棉状腐质霉脂肪酶变体(SEQIDNO:1)</column><column></column><column>51.1+/-9.8(155400FIPU)</column><column>57.3+/-7,1(388400FIPU)</column><column>73.0+/-1.9(1165510FIPU)</column></row><row><column>疏棉状腐质霉脂肪酶(SEQIDNO:2)</column><column></column><column>31.2+/-10.2(112000FIPU)</column><column>38.8+/-8.0(280000FIPU)</column><column>43.2+/-3.5(840000FIPU)</column></row><table>从表1的结果，显然SEQIDNO:1的脂肪酶比SEQIDNO:2的已知脂肪酶效果好得多。具体而言，SEQIDNO:1的脂肪酶与SEQIDNO:2的已知脂肪酶相比更有效地增加脂肪吸收的量。本发明的脂肪酶使脂肪消化性有非常强而且依赖于剂量的改进，在测试的较低剂量已经显示出高度有效的改进。实施例3:药物组合物(A)高强度小丸(high-strenghpellet)制备液体脂肪酶浓缩物，其包含大约59%具有SEQIDNO:1的氨基酸-5至269的脂肪酶，36%具有SEQIDNO:1的氨基酸1-269的脂肪酶，和5%具有SEQIDNO:1的氨基酸2-269的脂肪酶(通过N-末端测序确定，并用ESIMS(电喷射电离质i普学(ElectrosprayIonisationMassSpectrometry),如实施例5所述)确认)。如通过SDS-PAGE判断的，估计所述制备物是以蛋白质为基础大约92%纯，即SEQIDNO:1的三个变体的总量构成浓缩物中蛋白总量的大约92%。将液体浓缩物喷雾干燥。喷雾干燥粉末的测得的脂肪酶蛋白含量为52.6%。将1145g喷雾干燥的脂肪酶粉末与微晶纤维素(458g)和聚乙二醇4000(Macrogol4000;687g)在商业上可获得的混合器中干式预混在一起。加入异丙醇(460g;100%)并且将所得湿物质继续在室温完全混合。然后压机装有沖孔模(piercingdie)，该沖孔模的孔直径为0.8mm。在挤压时小珠温度(beadtemperature)不超过50°C。将产生的挤压物用商业上可获得的制粒机(spheronizer),通过加入必要量的异丙醇100%(87g)滚圆成球形小丸。在商业上可获得的真空干燥器(来自Voetsch)中，将小丸于大约40。C的产物温度干燥。产物温度不超过45。C。然后使用机械筛选机，用0.7和1.4mm筛网分离干燥的小丸。收集0.7mm和1.4mm的筛选级分，并且将每份200mg小丸的部分填入大小为2的胶嚢中。所得干燥小丸的脂肪酶浓度大约为26%(w/w)(B)较低强度小丸与上面(A)中提供的实例相似，如下制备具有较低含量的脂肪酶作为药物的小丸使用450g相同的喷雾干燥后的脂肪酶制备物、农i晶纤维素(1350g)、聚乙二醇4000(450g)、用于润湿的异丙醇(750g)和用于滚圆的异丙醇(119.5g)。所得干燥小丸的脂肪酶浓度为大约ll%(w/w)。通过应用实施例1中所述的脂肪酶恒-pH试验来测试从实例(A)和(B)所得的小丸的脂肪分解活性。相对于起始的粉状脂肪酶材料，每种情况下小丸中都不存在脂肪分解活性的损失。然后根据Pharm.Eur.2.9.1(Section"Disintegrationoftabletsandcapsules")测试从实例(A)和(B)所得的小丸的崩散性(测试溶液O.IM丙二酸，pH6.0-500mL，37°C)。来自实例(A)的小丸在4分钟内完成崩散，并且在15-60分钟时存在的活性为初始活性的99-101%。来自实例(B)的小丸在20分钟内完成崩散，并且在15-60分钟时存在的活性为初始活性的101-99%。结果显示，因为小丸不存在脂肪酶活性的损失，所以有可能将本发明的脂肪酶配制成小丸。(C)用Gelucire形成的小丸使用炫融制丸方法(meltpelletizingprocess)制备小丸，所述方法应在此进行筒述如下在大约65°C的温度，于热室中的烧杯中熔化262.5gGelucire44/14(Gattefoss6)和262.5gGelucire50/13(Gattefoss6)。在48。C向双层夹套(dual-jacket)的混合器中加入975g如上所述喷雾干燥的脂肪酶粉剂。然后，加入熔化的Gelucire,并且使用不同速度水平将化合物混合，最后进行冷却(熔融制丸)。实施例4:在胆汁盐存在下的活性如下在存在胆汁盐的条件下体外测定，与实施例2中所用相同的两种纯化脂肪酶(即本发明的SEQIDNO:1,和用来比较的SEQIDNO:2)的活性将胆汁盐(产品号B3301,来自Sigma-Aldrich)于pH6.5溶于0.1M緩冲液(bistris-HCL緩冲液)中以形成2mM溶液。将28mg橄榄油和18.8mg对硝基苯基棕榈酸盐(pNP-棕榈酸盐，或pNPP)(橄榄油pNPP摩尔比为2:1)作为底物，溶于100ml己烷中，将200微升所得溶液吸取至96孔微孔板(microtiterplate)的孔中。将微孔板置于通风拒下(leftunderhood),使己烷在大约25。C蒸发过夜，保留涂覆在孔内的橄榄油和pNPP。将脂肪酶稀释至0.01mg/ml。将前面提到的200微升胆汁盐溶液和20微升脂肪酶溶液加Tv/混合入脂质涂覆的微孔板中，并且温育60分钟。将不含酶的空白作为对照用于扣除。作为对硝基苯基(pNP)由底物经脂肪酶催化释放的结果产生黄色。测量在405nm的吸光度(八4()5),从而作为对样品的脂肪酶活性的量度。结果显示在下面表2中。按照三次重复测定的平均值并且减去不含酶的空白来计算表中的数字。表2<table><row><column>酶</column><column>A405</column></row><row><column></column><column>本发明的脂肪酶(SEQIDNO:1)</column><column>0.19+/-15%</column></row><row><column></column><column>比较的脂肪酶(SEQIDNO:2)n</column><column>0,07+/-22%</column></row><table>表2的结果显示本发明的脂肪酶在胆汁盐存在下与比较的脂肪酶相比更稳定。实施例5:纯化和表征将SEQIDNO:1的脂肪酶在米曲霉中表达并且从发酵培养液中纯化，如美国专利号5,869,438的实施例22和23所述。用SDS-PAGE分析多批纯化脂肪酶，并且将脂肪酶鉴定为34-40kDa的主要蛋白质条带。通过对考马斯染色的SDS-PAGE凝胶进行光密度计扫描，发现该条带构成蛋白质谱的92-97%。所述光密度计是来自BIO-RAD的GS-8000校准的光密度计。然而，通过对这一主要蛋白质条带的N-末端测序，鉴定了SEQIDNO:1中下述轻微差异的N-末端形式，以下按照其丰度(abundance)列出。用N-末端测序，通过比较Edman降解第一循环中不同形式的初始产率，来确定各种形式的量。也示出了样品中五种N-末端形式的产率#1SPIRREVSQDLF…(SEQIDNO:1的氨基酸-5-269)45-65%#2EVSQDLF…(SEQIDNO:1的氨基酸1-269)35-47%#3VSQDLF…(SEQIDNO:1的氨基酸2-269)<1%-16%#4PIRREVSQDLF…(SEQIDNO:1的氨基酸-4-269)<l0/o#5IRREVSQDLF…(SEQIDNO:1的氨基酸画3國269).<1%在所有批次中均存在两种主要形式#1和#2,在某些批次但不是所有批次中存在形式#3，而在某些批次中存在极少量的形式#4和#5(接近检出限或在;f全出限以下)。认为这些变体是由于内源的曲霉属宿主蛋白酶的切割而形成的。例如，弁2可由于KexB蛋白酶切割弁l而形成，#3可通过用KexB切割后再用氨基肽酶切割而形成，而#4和#5可通过氨基肽酶切割而形成。对基于N-末端测序的定量用ESIMS(电喷射电离质谱学)进行确认，结果显示匹配的质量强度(massintensity)。#1、#2和#3之间的差异导致不同的理论pl值，分别为5.45、5.11和5.23。因此，用正F(等电聚焦)，即在pH3-7的IEF凝胶上将这三种形式分离。通过对印迹的IEF凝胶进行N-末端测序来确认条带。因此IEF是4全测和定量SEQIDNO:1的形式#1、#2和#3的简单而快速的方法。发现SEQIDNO:1的形式#1和#2具有相同的比活性，单位为LU/mg酶蛋白。为了确定脂肪酶比活性，使用实施例1的LU-试验确定纯制备物的脂肪酶活性，单位为LU/ml。通过如下所述的氨基酸分析确定具体脂肪酶的蛋白质含量(mg酶蛋白/ml)，并将比活性(LU/mg)计算为(LU/ml)/AAA(mg/ml)。氨基酸分析(AAAV(mg/ml):脂肪酶样品的肽4建进行酸水解,然后在Biochrom20PlusAminoAcidAnalyser上根据制造商的说明分离和定量释放的氨基酸，所述仪器商业上可从Bie&BerntsenA/S，Sandbaekvej5-7，DK-2610Roedovre，Denmark获得。通过与茚三酮的反应确定每种单独氨基酸的量。各种脂肪酶批次的ESIMS数据也清楚地显示复杂的糖基化模式，其对应于高度的甘露糖糖基化，具有一系列由相应于一个己糖的分子量分隔的质量峰。SEQIDNO:1包括一个推定的N-糖基化位点(NIT),N为SEQIDNO:1的残基数33。在真菌表达宿主中，作为翻译后修饰的结果，N-乙酰葡糖胺残基将与NIT-序列中的N-残基连接，而许多甘露糖单体(从5至21)将依次附着于N-乙酰葡糖胺残基上。这导致单独的糖基化分子的分子量有很大不同。按照ESIMS的分子量在大约30-34kDa的范围内。无糖基化的#1和#2的理论分子量分别是30.2kDa和29.6kDa。这说明当在非糖基化宿主中表达时，SDS-PAGE凝胶上的主要条带将变窄，并对应于大约30kDa的分子量。即使在真菌宿主中表达，SEQIDNO:1的变体N33Q(保守取代)也不会被糖基化。SEQIDNO:1的非糖基化的N33Q变体在体内脂肪酶筛选测试中显示出与SEQIDNO:1近似的效能。实施例6:在蛋白酶存在下的体内稳定性和效能在蛋白酶存在下SEQIDNO:1的疏棉状腐质霉脂肪酶变体的稳定性和效能如下测试将实施例2中所述纯化的脂肪酶在体内试验中测试，如实施例2中通常所述，但是剂量根据胰腺FIP试验中估计的脂肪酶单位而定。消化性值(脂肪吸收系数；CFA)也如实施例2中所述来评估。将脂肪酶单独测试，并以不同剂量组合与蛋白酶组合测试。使用的蛋白酶是SEQIDNO:3的地衣芽孢杆菌蛋白酶。使用胰腺FIP试验确定蛋白酶活性(参见实施例1)。结果显示于下文的表3中，作为平均CFA(％)值给出，并示出标准偏差(sd)。表3<table><row><column>处理</column><column>脂肪酶剂量(胰腺FIP单位每餐)</column><column>蛋白酶剂量(胰腺FIP单位每餐)</column><column>CFA(%)</column><column>sd</column></row><row><column>未处理PEI(对照)</column><column>0</column><column>0</column><column>21.7</column><column>4.5</column></row><row><column>仅脂肪酶</column><column>107200</column><column>0</column><column>59.2</column><column>4.7</column></row><row><column>脂肪酶+蛋白酶</column><column>107200</column><column>1200</column><column>55.6</column><column>6.7</column></row><row><column>脂肪酶+蛋白酶</column><column>107200</column><column>2400</column><column>58.7</column><column>5.1</column></row><row><column>仅脂肪酶</column><column>780892</column><column>0</column><column>75.6</column><column>4.7</column></row><row><column>脂肪酶+蛋白酶</column><column>780892</column><column>9000</column><column>81.4</column><column>4.0</column></row><row><column>脂肪酶+蛋白酶</column><column>780892</column><column>18000</column><column>76.0</column><column>3.2</column></row><table>对于测试的两种脂肪酶剂量的每一种，不加蛋白酶和加入两种不同剂量的蛋白酶的结果之间没有明显差别。因此可以得出结论，蛋白酶对脂肪酶在体内没有反作用。实施例7:在消化性蛋白酶存在下的稳定性在主要的消化性蛋白酶中的一种存在下并且在生理上相关的pH,如下所述测定本发明的纯化的脂肪酶在体外的稳定性，与SEQIDNO:2的已知脂肪酶相比專支。将稳定性作为在pH3.0用猪胃蛋白酶处理后的残余活性来测定。用75吗/ml猪胃蛋白酶、2mM氯化钙、0.01%TritonX-100的25mM柠檬酸盐緩冲液溶液，pH3.0(最终处理条件)处理每个脂肪酶样品。将一份每种稀释样品(稀释剂=10mMNaCl,0.01%TritonX-100)加入一份处理溶液，并通过向一份稀释剂中加入一份稀释的样品得到未处理的样品(对照)。将所有处理和未处理样品在环境温度(20-25。C)温育3小时，然后测定残余活性。活性试验使用1mM4-硝基苯基棕榈酸盐为底物和1.2%TritonX-IOO、4mM氯化钩的100mMTRIS緩沖液(pH8.0)溶液来进行。对于处理的样品进行如下的试验将10份底物加入1份处理后的样品和1份稀释剂(0.01%TritonX-IOO，10mMNaCl)。对于未处理样品，将10份底物加入1份样品的稀释剂溶液和1份pH3.0处理溶液。读取405nm的OD，并作为样品的脂肪酶活性的量度。将所得残余活性的百分比(﹪RA)计算为相对于未处理样品的试验结果的处理后样品的试验结果。结果示于下面表4中。C.V.表示变化系数，而n表示重复次数。表4<table><row><column>酵</column><column>残余活性％</column><column>﹪C.V.</column><column>n</column></row><row><column>本发明的脂肪酶(SEQIDNO:1)</column><column>9.7</column><column>40.0</column><column>13</column></row><row><column>比较的脂肪酶(SEQIDNO:2)</column><column>2.3</column><column>20.7</column><column>8</column></row><table>表4显示本发明的脂肪酶在pH3.0和猪胃蛋白酶存在下与已知脂肪酶相比更稳定。权利要求1.用作药物的脂肪酶，其中所述脂肪酶与SEQIDNO1的氨基酸1-269具有至少90％同一性，条件是所述脂肪酶不是SEQIDNO2的氨基酸1-269。2.权利要求1的脂肪酶，其中a)所述脂肪酶包含SEQIDNO:1的氨基酸1-269,或b)所述脂肪酶是SEQIDNO:1的氨基酸1-269的变体，其中所述变体与SEQIDNO:1的氨基酸1-269的差异不多于25个氨基酸，并且其中(i)和SEQIDNO:1的氨基酸1-269比较，所述变体包含一个或多个氨基酸的保守取代和/或插入中的至少一种；和/或(ii)和SEQIDNO:1的氨基酸1-269比较，所述变体包含至少一个小缺失；和/或(iii)和SEQIDNO:1的氨基酸1-269比较，所述变体包含至少一个小的N-或C-末端延伸；和/或(iv)所述变体是具有SEQIDNO:2的氨基酸1-269的脂肪酶的等位变体；和/或(v)所述变体是具有SEQIDNO:1的氨基酸1-269的脂肪酶的片段。3.权利要求l-2任一项的脂肪酶，与蛋白酶或淀粉酶组合，用作药物。4.权利要求l-2任一项的脂肪酶，与蛋白酶和淀粉酶组合，用作药物。5.根据权利要求3或4的与蛋白酶和/或淀粉酶组合的脂肪酶，其中(i)所述蛋白酶与选自下组的蛋白酶具有至少70%同一性a)具有SEQIDNO:3的氨基酸1-274的蛋白酶，b)具有SEQIDNO:4的氨基酸1-188的蛋白酶，和c)具有SEQIDNO:5的氨基酸1-188的蛋白酶；(ii)所述淀粉酶与选自下组的淀粉酶具有至少70%同一性a)具有SEQIDNO:6的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO:7的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO:8的氨基酸1-483的淀粉酶。6.根据权利要求3或4的与蛋白酶和/或淀粉酶组合的脂肪酶，其中(i)所述脂肪酶包含SEQIDNO:1的氨基酸2-269;(ii)所述蛋白酶是选自下组的蛋白酶a)具有SEQIDNO:3的氨基酸1-274的蛋白酶，b)具有SEQIDNO:4的氨基酸1-188的蛋白酶，和c)具有SEQIDNO:5的氨基S交1-188的蛋白酶；(iii)淀粉酶是选自下组的淀粉酶a)包含SEQIDNO:6的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO:7的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO:8的氨基酸1-483的淀粉酶。7.权利要求l-2任一项中定义的脂肪酶或脂肪酶混合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗消化性病症、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、嚢性纤维化、I型糖尿病，和/或II型糖尿病。8.权利要求7的用途，还包含蛋白酶或淀粉酶的用途。9.权利要求7的用途，还包含蛋白酶和淀粉酶的用途。10.权利要求8或9的用途，其中蛋白酶和/或淀粉酶如权利要求5或6所定义。11.药物组合物，其包含权利要求l-2任一项所定义的脂肪酶或脂肪酶混合物，连同至少一种可药用的辅助材料。12.权利要求11的组合物，其还包含蛋白酶或淀粉酶。13.权利要求11的组合物，其还包含蛋白酶和淀粉酶。14.权利要求12或13的组合物，其中所述蛋白酶和/或淀粉酶如权利要求5或6所定义。15.用于治疗消化性病症、胰腺外分泌机能不全、胰腺炎、嚢性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的方法，所述方法通过施用治疗上有效量的权利要求l-2任一项中所定义的脂肪酶或脂肪酶混合物。16.权利要求15的方法，其还包括施用治疗上有效量的蛋白酶或淀粉酶。17.权利要求15的方法，其还包括施用治疗上有效量的蛋白酶和淀粉酶。18.权利要求16或17的方法，其中所述蛋白酶和/或淀粉酶如权利要求5或6所定义。全文摘要脂肪酶的药物用途涉及疏棉状嗜热丝孢菌(疏棉状腐质霉)脂肪酶的变体，所述变体包含SEQIDNO1的氨基酸1-269，任选地与蛋白酶和/或淀粉酶组合。医学适应症的实例是处理消化性病症、胰腺外分泌机能不全(PEI)、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病，和/或II型糖尿病。本发明的脂肪酶在体内具有改进的效能，对蛋白酶降解稳定，和/或在胆汁盐存在下稳定。文档编号C12N9/18GK101208429SQ200680022801公开日2008年6月25日申请日期2006年6月16日优先权日2005年6月24日发明者彼得·C·格雷戈里,艾伦·斯文德森,金·博尔奇申请人:诺维信公司;索尔维医药有限责任公司