专利名称：一种ShRNA的克隆方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种ShRNA的克隆方法。
背景技术：
小干扰核糖核酸(siRNA)具有基因沉默作用，发夹状核糖核酸(ShRNA)是siRNA的一种。有研究显示，无论是根据微小核糖核酸(miRNA)设计的ShRNA，或基于siRNA的ShRNA在体内都表现出有效地基因抑制作用，效果较别的siRNA方法更好。
ShRNA的常规制备方法主要有两种体外转录合成ShRNAs法和编码ShRNA的转录DNAs法。
体外转录合成ShRNAs法，是按照生命合成RNA过程的原理，用转录方法来合成ShRNAs，其ShRNA最接近生命自然状态中的dsRNA，RNA干扰效果也最好。较化学合成而言，体外转录制备ShRNA的优势在于成本低、质量高、毒性小和稳定性均较好。转录ShRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成ShRNAs较高浓度得到的效果；而且，直接使用dsRNA易转染，非常有效，使用范围也较广。但是，由于在哺乳动物中不存在RNAi的扩增机制，导入RNA产生的RNAi作用不可避免的具有瞬时性。为了克服这个弱点，现已发展了基于DNA载体在体内表达siRNA的技术，即编码ShRNA的转录DNAs法。
传统的ShRNA克隆方法，是将载体用限制性内切酶双酶切得到线性化的载体；需要同时合成两种序列不完全相同的寡核苷酸片段，这两种寡核苷酸片段在退火后形成双链DNA片段；载体和双链DNA片段通过T4 DNA连接酶连接，得到环型的DNA分子。最后将连接得到的DNA分子转化细菌，通过筛选得到正确的基因克隆。
发明内容
本发明的目的之一在于对传统的ShRNA克隆方法进行改进，从而提供一种新型的ShRNA克隆方法。
本发明的另一个目的在于，提供一种用于所述ShRNA克隆的载体。
本发明的ShRNA克隆方法包括制备合适的载体，将载体和双链DNA片段连接得到环形的DNA分子，其特征在于
只合成一种寡核苷酸片段，该寡核苷酸片段由回文结构部分和突出部分两部分组成，两条所述寡核苷酸片断在退火后能够通过回文结构互补配对而形成双链DNA片段；所述载体的两端具有碱基序列相同的突出端，且同为5’端或3’端的突出端；所述寡核苷酸片段突出部分的碱基序列与所述载体的突出端碱基序列互补配对。
根据本发明，所述载体的突出端长度为1-5个碱基，所述碱基包括A、T/U、C、G(T和U在突出碱基中视为地位等同)。
根据本发明，所述寡核苷酸片断的突出部分的长度为1-5个碱基，所述碱基包括A、T/U、C、G(T和U在突出碱基中视为地位等同)。
根据本发明，最后还包括将连接得到的DNA分子转化细菌，通过筛选得到正确的基因克隆。
本发明的用于ShRNA克隆的载体，其两端具有碱基序列相同的突出端，且同为5’端或3’端的突出端。
根据本发明，所述突出端长度为1-5个碱基，所述碱基包括A、T/U、C、G(T和U在突出碱基中视为地位等同)。
利用本发明提供的载体以及ShRNA克隆方法，只需合成一种寡核苷酸片段(该寡核苷酸片段由回文结构部分和突出部分两部分组成，两条所述寡核苷酸片断在退火后能够通过回文结构互补配对而形成双链DNA片段)，便可以方便、迅速地实现ShRNA克隆，不仅简化了操作，而且成功率高。
具体实施例方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验室手册》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。
实施例1、sip53的ShRNA克隆在本实施例中，突出部分在载体的5’端。
1.1、载体片段制备取pSilencerTM2.0-U6载体(购自Ambion公司)10μg，于37℃，BamH I酶切20小时；取酶切后产物，1％琼脂糖凝胶电泳，检测并回收长度约为3100bp的pSilencerTM2.0-U6载体片段。
将收获的pSilencerTM2.0-U6载体片段进行修饰加工，具体修饰方法如下反应体系载体2μg，dGTP(2.5mM)和dATP(2.5mM)各1μl，10×PCR Buffer 5μl，Taq酶2U，加水至体积为50μl。
反应条件72℃，反应2小时。
将修饰反应后产物，1％琼脂糖凝胶电泳，检测并回收pSilencerTM2.0-U6修饰载体片段。
由于，在BamH I酶切后，载体3’末端形成GATC-3’(下划线部分为突出端)四个未配对的碱基，由于反应体系中添加有dGTP和dATP，因此在经过上述修饰后，C和T配对加上了G和A，故载体的5’端形成的突出碱基部分为AG。
1.2、制备sip53双链DNA片段1.2.1、设计对humanP53基因有效的寡核苷酸片段sip53设计sip53片段，其序列如下sip535’-TCGACTCCAGTGGTAATCTACAACTCGAGTTGTAGATTACCACTGGAGTC-3’；其中，sip53中48个标识有下划线的DNA序列是回文结构，在退火时可以相互配对，形成双链DNA片段；无下划线标识的碱基TC为5’端的突出部分。
1.2.2、sip53片段退火，形成sip53双链DNA片段取sip53片段，进行退火反应，收获sip53双链DNA片段，具体反应条件如下反应体系sip53(100μM)2μl，10×退火Buffer5μl，加水至体积为50μl。
其中，10×退火Buffer配方如下500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，500mM NaCl，1mg/ml BSA，pH7.5。
反应条件94℃ 5min；37℃ 2小时。
1.3、双链DNA片段与载体片段连接并转化DH10B菌株取退火后收获的双链DNA片段与载体片段连接，具体反应条件如下反应体系pSilencerTM2.0-U6修饰载体片段100ng，sip53退火产物2μl，10×T4连接酶Buffer1μl，T4连接酶200U，加水至体积为10μl。
其中，T4连接酶Buffer和T4连接酶均购自Promega公司。
反应条件16℃，反应20小时。
反应完毕后，取3μl融合反应的产物，转化DH10B菌株(购自Invitrogen公司)，得到约100个转化子。
1.4、DH10B菌株培养任意挑取3个克隆，接种到TB培养基(Amp+)，37℃，250rpm，培养20小时。
1.5、质粒纯化及测序参考操作手册，用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒，纯化质粒。
将纯化获得的质粒进行测序，测序结果显示，收获了sip53序列完全正确的克隆。
实施例 2、siPFTK1的ShRNA克隆方法在本实施例中，突出部分在载体3’端。
2.1、载体片段制备采用实施例1.1的体系和及其条件，BamH I酶切pSilencerTM2.0-U6载体，获得载体线性片段。
将收获的pSilencerTM2.0-U6载体片段进行修饰加工，具体反应条件如下反应体系pSilencerTM2.0-U6载体2μg，dNTP(10mM)各1μl，10×PCR Buffer5μl，Taq酶2U，加水至体积为50μl。
反应条件72℃，反应2小时。
将修饰反应后的产物，1％琼脂糖凝胶电泳，检测并回收pSilencerTM2.0-U6修饰载体片段。
由于，在BamH I酶切后，载体末端形成GATC-3’(下划线部分为突出端)，进行修饰、补平末端后，由于Taq酶自身的特性，会在载体的3’末端加上了碱基A，所以载体的3’端形成的突出碱基部分为A。
2.2、制备siPFTK1双链DNA片段2.2.1、设计对human PFTK1基因有效的寡核苷酸片段siPFTK1设计siPFTK1片段，其序列如下siPFTK 15’-AAGCATGGAATAAGCTCAGCTCTCGAGAGCTGAGCTTATTCCATGCTTT-3’；其中，siPFTK1中的48个标识有下划线的DNA序列是回文结构，在退火时可以互相配对形成双链DNA片段；无下划线标识的碱基T为3’端突出部分。
2.2.2、siPFTK1片段退火，形成siPFTK1双链DNA片段取siPFTK1片段，按实施例1.2.2的反应体系与反应条件，进行退火反应，收获siPFTK1双链DNA片段。
2.3、双链DNA片段与载体片段连接并转化DH10B菌株采用实施例1.3的连接条件，将退火后收获的siPFTK1双链DNA片段2μl与pSilencerTM2.0-U6修饰载体片段100ng，在实施例1.3连接体系中进行连接，获得融合反应产物。
取3μl融合反应的产物，转化DH10B菌株，得到约100个转化子。
2.4、DH10B菌株培养任意挑取3个克隆，接种到TB培养基(Amp+)，37℃，250rpm，培养20小时。
2.5、质粒纯化及测序参考操作手册，用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒，纯化质粒。
将纯化获得的质粒进行测序，测序结果显示，收获了siPFTK1序列完全正确的克隆。
实施例3、siTSSK1的ShRNA克隆方法在本实施例中，突出部分在载体3’端。
3.1、载体片段制备委托上海德聚生物技术有限公司(中国上海市宜山路705号B座5楼)，对pSilencerTM2.0-U6载体进行改造，得到线性载体，改造过程具体如下1、HindIII和BamH I双酶切，去除pSilencerTM2.0-U6载体酶切位点HindIII(399)和BamH I(461)之间的DNA序列，载体其余部分不变；2、对酶切位点HindIII(399)和BamH I(461)之间区域进行修饰，使之变为如下形式的线性载体；其中，带下划线的DNA序列为修饰后加入的部分，载体的3’端的突出碱基部分为A。
361 TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA GCTTTTCCAAAAAGGGTCAG TGCTGCAACA TTTTGCTGCC GGTCACGGTT CGAAAAGGTT411AAAATTT461GGGATCCCGCG TCCTTTCCAC AAGATATATA AACCCAAGAA ATCGAAATACACCCTAGG6CGC AGGAAAGGTG TTCTATATAT TTGGGTTCTT TAGCTTTATG511 TTTCAAGTTA CGGTAAGCAT ATGATAGTCCAAAGTTCAAT GCCATTCGTA TACTATCAGG
3.2、制备siTSSK1双链DNA片段3.2.1、设计对human TSSK1基因有效的寡核苷酸片段siTSSK1设计siTSSK1片段，其序列如下siTSSK15’-GTCGAATGGCATTAAGCAATTCTCGAGAATTGCTTAATGCCATTCGACT-3’；其中，siTSSK1中的48个标识有下划线的DNA序列是回文结构，在退火时可以互相配对形成双链DNA片段；无下划线标识的碱基T为3’端突出部分。
3.2.2、siTSSK1片段退火，形成siTSSK1双链DNA片段取siTSSK1片段，按实施例1.2.2的反应体系与反应条件，进行退火反应，收获siTSSK1双链DNA片段。
3.3、双链DNA片段与载体片段连接并转化DH10B菌株采用实施例1.3的连接条件，将退火后收获的siTSSK1双链DNA片段2μl与pSilencerTM2.0-U6修饰载体片段100ng，在实施例1.3连接体系中进行连接，获得融合反应产物。
取3μl融合反应的产物，转化DH10B菌株(购自Invitrogen公司)，得到约100个化子。
3.4、DH10B菌株培养任意挑取3个克隆，接种到TB培养基(Amp+)，37℃，250rpm，培养20小时。
3.5、质粒纯化及测序参考操作手册，用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒，纯化质粒。
将纯化获得的质粒进行测序，测序结果显示，收获了siTSSK1序列完全正确的克隆。
实施例4、siP21的ShRNA克隆方法在本实施例中，突出部分在载体3’端。
4.1、载体片段制备委托上海德聚生物技术有限公司(中国上海市宜山路705号B座5楼)，对pSilencerTM2.0-U6载体进行改造，得到线性载体，修饰改造后，获得的载体的3’端突出部分碱基为AAAAA。具体改造过程，步骤同实施例3.1。
对酶切位点Hind III(399)和BamH I(461)之间区域进行修饰后，变为如下形式的线性载体361 TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA GCTTTTCCAAAAAGGGTCAG TGCTGCAACA TTTTGCTGCC GGTCACGGTT CGAAAAGGT411AAAA461 CCCGCG TCCTTTCCAC AAGATATATA AACCCAAGAA ATCGAAATACAAAAAGGGCGC AGGAAAGGTG TTCTATATAT TTGGGTTCTT TAGCTTTATG511 TTTCAAGTTA CGGTAAGCAT ATGATAGTCCAAAGTTCAAT GCCATTCGTA TACTATCAGG4.2、制备siP21双链DNA片段4.2.1、设计对human P21基因有效的寡核苷酸片段siP21设计siP21片段，其序列如下siP215’-AACTTCGACTTTGTCACCGAGCTCGAGCTCGGTGACAAAGTCGAAGTTTTTTT-3’其中，siP21中的48个标识有下划线的DNA序列是回文结构，在退火时可以互相配对形成双链DNA片段；无下划线标识的碱基TTTTT为3’端突出部分。
4.2.2、siP21片段退火，形成siP21双链DNA片段取siP21片段，按实施例1.2.2的反应体系与反应条件，进行退火反应，收获siP21双链DNA片段。
4.3、双链DNA片段与载体片段连接并转化DH10B菌株采用实施例1.3的连接条件，将退火后收获的siP21双链DNA片段2μl与pSilencerTM2.0-U6修饰载体片段100ng，在实施例1.3连接体系中进行连接，获得融合反应产物。
取3μl融合反应的产物，转化DH10B菌株，得到约100个转化子。
4.4、DH10B菌株培养任意挑取3个克隆，接种到TB培养基(Amp+)，37℃，250rpm，培养20小时。
4.5、质粒纯化及测序参考操作手册，用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒，纯化质粒。
将纯化获得的质粒进行测序，测序结果显示，收获了siP21序列完全正确的克隆。
权利要求
1.一种ShRNA的克隆方法，包括制备合适的载体，将载体和双链DNA片段连接得到环形的DNA分子，其特征在于只合成一种寡核苷酸片段，该寡核苷酸片段由回文结构部分和突出部分两部分组成，两条所述寡核苷酸片断在退火后能够通过回文结构互补配对而形成双链DNA片段；所述载体的两端具有碱基序列相同的突出端，且同为5’端或3’端的突出端；所述寡核苷酸片段突出部分的碱基序列与所述载体的突出端碱基序列互补配对。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体的突出端长度为1-5个碱基。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述碱基包括A、T/U、C、G。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸片断的突出部分的长度为1-5个碱基。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述碱基包括A、T/U、C、G。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，还包括将连接得到的DNA分子转化细菌，通过筛选得到正确的基因克隆的步骤。
7.一种用于ShRNA克隆的载体，其特征在于，所述载体的两端具有碱基序列相同的突出端，且同为5’端或3’端的突出端。
8.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述突出端的长度为1-5个碱基。
9.如权利要求8所述的载体，其特征在于，所述碱基包括A、T/U、C、G。
全文摘要
本发明提供了一种ShRNA的克隆方法和一种用于ShRNA克隆的载体。所述的克隆方法包括制备合适的载体，将载体和双链DNA片段连接得到环形的DNA分子，将连接得到的DNA分子转化细菌，通过筛选得到正确的基因克隆等步骤；所述的载体两端具有碱基序列相同的且同为5’端或3’端的突出端，同时，所述的寡核苷酸两端也具有碱基序列相同的且同为5’端或3’端的突出端，且所述载体的突出端碱基序列与所述寡核苷酸片段突出部分的碱基序列互补配对。利用本发明提供的载体以及ShRNA克隆方法，只需合成一种寡核苷酸片段，便可以方便、迅速地实现ShRNA克隆，不仅简化了操作，而且成功率高。
文档编号C12N15/63GK101024830SQ20071000686
公开日2007年8月29日 申请日期2007年2月1日 优先权日2007年2月1日
发明者邱文英 申请人:王鸿艳